人脯氨肽酶活性中心结构的计算机模拟_郭崇志

ISSN 1007-7626CN 11-3870P Q
中国生物化学与分子生物学报
Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2002年8月18(4):499~505
人脯氨肽酶活性中心结构的计算机模拟
郭崇志1)
, 宣振宇2)
, 陈润生2)
, 孙曼霁
1)*
(1)军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850;2)中国科学院生物物理研究所,北京 100101)
摘要 氨酰基脯氨酸二肽酶(脯氨肽酶)为广泛分布于生物界的细胞内二肽水解酶.它特异性地水解以脯氨酸或羟脯氨酸为羧基端的二肽(X -Pro),而且只对反式肽键有催化活性.此酶与脯氨酸代谢、胶原蛋白合成及细胞生长有密切关系.文献报道,从Alteromonas 细菌中提取的脯氨肽酶有水解梭曼的活性,其有机磷酸酐水解酶也有脯氨肽酶活性.用重组基因表达的人肝脯氨肽酶也同时具有脯氨肽酶活性和水解梭曼的活性.研究脯氨肽酶活性中心的结构具有重要理论意义和潜在实用价值.但目前尚无人脯氨肽酶晶体结构的报道.本文采用蛋白质结构模式识别(threading )方法对脯氨肽酶的高级结构进行模拟,以大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶(1MAT)为模板,模建了人脯氨肽酶C 端结构域的空间结构.通过对模建结构的3D 评估及电荷分布分析,对人脯氨肽酶活力中心结构进行了预测.模建的人脯氨肽酶活性中心位于C 端结构域,为6条B 折叠围成的一个疏水性口袋,外面被5条A 螺旋及一些loop 包围,活力中心位于疏水结构中央,其中有5个保守氨基酸,形成1个较强的负电荷区,周围有3个较弱的正电荷区域.实验还发现,虽然Mn 2+
或Co 2+
对酶的活性极其重要,但对酶蛋白结构的贡献很小.提示它们可能是在催化反应的电荷转移过程中发挥着重要作用.关键词 脯氨肽酶,计算机模拟,活性中心结构模式识别收稿日期:2001-09-04,接受日期:2001-12-21军队医学科学/九五0基金资助项目(NO.96-z -016)
*
联系人 Tel:(010)66930691,E -mail:sunmj@
郭崇志,男,1973年6月生,博士
Received:Septe mber 4,2001;Accepted:December 21,2001
Supported by /the Ninth Five -year Plan 0Foundation of The Military Medical Sciences,No.96-z -016
*
Corresponding author Tel:(010)66930691,E -mail:sunmj@
中图分类号 Q33
Computer Modeling of the Three -dimensional S tructure of
the Active Site of Human Prolidase
GUO Chong -zhi 1),XUAN Zhen -yu 2),C HEN Run -sheng 2),SUN Man -ji
1)*
(1)Institute o f Pharmacology and Toxic ology ,Ac ade my o f Military Me dical Sciences ,Be ijing 100850,China ;
2)
Inst itute o f Biophysics ,Chinese Acade my o f Sciences ,Bei jing 100101,China )
Abstract Prolidase is a wide -spread intracellular dipeptidase which specifically cleaves the dipeptide bearing
a carboxyl terminus of proline or hydroxyproline and only shows enzymatic activity to trans -peptide bond.Prol-i dase plays an important role in the proline metabolism,collagen synthesis and cell growth.It was reported re -cently that prolidase extracted from Alteromonas bacteria could hydrolyze soman,the organophosphorus acid anhydrolase from this bacteria showed prolidase activity,and the recombinant human liver prolidase also shows the activities mentioned above.So it was important from both practical and theoretical point of view to study the active site structure of prolidase.The computer modeling of the three -dimensional structure of prolidase was carried out by means of threading,since the crystal structure of prolidase has not been reported up to now.The three dimensional structure of C -terminal domain was modeled with methionine amino -peptidase (1MAT)from E .coli as template.The active site structure of human prolidase was predicted by profile -3D evaluation and charge distribution analysis.The ac tive site of the modeled structure of human prolidase locates a t the C -term-i
nal domain,forms a hydrophobic pocket by six B-sheets surrounding by five A-helixes and some loops outside. The active site sits in the middle of the hydrophobic struc ture that c ontains five conserved amino acids to form a relatively strong negative charge region surrounded by three positive charge regions.It was found that Mn2+ and Co2+was critically important to the enzyme activity,but contributed little to the protein structure,suggest-ing that they might presumably play a role in the charge transfer of the catalytic reaction.
