一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.09.11C N 103289969 A (21)申请号 201310228547.2
(22)申请日 2013.06.08
C12N 9/02(2006.01)
(71)申请人中国科学院烟台海岸带研究所
地址264000 山东省烟台市莱山区春晖路
17号
(72)发明人衣悦涛 靳志明 冯大伟 刘胜一
(74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人
汤东凤
(54)发明名称
一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的方
法
(57)摘要
本发明公开了一种从植物中提取超氧化物歧
化酶的方法，包括以下具体步骤：按料液比（W/V ）
为1:1～1:2，加入磷酸缓冲液并打成浆液；将得
到的浆液进行压榨，收集汁液；用100目～300目
的滤布粗过滤；过滤后的汁液先经过截留分子量
为40000～60000的超滤膜，再经过截留分子量为
6000～20000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗
提液，进一步纯化并喷雾干燥后得所述超氧化物
歧化酶。

本发明方法原料来源广、成本低而且对人
和动物无害、无病毒，无任何副作用，产物活性高。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书3页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图1页(10)申请公布号CN 103289969 A
*CN103289969A*
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1.一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下具体步骤：
1）取植物新鲜茎叶，清水洗去表面杂物；
2）按料液比（W/V ）为1:1～1:2，加入0.1M 的pH 为7～8的磷酸缓冲液，用打浆机打成浆液；
3）将得到的浆液进行压榨，收集汁液；
4）滤渣加入去离子水进行二次压榨，汁液与上一步合并，弃去废渣；
5）合并后的汁液用100目～300目的滤布粗过滤；
6）过滤后的汁液先经过截留分子量为40000～60000的超滤膜，再经过截留分子量为6000～20000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液；
7）粗提液经过葡聚糖凝胶柱进一步纯化，得到超氧化物歧化酶精制液；
8）得到超氧化物歧化酶成品液，可经过喷雾干燥法得到固体超氧化物歧化酶粉末成品。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2）中磷酸缓冲液用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2）中，打浆时，温度可控制在30～50℃。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤3）中采用孔径为140-390微米的带式压滤机进行压榨，压力条件为0.4～0.8MPa/cm 2。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤7）中葡聚糖凝胶柱SephadexG-50。

6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤8）中，喷雾干燥进风温度在120～135℃之间。

权 利 要 求 书CN 103289969 A
一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶的制备方法，具体涉及一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法。

背景技术
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称：SOD，是广泛存在于生物体内的一种抗氧化酶，能够催化超氧阴离子发生歧化反应，而现已证实，由氧阴离子引发的疾病多达60多种。

由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，而超氧化物歧化酶可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害，从而抵御超氧阴离子自由基的毒害作用，在抗辐射、抗肿瘤、抗逆境及延缓机体衰老等方面起着重要作用。

超氧化物歧化酶在医药、食品、农业中已有应用，相应的一些产品也在市场上畅销。

[0003] 超氧化物歧化酶在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。

现在国内外市场上的超氧化物歧化酶产品绝大部分是从动物血液中提取而来的，但是从动物血液中提取超氧化物歧化酶具有很大的缺陷，动物性超氧化物歧化酶的排他性、不易常温保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险，许多国家和地区已经明令禁止从动物中提取的超氧化物歧化酶产品的使用；再加之动物血液来源比较短缺，分离工作量又大，造成了生产成本巨大，经过一系列的工艺过程，所得到的超氧化物歧化酶的活性保持率也较低，所以现在超氧化物歧化酶的提取原料逐渐从动物转向植物，而传统提取工艺分离技术主要采用分步盐析来分离SOD，这会造成相应的化学污染，随着人们对产品安全性能要求的提高及市场需求，所以与之相对应的提取超氧化物歧化酶工艺方法也在改变。

[0004] 现在已经有一些从植物中提取超氧化物歧化酶的方法，但也存在一些缺陷。

传统一般用硫酸铵盐析，这会造成一定的化学污染；用有机试剂沉淀法提取，而有机试剂本身就存在一定的毒性，提取过程中很可能对人体造成危害，并且很容易在产品中残留；用高温热变，离心分离等提取方法提取，对温度和离心转速要求较高，相应的会提高制备成本，难以实现工业化生产。

[0005] 专利申请号为201010151796.2，申请人张卫国的专利鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工艺中采用离心分离、层析后超滤膜超滤，但是该工艺需要依次经过三种亲和层析柱，过程较复杂耗时，前处理离心条件过高，不适宜大批量生产。

专利申请号为201110004935.3，申请人龚森淼的专利从牛蒡的根、茎和叶提取超氧化物歧化酶的工艺方法中采用冷冻分离初分离后二次超滤，分别用6万和1万的超滤膜，但是选用的膜固定，适用范围较小，而且单独使用膜分离，没有结合其他方法，相应的纯度较低。

发明内容
[0006] 本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种从植物茎叶提取超氧化物
歧化酶的新方法，本发明方法原料来源广、成本低而且对人和动物无害、无病毒，无任何副作用。

[0007] 为了实现本发明的上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0008] 一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下具体步骤：
[0009] 1）取植物新鲜茎叶，清水洗去表面杂物。

[0010] 2）按料液比（W/V）为1:1～1:2，加入0.1M的pH为7～8的磷酸缓冲液，用打浆机打成浆液。

[0011] 3）将得到的浆液进行压榨，收集汁液。

[0012] 4）滤渣加入去离子水进行二次压榨，汁液与上一步合并，弃去废渣。

[0013] 5）合并后的汁液用100目～300目的滤布粗过滤。

[0014] 6）过滤后的汁液先经过截留分子量为40000～60000的超滤膜，再经过截留分子量为6000～20000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液。

