岭南道地药材毛冬青等规范化种植及种质资源
毛冬青药材的鉴别研究
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UAN H J M
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， CHE N R I - ， E NG ， N ， 3300 29
� 中 药 研 究 �
� � O � :T o e abl � � i� h he � � � m � � e � � hod of � mi c ro c harac e� ri d en i f i ca i on and hi n-l a e r c hrom a og rap h ofI P . M e hod : W e co l l ec e d he � � roo � o fI l e P� be e n f r om � d i f f e re � n pl ac � e ， ob e r e he c om m on m i c ro c ha rac er of he c om p o nd and i den i f i d he m b TLC. � Re l � � :� The � � m � i c ro � i d en i f � i c ai on � � � ho he am � e c harac � e r : S arch g r ai n� bo rde red p i e e l� S one c e l l� Cr a lf i be r; The hi n-l a� � � � � � e� r c hrom a og rap h � � ho � � e d ha � he I l e P be c e n had he i mi l a r po ih he m i e d R e f ere nce b anc e and he R e f e re nc e m e di ci ne � � � � � a he � � a me � p o ii on.Con � l � : T he � m� e� hod� e e abl i he d c a n be ed o i d en i f I l e P be c e n and c on rol he q al i ofi. � K :I l e P be c en; m i c ro c harac e r i d en i f i c ai on; hi n-l a er chrom a og rap h
2岭南中草药资源与文化____南南方医科大学
桑科植物粗叶
榕Ficus hirta
五
的干燥根。
指
毛
性平，味甘；
桃
健脾补肺、
利湿舒筋。
黄 牛 木
金丝桃科植物黄牛木Cratoxylon cochinnense的 干燥树皮及干或鲜叶。清热解暑，健胃消食。
唇形科植物肾茶
Clerodendranthus
spicatus 的干燥
猫
地上部分。
须
用法：偶尔使用， 切记过量、长期用
主要参考文献
【1】中国植物志(80卷126册),北京:科学出版社 ,1959--2001. 【2】中国高等植物图鉴,北京:科学出版社 ,1972.
【3】中华本草,上海:上海科技出版社,1999. 【4】王强,徐国钧主编.道地药材图典.福建: 福建科学技术出
版社，2003． 【5】中国中药材鉴定图典(1-4),广州:广东科技出版社,1999. 【6】艾铁民主编,药用植物学, 北京大学医学出版社 ,2004. 【7】马骥，张宏伟.岭南本草集锦.北京:科学出版社 ,2010.
苏木
【来源】 豆科植物苏木
Caesalpinia sappan 的 干 燥
心材。 【功效】 活血祛瘀，消
肿止痛。
穿心莲
【来源】
爵床科植物穿心莲
Andrographis paniculata 的
地上部分。
【历史】原产印度、斯里兰卡、 缅甸、印尼、泰国、越南等国, 作健胃药， 1954年载于印度药
典 ;50 年 代 广 东 、 福 建 引
种 ,1985 年 收 入 国 家 药 典 一 部 。
蓼科植物
火炭母
火
Polygonum
炭
立法保护岭南中药材功在千秋
用北宋沈括 《 梦溪笔谈 》中的话说 ： “ 其 意以谓
药 虽众 ， 主病 者 专在 一 物 ，其 他 则节 级 相 为 用 。 大略相 统 制 。”跟 治 国理 政 有 那 么点近 似 的意 思 。 不过 ， 沈括 显 然 不认 同 这 种 借 喻 ，他 不 客 气地 指
要产 区都在 茂名市。诚 如与会专 家所言 。省人 大
多佚 文 ，从 而得 知该 书以讨论 药物性 能为主。有
趣 之 处在 于其 所承 袭的 前人观 点 ：把 草 药分 出
６ ／ 广
线设 计得 好 ，令 标 本 瓶 晶 莹 剔 透 ， 色彩 斑 斓 ，站
在馆 内不同楼 层观 赏 ，都会呈现 出不一样 的视 觉
