丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝癌细胞增殖的影响

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝癌细胞增殖的影响
杨春;陈文;钟晓琳;王忠琼;陈枫;夏纪毅
【摘要】Objective To investigate the effect of hepatitis C virus NS4B (HCV-NS4B) to the proliferation and the expression of PCNA and cyclinDl in HepG2 cells. Methods The recombinant vector PCXN2-NS4B expressing HCV-NS4B gene was transfected into HepG2 cells using liposomal transfection reagent kit. The expression of the transfected NS4B gene was determined by RT-PCR. The growth curve was made by MTT. The cell cycle was detected by flow cytometry. Semiquantitative immunocytochemistry assays was used to analyze the expression of PCNA and cyclinD1. Results The results from RT-PCR analysis demonstrated that there was the replication of HCV-NS4B gene in the transfected HepG2 cells. The growth curve showed that HCV-NS4B could improve the proliferation of HepG2 cells. The ratios of HepG2 cells in S and G2/M stages were significantly higher in NS4B transfected group than those in control group (P <0. 05) . The expression of PCNA and cyclinDl in NS4B transfected group were significantly higher than those in control group (P< 0. 05 ) . Conclusion HCV-NS4B can promote the proliferation of hepatoma carcinoma cells through increasing the expression of PCNA and cyclinD1.%目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白4B(HCV-NS4B)对肝癌细胞增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)和周期素D1(cyclinD1)蛋白表达的影响.方法采用构建好的HCV-NS4B表达载体,以脂质体转染法转染HepG2细胞.RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳证实HCV-NS4B在HepG2细胞稳定表达.MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响；流
式细胞仪检测细胞周期的情况；免疫细胞化学法检测PCNA和cyclinD1的表达.结果转染后,生长曲线显示NS4B可促进肝细胞生长；细胞周期检测显示转染
NS4B的HepG2细胞进入S期和G2/M期增多(P＜0.05),处于G0/G1期细胞降低(P＜0.05).PCNA和cyclinD1的表达均较空白载体组升高(P＜0.05).结论 HCV-NS4B可干扰肝癌细胞周期,促进肝癌细胞增殖,其作用与上调PCNA、cyclinD1表达有关.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2012(052)032
【总页数】4页(P31-33,后插3)
【关键词】丙型肝炎病毒非结构蛋白4B;肝肿瘤;增殖细胞核抗原;周期素蛋白D1【作者】杨春;陈文;钟晓琳;王忠琼;陈枫;夏纪毅
【作者单位】泸州医学院附属医院,四川泸州64600;泸州医学院附属医院,四川泸州64600;泸州医学院附属医院,四川泸州64600;泸州医学院附属医院,四川泸州64600;泸州医学院附属医院,四川泸州64600;泸州医学院附属医院,四川泸州64600
【正文语种】中文
【中图分类】R512.6
HCV感染是全球流行疾病，与原发性肝癌(HCC)关系密切［1］。

丙型肝炎非结构蛋白 4B (HCV-NS4B)是HCV的一个非结构蛋白，其功能到目前为止仍旧还不是很清楚［2］。

相关研究显示NS4B蛋白在HCV感染细胞的恶性变中起重要作用
［3］。

我们前期研究证实HCV-NS4B促进肝细胞增殖［4］，还发现HCV-
NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝细胞的表达［5］，提示HCV-NS4B在丙
型肝炎致癌机制中可能起一定作用。

而关于HCVNS4B蛋白对肝癌细胞增殖的影
响及其机制的研究国内外未有报道。

2010年2月～2011年3月，本研究采用HCV-NS4B表达载体，利用脂质体转染技术将NS4B导入肝癌细胞，检测其对肝
癌细胞周期的影响，以及其对增殖细胞核抗原(PCNA)和周期素D1(cyclinD1)表达的影响。

1 材料与方法
1.1 材料人肝癌细胞株HepG2由泸州医学院附属医院中心实验室提供，PCXN2-NS4B质粒为李昌平教授构建并保存。

1.2 实验方法
1.2.1 质粒转染及鉴定HepG2细胞分为3组:空白对照组(未转染的HepG2细胞)，空白载体组(PCXN2转染组)，PCXN2-NS4B转染组，每组设3个复孔。

对数生长期细胞转染前1 d以2×105/mL接种于6孔板，37℃，5%CO2培养;待细胞生长达60%～80%汇合，加入以1.5 μg/4 μg配制质粒/脂质体混合物(DOSPER脂质
体细胞转染试剂盒购自德国Roche公司)，空白对照组加入等体积无血清培养基。

24 h后加入800 mg/mL G418(购自上海Sangon公司)筛选，待空白对照组细胞全部死亡后，G418减量为200 mg/L维持筛选并传代培养。

采用TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)一步法提取HepG2细胞总RNA。

使用NS4B特异性的反向引物进行逆转录合成cDNA。

以cDNA作为模板，加入GoTaq DNA多聚酶、NS4B特异性的引物进行PCR反应。

引物:正义链5'-CCGCTCGAGTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCT-3'，反义链 5'-CCGCTCGAGACCATGGCCTCACACCTCCCTTACAT-3'(RT-PCR试剂盒购自美国Sigma公司)。

RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定是否转染成功。

1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线转染后HepG2细胞以胰蛋白酶消化，1×103/孔接种于96孔板，各接种5复孔，共接种7个板，以完全培养基作为空白调零孔，每天取1个96孔板检测。

待检测板每孔加入MTT液(购自上海Sangon公司)5 mg/mL，20 μL于37℃，5%CO2培养4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜。

490 nm波长测光密度值(OD值)，每个标本的OD值应减去零孔的OD值。

以时间为
横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.3 流式细胞仪测细胞周期转染后HepG2细胞以胰蛋白酶消化，2 000 r/min
离心5 min，PBS重悬细胞2次，调节细胞浓度为(1～2)×105/mL，取1 mL置
于流式上机管中检测细胞周期。

1.2.4 PCNA、cyclinD1蛋白表达的检测免疫细胞化学方法检测:转染后HepG2细胞以胰蛋白酶充分消化。

1×105传代于预置玻片(经多聚赖氨酸处理)的6孔板中，37℃、5%CO2培养24 h。

固定冲洗细胞爬片，抗原修复，10%正常山羊血清封闭，再逐步滴加一抗、生物素标记二抗、链霉抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液，
最后经DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片、镜检。

阴性对照除了用PBS 代替一抗外，所有步骤同上。

每组细胞各进行6次独立性实验。

(鼠抗人PCNA单克隆抗体和鼠抗人cyclinD1单克隆抗体均购自美国SANTA CRUZ公司;DAB显色剂购自美国Sigma公司)。

免疫细胞化学结果判定:阳性呈棕黄色颗粒定位于胞质，采用OLYMPUS BX50生
物显微高清晰度彩色病理图文采集系统进行图像采集。

Image-Pro Plus 6.0图像
分析系统自动测定免疫细胞化学阳性产物OD值。

每张爬片在100倍视野下随机
测5个视野，取其均值。

1.3 统计学方法以SPSS1
2.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示，多组间
两两均数比较采用SNK法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 基因转染及鉴定 PCXN2-NS4B组有HCVNS4B表达，表明基因转染入HepG2细胞后，可稳定表达NS4B，见图1。

图1 PCXN2-NS4B转染组RT-PCR产物1%琼脂糖电泳图注:M为Marker，1～3为HCV-NS4B
2.2 NS4B对HepG2细胞生长曲线的影响转染PCXN2-NS4B后，HepG2细胞
生长速度较空白载体组增快(图2)。

图2 HepG2细胞生长曲线
2.3 NS4B对肝细胞细胞周期的影响见表1。

2.4 NS4B对PCNA、cyclinD1蛋白表达的影响见表2，插页Ⅱ图6、7。

表1 HepG2细胞细胞周期情况(±s)注:与空白载体组及空白对照组比较，*P＜0.05? 表2 PCNA及cyclinD1蛋白在HepG2细胞表达OD值(±s)注:与空白载体组及空白对照组比较，*P＜0.05?
3 讨论
细胞异常增殖是肿瘤发生的重要机制之一，肿瘤细胞的增殖率是决定肿瘤生物学行为的一个重要参数［6］。

我们将外源性 HCV-NS4B基因导入HepG2细胞。

流
式细胞仪检测细胞周期显示，转染NS4B的肝癌细胞进入静止期的细胞减少，而S 期和G2/M期显著增多，表明肝癌细胞的增殖能力明显增强，提示HCV-NS4B可能通过某种机制刺激细胞DNA合成，细胞进入S期，促进细胞增殖。

HCVNS4B 主要作用包括抑制翻译，调节NS4B RNA依赖的RNA聚合酶的活性，引起细胞
转化，诱导细胞非折叠蛋白反应等［7～9］。

研究发现NS4B蛋白还能够激活细
胞信号转导途径，影响细胞生长调节［10］。

我们前期研究亦证实HCV-NS4B可通过增进细胞周期素cyclinD1、PCNA表达，干扰肝细胞周期，促进肝细胞增殖［4］。

还发现HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝细胞的表达［5］。

而本研究进一步提示HCV-NS4B对肝癌细胞亦有促进细胞增殖的作用。

细胞周期受多种蛋白调节。

PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，直接参与细胞增殖的DNA复制［11］。

作为一个内源性增殖细胞的标记物，与肿瘤的增长活性、转移及预后有密切关系，PCNA阳性细胞的多少能反映肿瘤生长速度及恶性程度，预示肿瘤转移危险及患者的存活时间［12］。

cyclinD1是细胞周期G1/S期监控
点重要的正向调控因子，其通过激活细胞周期依赖性蛋白激酶，进而活化下游的信号分子促进DNA合成，加快细胞由G1期进入S期，从而导致细胞失控性生长［13］，与多种肿瘤的发生有密切关系。

本研究发现转染NS4B的肝癌细胞PCNA及cyclinD1表达均明显增强，提示HCV-NS4B蛋白可能促进PCNA及cyclinD1表达，促使更多细胞越过G1/S期
监控点而进入S期，促进细胞异常增殖，参与肝癌的发生。

参考文献:
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