Key words prolidase,computer modeling,threading
脯氨肽酶(prolidase,X-Pro dipeptidase,EC3.4.
13.9)是1937年在猪的小肠粘膜层中首次发现的一种细胞内二肽水解酶[1],随后被证明其广泛分布在生物界的其它种属,包括原核细胞[2]及真核细胞中[3].在人体的各个组织中也能检测到脯氨肽酶的存在[4].天然状态的人脯氨肽酶是由相同的亚基构成的同型二聚体,两个亚基之间没有共价结合.单体分子量约55kD,是由492个氨基酸组成的单一肽链[5],N端的Ala发生乙酰化.它具有很高的底物专一性,特异性地水解羧基端为脯氨酸或羟脯氨酸的二肽(X-Pro),且只水解L-型氨基酸构成的反式(trans-)肽键[6].它的主要功能与脯氨酸代谢循环、胶原蛋白合成及细胞生长有密切的关系[7].Mn2+、Co2+等二价阳离子可明显增强脯氨肽酶的活性[8,9]. EDTA、柠檬酸盐、Hg2+、碘乙酰胺等对酶活性产生抑制作用.预加Mn2+或在酶的活性被抑制后加入Mn2+可以保护酶活性或恢复酶活性,但金属离子在酶的活性中的确切作用尚不十分明确.
Alteromonas中纯化得到的有机磷酸酐水解酶有脯氨肽酶活性[10],它的天然底物是以脯氨酸为羧基端的二肽.Alteromonas来源的脯氨肽酶也能水解G 类毒剂[11].重组基因表达的人肝脯氨肽酶,也同时具有脯氨肽酶活性和水解梭曼的活性[12].
目前还没有得到可进行X衍射结构分析的脯氨肽酶晶体.因此对脯氨肽酶的高级结构的认识主要来源于各种结构预测.目前应用的最多也是最成熟的结构预测方法是同源蛋白质的模建(homology modelling).其理论基础是一级序列决定三维结构,序列同源性高的蛋白质其三维结构也应该相似.但在将人脯氨肽酶序列与PDB库中的蛋白质序列进行相似性检索时,并没有发现满足同源模建条件(序列相似性大于30%)的同源蛋白质结构.因此我们尝试用蛋白质结构模式识别(threading)方法构建人脯氨肽酶的高级结构.蛋白质结构模式识别的原理是把未知空间结构的蛋白质的氨基酸序列和已知空间结构的蛋白质进行匹配,找出一种或几种匹配最好的结构作为未知蛋白质的预测结构.这个方法的前提是假设蛋白质折叠类型是有限的.虽然蛋白质的序列繁多,但按其三维拓扑结构,可归属于约500 ~700个不同的折叠类型[13,14],在每一类型中,各成员蛋白质的序列之间可以很相似,也可以不相似,但它们具有相似的蛋白质折叠核心.
1材料和方法
所有的模建都在SGI OC TANE图形工作站上进行,使用MSI公司的分子模拟软件包InsightÒ9810,主要模块有BI OPOLYMER,DISCOVER等.