美感。仔细看去 ，每 个标本瓶 的旁边都 有铭 牌 ，
标明药材的名字 ，扶桑 、两面针 、溪黄草 、五指
毛桃 什 么 的。
有尽 有 ，药名 因而可 以成诗 ，或径 用 ，或谐 音 ， 或双关。比如 宋代 《 青箱杂记 》记载的陈亚 ， “ 尝
三人淡 本 栏 责 编 一 王 堂 明
７ 月１ １ 日，广 东省人 大常委 会 《广 东省岭 南
行 。这 一拟 于今 年 出台的条 例 ，将 从 种 源 、产
地 、种 植 和 品 牌 四 个 方 面 ，对 岭 南 中 药材 进 行 立 法保 护 ， 其 中化橘 红 、沉 香 等 五 种 的 原 产 地 或 主
中，巴豆显然不在君药之列 。当然 ，草 药可分君 臣，并非 《 药性 论 》的 原创 ，借 鉴 了 《内经 》 《 素 问》那些奠基性 的 中医著作 中药材的名称异彩纷呈 ，有 以十二 生 肖的 、 有以天地人 日月星辰的 、以春夏秋冬 东南西北的，
其 他 诸 如 产 地 、数 字 、颜 色 、 气味 、功 效 等 ，应
阮岩治疗儿童鼻渊经验撷英
•临证经验•阮岩治疗儿童鼻渊经验撷英刘铮U,王建慧\徐慧贤1，常少球“2,阮岩1C广州中医药大学第一附属医院，广州510405; 2广州中医药大学第一临床医学院，广州510405)摘要：阮六教授认为儿童鼻渊乃本虚标实之病，其发病与肺睥肝三脏，尤其与肺睥两脏功能失调密切相关，其主要病因病机是脾气虚弱、肺气虚寒、脾胃湿热、胆腑郁热；故治疗之法苘$:同护脾胃，睥胃健则痰饮丨4除此外配合特色岭南药材及外治法、膳食调养，临床获效颇佳关键词：儿童鼻渊；岭南药材；四君子汤；苍耳子散基金资助••同家14然科学基金项目（N c k8197151814)，广东省中医药宵理局科研项El(N〇.20181081)，2020年阮岩广东柯名中医传承T.作室（N〇.21006(X)145),广州中医药大学第一附厲医院创新强院岭南治未病^项项目（N〇.2017Z W B08)R U A N Yan’s experience in treating children’s sinusitisLIU Zheng12,WANG Jian-hui1,XU Hui-xian1,CHANG Shao-qiong12,RUAN Yan1(No.l Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China; :First School of ClinicMedicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China )Abstract: Professor RUAN Yan believes lhat children's sinusitis is a disease of deficiency in origin and excess in superficislity. Its incidence is closely related to the dysfunction of the lung, spleen and liver, especially the dysfunction of lungand spleen. The main etiology and pathogenesis are deficiency of the spleen qi, deficiency of the lung qi, dampness and heat ofthe spleen and stomach, and heat of the gallbladder. Therefore, the first method of the treatment is the to protect the spleen and stomach, then it can remove phlegm. In addition, with the characteristic Lingnan medicinal materials, external treatment, and dietcare, the clinical effect is quite good.Key words: Children's sinusitis; Lingnan herb; Sijunzi Decoction; Cangerzi PowderFunding：National Natural Science Foundation of China (No.8197151814), Scientific Research Program of Traditional Chinese Medicine Administrative Bureau of Guangdong Province (No.20181081), 2020 RUAN Yan Guangdong Traditional Chinese Medicine Inheritance Studio (No.2100600145), Lingnan Preventive Treatment Foundation for Innovative Strong Hospitalof No.l Affiliated Hospital of Guangzhou Universityof Chinese Medicine (N〇.2017ZWB08)儿童鼻渊是指3 ~ 14岁的儿童发生的以鼻流浊 涕，量多不止为主要特征的疾病m。