[0015] 7）粗提液经过葡聚糖凝胶柱进一步纯化，得到超氧化物歧化酶精制液。

[0016] 8）得到超氧化物歧化酶成品液，可经过喷雾干燥法得到固体超氧化物歧化酶粉末成品。

[0017] 较佳的，步骤2）中磷酸缓冲液用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成。

[0018] 较佳的，步骤2）中，打浆时，温度可控制在30～50℃。

[0019] 较佳的，步骤3）中采用孔径为140-390微米的带式压滤机进行压榨，压力条件为0.4～0.8MPa/cm2。

[0020] 较佳的，步骤7）中葡聚糖凝胶柱为SephadexG-50。

[0021] 较佳的，步骤8）中，喷雾干燥进风温度在120～135℃之间。

[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 本发明旨在提出一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的工艺方法，该工艺方法的提取原料为新鲜植物茎叶，原料来源广、成本低而且对人和动物无害、无病毒，无任何副作用，可用于药物、食品、饮料和保健品等；该工艺方法在打浆后经过两次压榨处理，出汁率可达到80%以上，提取率高，并且物理条件较容易达到；采用膜分离技术与层析柱两者相结合的方式分离纯化超氧化物歧化酶，与两种技术单独使用相比，效果更好，能够大大提高了超氧化物歧化酶产品的纯度；该工艺方法中产生的废渣可以作为生物饲料，而经过截留分子量为40000～60000的超滤膜截留下的液体还含有丰富的叶蛋白，既可以再处理得到其他蛋白产品，也可以给动物直接饮用。

附图说明
[0024] 图1是本发明从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的工艺生产流程图。

具体实施方式
[0025] 下面结合具体实施实例对本发明作进一步详细说明。

[0026] 实施例1从新鲜鲁梅克斯中提取超氧化物歧化酶
[0027] 本实施例的生产流程如图1所示，称取50kg清洗干净的新鲜鲁梅克斯茎叶，加入50kg0.1mol/L的pH为7.4的磷酸缓冲溶液（用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成），用打
浆机打碎匀浆，打浆时维持温度在35℃。

将浆液进入带式压滤机进行压榨，滤带孔径140微米，压力为0.8MPa/cm2，收集汁液90kg，将滤渣加入12kg去离子水采用相同的条件进行压榨，弃去废渣，将两次滤液合并共100kg，用300目的滤布过滤。

滤液先经过截留分子量为40000的超滤膜，得到大于40000分子量的液体25kg；小于40000分子量的液体再经过截留分子量为10000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液4.5kg；粗提液经过葡聚糖凝胶柱（SephadexG-50）用4%（重量百分比）低度乙醇进行洗脱，得到超氧化物歧化酶精制液；减压浓缩后，测超氧化物歧化酶的比活为830.2u/毫克蛋白；用喷雾干燥法，在进风温度在130℃条件下喷雾干燥，得到固体超氧化物歧化酶粉末产品113.84g。

[0028] 实施实例2从新鲜碱蓬中提取超氧化物歧化酶
[0029] 称取50kg清洗干净的新鲜碱蓬茎叶，加入75kg0.1mol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液（用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成），用打浆机打碎匀浆，打浆时维持温度在45℃。

将浆液进入带式压滤机进行压榨，滤带孔径190微米，压力为0.4MPa/cm2，收集汁液115kg，将滤渣加入11kg去离子水采用相同的条件进行压榨，弃去废渣，将两次滤液合并共126kg，用100目的滤布过滤。

滤液先经过截留分子量为50000的超滤膜，得到大于50000分子量的液体36kg；小于50000分子量的液体再经过截留分子量为20000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液5.7kg；粗提液经过葡聚糖凝胶柱（SephadexG-50）用5%（重量百分比）低度乙醇进行洗脱，得到超氧化物歧化酶精制液；减压浓缩后，测超氧化物歧化酶的比活为657.2u/毫克蛋白；用喷雾干燥法，在进风温度在120℃条件下喷雾干燥，得到固体超氧化物歧化酶粉末产品106.92g。

[0030] 实施实例3从新鲜菠菜中提取超氧化物歧化酶
[0031] 称取50kg清洗干净的新鲜菠菜茎叶，加入100kg0.1mol/L的pH为7.8的磷酸缓冲溶液（用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成），用打浆机打碎匀浆，打浆时维持温度在30℃。

将浆液进入带式压滤机进行压榨，滤带孔径170微米，压力为0.6MPa/cm2，收集汁液126kg，将滤渣加入28kg去离子水采用相同的条件进行压榨，弃去废渣，将两次滤液合并共155kg，用200目的滤布过滤。

滤液先经过截留分子量为60000的超滤膜，得到大于60000分子量的液体47kg；小于60000分子量的液体再经过截留分子量为6000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液6.4kg；粗提液经过葡聚糖凝胶柱（SephadexG-50）用4%（重量百分比）低度乙醇进行洗脱，得到超氧化物歧化酶精制液；减压浓缩后，测超氧化物歧化酶的比活为1002.8u/毫克蛋白；用喷雾干燥法，在进风温度在135℃条件下喷雾干燥，得到固体超氧化物歧化酶粉末产品117.34g。

图1。