111人脯氨肽酶氨基酸序列分析
1989年Endo等[5]报道了人脯氨肽酶的氨基酸全序列,共492个氨基酸残基.(1)我们在网上用美国加州大学洛杉矶分校的蛋白质结构预测服务器将序列进行预测分析,看到人脯氨肽酶的C端与已知结构的甲硫氨酸氨肽酶(methionine aminopeptidase,MAP,EC3.4.11.18)有相似的折叠方式,预测的Z值(Z=4173)符合进行结构模建的条件[15].(2)用ClustalW软件[17]对来源于不同种属的脯氨肽酶进行多序列比较,发现不同种属脯氨肽酶之间有很高的序列相似性,而且C端的保守性明显高于N端(Fig11).(3)文献报道脯氨肽酶的C端与甲硫氨酸氨肽酶及肌酸水解酶催化结构域具有相似的折叠方式,脯氨肽酶的活性中心可能位于蛋白质的C端[16].因此,我们以甲硫氨酸氨肽酶结构为模板进行人脯氨肽酶C端的高级结构的计算机结构模建.模建的结构中将包括脯氨肽酶的活力中心部分.
112序列保守区的确定
要进行结构模建,首先必须确定拟模建序列与模板之间的序列对应关系,找到对应的结构保守区(SCR),以便进行相应氨基酸的替换.根据从加州大学服务器上预测的结果,选择来源于大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶(PDB库中命名为1MAT[18])作为结构模建的模板,对比观察两个序列的对准结果.为了保证所建模型的可靠性,我们对序列对准结果做了以下两个限制:(1)保守残基对齐;(2)二级结构分布一致.为了确定甲硫氨酸氨肽酶的结构保守区,将1MAT与另一个来源于Pyrococcus f uriosus的甲硫氨
500中国生物化学与分子生物学报18卷
酸氨肽酶的晶体结构(1XGS [19]
)用ASC A 软件进行
蛋白质三级结构的相似性比较,确定了结构保守区.而后以1MAT 为模板进行人脯氨肽酶C 端活性区域
的结构模拟.
113 人脯氨肽酶C 端的结构模建
以大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶(MAP)的三维结构(1MAT.PDB)为模板,在Insight Ò软件包的BI OPOLYMER 模块下根据序列对准结果进行人脯氨肽酶序列氨基酸残基的替换.以Fig 12中MAT 序列为参照系,人脯氨肽酶的gap 两侧的氨基酸均以肽键直接相连,其插入片段则依人脯氨肽酶的预测的二级结构插入,而其余氨基酸残基则按直链方式连接.替换结束后对由于插入或删除部分而造成的不合理肽键进行调整,使相应肽键的长度和角度趋于合理,得到模建的初始结构.在Insight Ò软件包的DISC OVER 模块下先用最陡下降法在CVFF(consis -ten-t valence forcefield)力场下进行结构松弛计算,接着采用共轭梯度法进行结构优化,消除模建结构中存在的明显不合理的键长和键角.为了克服分子中存在的局部势垒,我们采用模拟退火和分子动力学模拟对结构进一步优化,即固定模板上已知的二级结构保守肽段(AA8-28:H ,AA38-50:H,AA91-101:E,AA105-115:E,AA119-139:H,AA146-158:H,AA169-172:E,AA198-208:E,AA232-241:E.H 表示A 螺旋;E 表示B 折叠,数字表示1MAT 中的氨基酸位置),通过程序升温,对能量极小构象进行高温分子动力学模拟,克服柔性蛋白分子中存在的各种能垒,以获得能量相对极小的构象.而后退火到较低温度,再进行分子动力学模拟,直至到常温下.首先使体系逐步升温到3000K,此时蛋白质结构中的二级结构
A 螺旋及
B 折叠仍然保持,而其它的loop 及转角等结构都已消失.在此温度下进行10000ps 的动力学模拟.而后逐步降温,开始时降温的幅度大些,随着温度不断接近常温,要逐渐减少每次改变的温差.在每个温度下均进行10000ps 的分子动力学计算,对体系的能量进行优化.最后对体系温度降至300K 时得到的结构再分别进行最陡下降法和共扼梯度法的分子力学能量最优化计算至收敛.最终的结果就是我们模建得到的人脯氨肽酶的
C 端的结构模型.用Profile -3D
[20]
检验模建结构的合理性.