道地药材考以20种中药为例
道地药材考以20种中药为例一、本文概述《道地药材考以20种中药为例》是一篇旨在深入剖析和探讨中国传统药材道地性的学术论文。
本文选取了20种具有代表性的中药作为研究对象，通过对这些药材的产地、生长环境、采收季节、炮制方法等多个方面的详细考察，旨在揭示道地药材的独特性以及其对药材质量和药效的影响。
在中医理论中，药材的道地性被视为保证药材质量和疗效的关键因素之一。
道地药材不仅具有独特的生长环境和采收条件，而且在炮制和加工过程中也有严格的要求。
本文的研究旨在通过对20种中药的实例分析，为读者提供关于道地药材的详细知识，进而促进中药材的合理使用和中药产业的健康发展。
在文章结构上，本文将首先介绍道地药材的基本概念及其在中医药学中的重要性，然后逐一分析20种中药的道地性特征，包括产地分布、生长环境、采收季节、炮制方法等方面。
本文还将探讨道地药材对药材质量和药效的影响，以及如何通过科学的方法评价和鉴定道地药材。
本文将总结研究成果，并提出对未来道地药材研究的展望和建议。
通过本文的阅读，读者可以更加深入地了解道地药材的内涵和特征，以及其在中医药学中的应用价值。
本文也为中药材的种植、加工和使用提供了科学的参考依据，有助于推动中医药产业的持续发展和创新。
二、道地药材概述道地药材，又称为地道药材，是优质中药材的代名词，是指历史悠久、产地适宜、品种优良、炮制考究、疗效突出、带有地域性特点的药材。
它是中医药学的独特概念，也是中药区别于化学药物的重要特征之一。
道地药材的形成受到地理、气候、土壤、品种、栽培、采收、加工等多种因素的影响。
中国地域辽阔，自然环境多样，不同的地域环境孕育了各具特色的道地药材。
这些药材在特定的地域内种植、生长，经过长期的自然选择和人工驯化，形成了独特的品质和疗效。
以20种中药为例，如人参、黄芪、当归、枸杞、茯苓、白术、甘草、熟地黄、白芍、川芎、麦冬、天冬、阿胶、银耳、石膏、龙骨、牡蛎、麝香、鹿茸、牛黄等，都是各自地域内的道地药材。
国家中医药管理局关于政协第十三届全国委员会第四次会议第1711号（农业水利类270号）提案答复的函
国家中医药管理局关于政协第十三届全国委员会第四次会议第1711号（农业水利类270号）提案答复的函文章属性•【制定机关】国家中医药管理局•【公布日期】2021.11.08•【文号】国中医药提字〔2021〕80号•【施行日期】2021.11.08•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】药政管理正文关于政协第十三届全国委员会第四次会议第1711号（农业水利类270号）提案答复的函国中医药提字〔2021〕80号咏梅委员：您提出的《关于推进道地药材(中蒙药材)质量及生态种植的提案》收悉，现答复如下：一、深入开展第四次全国中药资源普查及第一次全国林草种质资源普查与收集工作一是我局自2011年开展第四次全国中药资源普查以来，已在全国31个省2700余个县开展中药资源调查，汇总了全国近1.3万多种野生药用资源的种类、分布信息，总记录数2000万条、基于100多万个样方的调查数据;收集了药材样品、腊叶标本、种质资源36万余份。
此外，已初步建成了由1个中心平台、28个省级中心、65个监测站组成的中药资源动态监测和技术服务体系;在全国建成28个中药材种子种苗繁育基地和2个中药材种质资源库，基本摸清了调查区域的中药资源本底情况，形成了我国中药资源保护和可持续利用的长效发展机制。
在此基础上，对部分珍稀濒危中药材实施迁地引种、人工种植、野生抚育等技术，形成了一套在温带、亚热带、热带地区迁地引种药用物种的技术体系，在药材原生或相似环境中增加种群数量，使资源量能够为人们采集利用，并保持群落平衡。
二是国家林草局2019年启动了第一次全国林草种质资源普查与收集工作，下一步将根据普查结果，科学设立种质资源监测点，逐步建立种质资源监测体系。
同时国家林草局已将野生植物资源调查和种质资源保护列为野生植物保护“十四五”规划重点工作之一，将组织开展重点保护野生植物专项调查与监测;支持建设种质资源库，逐步保存国家重点保护野生植物种质资源，建设野生植物资源监测网络。
广东省立法保护的岭南道地药材(一)
【 编者按 】 岭南文化是悠久灿烂的 中华文化的有机组成部 分 ， 而岭 南 医药文化则 又是 岭 南文化的 重要 组成部 分。早在
２ ０ ０ ７年 第 １月的开年 第 １ 期， 我刊即在传统 医学栏 目图文并茂地连载靳老《 岭 南医药启示 录》 《 岭 南 医药启 示录续篇》 等 系列 文章 ， 为 弘扬岭 南 中医药文化 、 建设广 东中医药强省服 务。而今 ， 在岭 南道地 药材质 量、 数 量 下降及 市场 无序竞 争的情 况下 ，
地为 湛 江 ； 巴戟天 的主要 产地 为德 庆 ； 广 佛 手 的主要 产地 为 高要 ； 何首 乌 的主要产 地 为肇庆 ； 沉香 的主要
广 东省 政府应 依 法设立 岭南 中药 材保 护专项 基 金， 地级 以上 市县 （ 市、 区） 政府 ， 应 当将 岭南 中药 材 保 护工 作纳 入财政 预 算 ， 并 根 据 岭 南 中药 材 良种 繁
虫 害 防治 、 产 地初 加工 等作 了细 化 。
１ ． ３ 建立 品牌保 护制 度
１ 《 广 东省 岭南 中药保 护条 例 （ 草案 ） 》 概 略
１ ． １ 首批 立法保 护 的岭 南道 地 药材
首批 选 出 的岭南道 地药 材有 ８种 ， 即化 橘红 、 广
陈皮 、 阳春砂 仁 、 广 藿香 、 巴戟天 、 沉香 、 广佛 手 、 何 首 乌 。具体 措施 是 建 立 种 源 保 护 制 度 。其 种 源 基 地 为： 化橘 红 的道地产 地 为化州 ； 广 陈皮 的道地 产地 为 新会 ； 阳春砂 仁 的道地 产地 为 阳春 ； 广藿 香 的主要 产
育 基地 、 优质 岭南 中药 材生 产 基 地 以及 品牌 等 保 护 需要 ， 依 法依 规通 过 政 策扶 持 、 经 费 补 贴 等 措施 ， 给 予 优 惠。县 级 以上 政府 应利 用省 岭南 中药 材保护 资 金， 支持 行业 组织 设立 专 门 的保 护 种类 品牌 推 广 中
中药材种植简介及方案
中药材简介一、四季青四季青又名冬青，冬青科植物。
分布于我国长江以南各地，常生于疏林中。
其根和叶均可入药，主要功效为清热解毒，活血止血。
冬青为常绿乔木，可高达12米，树皮灰色或淡灰色，无毛，叶片革质，狭长椭圆形，边缘疏生锯齿，花单性，雌雄异株，花期5月，果期10月。
适于种植在向阳、温暖湿润的气候、土层深厚的肥沃土壤中。
繁殖方法有种子繁殖、扦插繁殖(常用)。
四季青除了药用之外，还可绿化，小苗全国各地苗圃均有售。
二、紫灵芝紫灵芝又名中国灵芝。
性平、无毒、微苦、无任何副作用，为上上品。
生于洁净的山坡上，比较珍稀，全国量产有限。
主用于调养糖尿病、高血压、冠心病、失眠等，长期服用能抗肿瘤、保肝护脏、延缓衰老，对人体有益无害，适合长期保健用。
一、中草药简介丹参又名赤参，紫丹参，红根等，以根入药，祛瘀止痛，活血调经，降脂减肥，清心除烦。
多年生直立草本，根肥厚，肉质，外面朱红色，内面白色。
喜气候温和，光照充足，空气湿润的环境下生长，对土壤酸碱度适应性较广，中性、弱酸、弱碱均可生长，主产于江苏、浙江、安徽、河南、山东。
白术别名术，山姜，冬白术等，以根入药，健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎。
菊科多年生草本，根状茎肥厚，略呈拳状，茎直立，上部分枝，叶椭圆边缘有刺。
喜凉爽气候，地下部的生长以26-28度为最适宜，排水较好的弱酸性粘土、弱碱性沙土均可种植，主产于江苏、浙江、安徽、福建。
旱半夏别名地文，麻玉果等，块茎入药，有毒，燥湿化痰，降逆止呕。
天南星科半夏属，多年生草本植物，茎块近球形，叶柄下部有一白色或棕色珠芽。
半夏根浅，喜温和、湿润气候，忌高温，夏季宜在不阴不阳中生长，排水良好的中性沙土或不太粘的土均可种植，主产于安徽、江苏、浙江、河南、湖北。
桔梗以根入药，止咳祛痰，宣肺排脓。
桔梗科桔梗属植物，多年生草本植物。
桔梗喜温和湿润凉爽气候，苗期怕强光直射，需遮荫，适宜土层深厚，排水良好的土壤，主产于东北、四川、安徽，江苏也可种植。
毛冬青
毛冬青质量标准
【名称与编码】毛冬青； YC451
【依据】《中国药典》2010年版一部附录22页
【取样与检验方法】见取样与检验操作规程
【来源】毛冬青为冬青科植物毛冬青Ilex pubescensHook.etArn.的干燥根。
夏、秋采收，切片，晒干。
主产于广东、广西、安徽、福建、浙江、江西、台湾等地。
【性状】根呈圆柱形，稍弯曲，直径1～4cm。
表面灰竭色或棕褐色。
大小不等，外皮稍粗糙。
质坚实，不易折断，断面皮部菲薄，木部发达，黄白色，年轮、射线较明显。
【检查】水分不得过13.0%（附录ⅨH 第一法）。
二氧化硫残留量不得过150mg/kg（附录ⅨU ）
饮片
【名称】毛冬青
【规格与包装】0.5kg/袋；1kg/袋。
袋装，密封。
【炮制】取原药材，洗净，略浸，润透，切薄片，晒干。
【取样与检验方法】【检查】同药材。
【性味归经】味微苦甘，性平，无毒。
肺；肝；大肠经
【功能主治】清热解毒，活血通脉。