2 结果
211 不同种属脯氨肽酶序列同源性
对检索到的不同种属来源的脯氨肽酶进行多序列比较,使用的软件是Clustalw1174,所有的参数均采用程序的默认值.结果表明,不同种属的脯氨肽酶具有较高的序列相似性,C 端残基保守性明显高于N 端(Fig 11).与文献报道脯氨肽酶的活性中心可能位于C 端
[16]
是一致的.酶活性中心的关键氨基酸可
能就位于这些保守氨基酸残基上.
人脯氨肽酶序列检索时发现在脯氨酸相关的蛋白质中存在一段非常保守的具有明显信号作用的基序(motif)(Fig 11),其结构为HG(L,I,V,M)(S,G)Hx -LG(L,I,V,M)xVHD,含3个保守的His 残基,x 代表任何一种氨基酸.这个基序在不同种属的脯氨肽酶多序列比较中也观察到(Fig 11).这些氨基酸残基可能与酶的特异性有关.
从加州大学结构预测服务器上返回的结果表明,人脯氨肽酶的C 端可能与甲硫氨酸氨肽酶及肌酸水解酶催化亚基具有相似的折叠方式.考虑到金
501第4期郭崇志等:人脯氨肽酶活性中心结构的计算机模拟
Fig.1M ult-i sequence ali gnment of proli dase from vari ous s pecies(Clustalw1.74)
--:gap;Gray letters:conserved a mino acids;Underlines:conserved amino acids in the acti ve center;Box:motif
1.Homo sapiens;
2.Mus musculus;
3.Suberite s domunc ula;
4.E.coli;
5.Alte romonas halo planktis;
ctobac illus de lb rue ckii;
7.L ac-tobacillus delbrueckii subsp.L actis;
ctobacillus helve tic us;
9.Pyrococcus fruiosus
属离子对酶活性的重要性,在模建中选择同样具有金属离子依赖性的甲硫氨酸氨肽酶作为模板,同时参考肌酸水解酶的结构,进行人脯氨肽酶C端结构域的模建.
212人脯氨肽酶与不同种属的甲硫氨酸氨肽酶的多序列比较
用ASC A软件对已知晶体结构的两个甲硫氨酸氨肽酶1MAT与1XGS做空间结构相似性比较,确定甲硫氨酸氨肽酶的结构保守区.将人脯氨肽酶序列加入这一序列对准结果中,再进行一次序列比较,得到了人脯氨肽酶与1MAT的序列对应关系(Fig12).序列对准结果中避免二级结构中产生插入片段,并使SCR区对应的二级结构与人脯氨肽酶氨基酸序列的二级结构预测结果一致.
502中国生物化学与分子生物学报18卷
Fig.2Sequence alignment of human prolidase and methionine amino-peptidas e(1MAT)
Amino acids are denoted in si ngle letters;SCRs ali gned by A-heli xes or B-s heets are s hown in boxes; --:gap;Underlines:conserved a mino acids in the active center
甲硫氨酸氨肽酶也是一个广泛分布于原核及真核生物的胞内酶.它专一性地水解多肽链N端起始的甲硫氨酸,也可以被金属离子Mn2+或C o2+激活.在甲硫氨酸氨肽酶晶体结构中发现,2个金属离子与5个氨基酸残基及1个水分子之间形成氢键,这5个氨基酸分别来自构成活性中心疏水口袋的5条B 折叠.从Fig11的多序列比较中,我们发现这5个氨基酸在所有的脯氨肽酶中都是保守的.并且在进行脯氨肽酶与甲硫氨酸氨肽酶的序列对准时,这5个氨基酸也得到了很好的对应关系(Fig12).由此我们推断这5个氨基酸在脯氨肽酶中很可能也是在与金属离子的结合中起作用.