治风热感冒，肺热喘咳，喉头水肿，扁桃体炎，痢疾，冠心病，脑血管意外所致的偏瘫，血栓闭塞性脉管炎，丹毒，烫伤，中心性视网膜炎，葡萄膜炎，以及皮肤急性化脓性炎症。
用于冠状动脉硬化性心脏病、急性心肌梗塞、血柱闭塞性脉管炎；外用治烧、烫伤，冻疮。
【用法用量】内服：煎汤，1～3两。
外用：煎汁涂或浸泡。
【贮藏】置通风干燥处。
广藿香DXS_基因克隆及表达分析
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):２８~３５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００４收稿日期:２０２３－１１－０８基金项目:广东省中医药局科研项目(２０２４１１７７)ꎻ广东省重点领域研发计划项目(２０２０Ｂ０２０２２１００２)作者简介:曾晴(２０００ )ꎬ女ꎬ湖南益阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为中药资源开发与品质评价ꎮＥ－ｍａｉｌ:２７１９０４１４５３＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:张宏意(１９７７ )ꎬ女ꎬ浙江舟山人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事药用植物资源与育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｄｒｉｚｚｌｅｚｈｙ＠１６３.ｃｏｍ广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析曾晴ꎬ严雅玲ꎬ严寒静ꎬ何梦玲ꎬ张宏意(广东药科大学中药学院ꎬ广东广州㊀５１０００６)㊀㊀摘要:１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)是调控萜类合成途径中ＭＥＰ途径的第一个关键酶ꎬ为探究广藿香ＤＸＳ基因参与其主要萜类成分广藿香醇合成调控的分子机制ꎬ本研究依据本课题组前期获得的转录组ＤＸＳ基因序列ꎬ以广藿香ｃＤＮＡ为模板ꎬ克隆得到ＰｃＤＸＳ基因ꎬ对其进行生物信息学分析ꎬ构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ原核表达载体诱导蛋白表达ꎬ并采用荧光实时定量ＰＣＲ法检测广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中ＤＸＳ基因表达情况ꎮ结果表明ꎬ从广藿香叶中克隆到开放阅读框全长为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐ的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因序列ꎬ分别编码７１６㊁６３５个氨基酸ꎮ预测ＰｃＤＸＳ１蛋白分子量７８.３３ｋＤａꎬ为稳定非跨膜非分泌蛋白ꎬ主要定位于叶绿体ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白分子量６７.９２ｋＤａꎬ为不稳定非跨膜非分泌蛋白ꎬ主要定位于叶绿体ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２均含有ＤＸＰ＿ｓｙｎｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块ꎬ属于ＤＸＳ超家族ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２分别与半枝莲㊁糙苏的ＤＸＳ基因序列具有较高同源性ꎮ使用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)诱导的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２融合蛋白主要在沉淀中表达ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因表达量均在根中最低ꎬＰｃＤＸＳ１基因在叶中显著高表达ꎬＰｃＤＸＳ２基因在叶㊁芽㊁茎中高表达ꎮ本研究结果可为后续深入研究ＤＸＳ基因在广藿香萜类化合物合成途径中的生物学功能及广藿香萜类代谢途径的基因调控奠定基础ꎮ关键词:广藿香ꎻ１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)ꎻ基因克隆ꎻ生物信息学分析ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ５６７.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－００２８－０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＸＳＧｅｎｅｆｒｏｍＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.