213人脯氨肽酶C端结构域的模建
以E.coli蛋氨酸氨肽酶的三维结构为模板,用计算机模拟得到了人脯氨肽酶C端Met190到Cys 467共278个氨基酸的空间结构(Fig13).它有1个由6个B折叠构成的疏水结构中心,外面被5条A 螺旋及一些loop包围.活性中心位于疏水结构中央.在疏水结构内部有5个保守氨基酸Asp276、Asp287、His370、Glu412及Glu452形成一个较强的负电荷区,周围有3个较弱的正电荷区域.疏水口袋底部是一个较大的疏水区,周围有一些疏水性氨基酸包围.从Fig13中可以看出人脯氨肽酶也具有与甲硫氨酸氨肽酶相似的内在假二聚体结构,即AA190-293和AA303-463两个空间对称的结构,只是在AA342-368之间多一个插入的A螺旋片段
.
Fig.3Modeli ng of the C-termi nus of human proli dase using E.
coli me thi onine aminopepti dase as template
Arrow i ndicates the i nserted A-helix bet ween AA342)368;Dark,
A-helix;Gray,B-sheets
214模建结构的Profile3D评估
模建的人脯氨肽酶C端结构的Profile3D合理性验证表明,得分大多数都在012以上(Fig14),结果可信.得分在0以下的仅有的6个氨基酸均位于模建结构的外周A螺旋上,对疏水结构核心的影响较小(Fig14).
将人脯氨肽酶模建结构与模板1MAT进行结构
503
第4期郭崇志等:人脯氨肽酶活性中心结构的计算机模拟
Fig.4 Profile -3D evaluation of modeling of the C -terminus of hu -man proli dase
比较,结果表明其主链原子在活力中心附近有较高的相似性,5个保守氨基酸的重原子空间坐标的均方根偏差rmsd 为011118813nm.
215 金属离子对甲硫氨酸氨肽酶的结构影响
由于人脯氨肽酶模建的时候没有加入重金属原子,因此观察模板甲硫氨酸氨肽酶1MAT 在无金属离子时结构有无变化来推断人脯氨肽酶模建结构的可信性.我们将模板甲硫氨酸氨肽酶1MAT 去除金属原子Co 2+
后,进行分子动力学计算,得到没有金属原子时的结构模型,并与有Co 2+
存在时的原模板
的结构进行了比较(Fig 15).结果表明,金属C o 2+
原子对维持和稳定蛋白分子的三维结构的贡献不大,去除Co 2+
原子的结构与原结构无明显变化.推测人脯氨肽酶结构与之有类似的情况.金属原子的作用可能只是参与催化底物反应,而对三维结构的形成没有贡献
.
Fig.5 3-D structures of E .coli methionine a minopeptide in pres -ence or in absence of metal ion Dark:with Co 2+;Gray:w i thout Co 2+
3 讨论
人类脯氨肽酶异常或缺陷导致的脯氨肽酶缺陷
症(prolidase deficiency,PD)是一种罕见的常染色体隐性遗传病.导致酶活性异常的原因是由于患者的脯氨肽酶结构发生变化,而不是数量的减少.染色体上的点突变导致脯氨肽酶一级结构改变,如
D276N [21]
,R184Q,G278D,G448R 及452位的Glu 缺失等
[22]
.分析得到的脯氨肽酶结构,D276N 突变及
E452的缺失恰好发生在与金属原子结合的保守氨基酸上.Asp 突变为Asn 后,少了一个自由羟基,不能再与金属原子结合,导致活性丧失;而E452的缺失同样导致酶活性的完全丧失.G278D 突变发生在
疏水口袋的开口处,突变引入了一个具有较大空间位阻的氨基酸,对邻近的D276与金属原子的结合产生影响,故也导致酶活性丧失.G448R 发生在疏水口袋的底部,突变同样产生了一个具有较大空间位阻的强的极性氨基酸Arg,对周围疏水环境具有比较大的破坏作用,因此也使得酶活性丧失.只有R184Q 突变发生在离酶的活力中心较远的位置,位于脯氨肽酶N 端及C 端两个结构域的连接部位,因此其突变体仍保留有714%的酶活性
[23]
.
随着对脯氨肽酶结构和功能的进一步研究,人们对脯氨肽酶的认识将会更加深入.此酶有可能用于神经性毒剂的预防救治中,对脯氨肽酶缺陷症的诊断与治疗也会有极大的帮助.参考文献(References )
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