ＺｅｎｇＱｉｎｇꎬＹａｎＹａｌｉｎｇꎬＹａｎＨａｎｊｉｎｇꎬＨｅＭｅｎｇｌｉｎｇꎬＺｈａｎｇＨｏｎｇｙｉ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＧｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｋｅｙｅｎｚｙｍｅｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＭＥＰｐａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＤＸＳｇｅｎｅｐａｒｔｉｃｉ￣ｐａｔｉｎｇｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔꎬｐａｔｃｈｏｕｌｉａｌｃｏｈｏｌꎬｉｎｐａｔｃｈｏｕｌｉ(Ｐｏｇｏｓｔｅ￣ｍｏｎｃａｂｌｉｎ)ꎬｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＤＸＳｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｂｔａｉｎｅｄｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｂｙｏｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｇｒｏｕｐ.ＰｃＤＸＳｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｐａｔｃｈｏｕｌｉｃＤＮＡａｓｔｅｍｐｌａｔｅꎬａｎｄｔｈｅｎａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ￣２８ａ￣ＰｃＤＸＳｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＸＳｇｅｎｅｉｎｒｏｏｔｓꎬｓｔｅｍｓꎬｌｅａｖｅｓａｎｄｂｕｄｓｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｌｅｎｇｔｈｏｆ２１５１ｂｐａｎｄ１９０８ｂｐｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ７１６ａｎｄ６３５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＰｃＤＸＳ１ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｏｈａｖｅ７８.３３ｋＤａｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔꎬａｎｄｗａｓａｓｔａｂｌｅꎬｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｎｏｎ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍａｒｉｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ.ＰｃＤＸＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄ６７.９２ｋＤａｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔꎬｗｈｉｃｈｗａｓａｎｕｎｓｔａｂｌｅꎬｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｎｏｎ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｍａｉｎｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｃｏｎｔａｉｎｅｄＤＸＰ̠ｓｙｎｔｈａｓｅ̠ＮꎬＴｒａｎｓｋｅｔ̠ｐｙｒａｎｄＴｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ̠ＣｄｏｍａｉｎｍｏｄｕｌｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏＤＸＳｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｉｎｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｉｔｈＤＸＳｇｅｎｅｓｏｆＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａａｎｄＰｈｌｏｍｉｓｕｍｂｒｏｓａ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｓｏｐｒｏｐｙｌ￣β￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ(ＩＰＴＧ)ｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖ￣ｅｌｓｏｆＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎｒｏｏｔｓ.ＰｃＤＸＳ１ｇｅｎｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｌｅａｖｅｓꎬｗｈｉｌｅＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｌｅａｖｅｓꎬｂｕｄｓａｎｄｓｔｅｍｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｒｏｏｔｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｌａｙｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＤＸＳｇｅｎｅｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙａｎｄｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｅｒｐｅｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｐａｔｈｗａｙｉｎｐａｔｃｈｏｕｌｉ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎꎻ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ꎻＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻＢｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀广藿香[Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.]是唇形科刺蕊草属草本植物ꎬ原产于东南亚ꎬ引种至我国成为岭南道地药材ꎬ是一种具有重要药用价值和广泛工业生产应用价值的经济作物ꎬ具有芳香化浊㊁和中解暑的功效[１]ꎬ是藿香正气丸㊁二妙丸㊁午时茶颗粒等中成药的主要原料ꎮ已检测到广藿香地上部分含有１７４种化学成分ꎬ其中萜类最多ꎬ达６６种ꎬ另有黄酮㊁类固醇㊁吡喃酮㊁多糖等多种生物活性成分[２]ꎬ因而具有抗菌㊁抗炎㊁抗诱变㊁抗细胞凋亡㊁抗ＨｅｐＧ１９癌细胞增殖等多种药理活性[３－４]ꎮ广藿香提取物广藿香油全球年产可达２０００吨[５]ꎬ常被用于各类芳香疗法以舒缓压力㊁减轻疲劳㊁改善失眠㊁缓解焦虑等ꎬ还因气味宜人被广泛应用于香水㊁肥皂㊁化妆品等化工领域[６]ꎻ另外ꎬ在畜禽领域ꎬ广藿香提取物作为饲料添加剂也展现出巨大潜力[７]ꎮ广藿香醇是广藿香挥发油的首要成分ꎬ其生物合成途径有两条ꎬ分别是定位于细胞质的甲羟戊酸(ｍｅｖａｌｏｎａｔｅꎬＭＶＡ)途径和定位于叶绿体的甲基赤藓糖－４－磷酸(ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ￣４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＭＥＰ)途径[８－９]ꎮＭＶＡ途径主要负责倍半萜㊁三萜和橄榄苦苷甾体的合成ꎬ而广藿香醇为三环倍半萜类化合物ꎬ因此在关于广藿香醇的分子调控和生物合成中ꎬ针对ＭＶＡ途径关键基因的作用已经进行了较多研究[１０]ꎮＭＥＰ途径除合成单萜㊁二萜㊁四萜还合成植物激素㊁光合色素[１１－１２]ꎮＭＶＡ和ＭＥＰ途径均可产生戊烯基焦磷酸(ＩＰＰ)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(ＤＭＡＰＰ)ꎬ这两种物质是合成萜类化合物的共同前体物质ꎮ１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)是ＭＥＰ途径的第一个酶ꎬ催化丙酮酸和３－磷酸甘油醛生成１－脱氧木酮糖－５－磷酸(ＤＸＰ)[１２]ꎮＤＸＳ家族可分为３个不同的亚家族 ＤＸＳ１㊁ＤＸＳ２和ＤＸＳ３ꎬ这３种类型的ＤＸＳ蛋白在保守基序组成㊁二级结构和三级结构方面具有高度相似性[１３]ꎮＤＸＳ不仅在植物萜类生物合成过程中发挥着重要调控作用ꎬ还在许多生理过程中起着重要作用ꎬ如光合作用㊁植物激素调节㊁逆境抗性和病原体防御等ꎮ过表达马尾松ＰｍＤＸＳ可以显著提高其类胡萝卜素㊁叶绿素ａ㊁叶绿素ｂ含量和ＤＸＳ活性[１４]ꎬ瞬时转化过表达天竺葵的ＧｒＤＸＳ基因能增加次生代谢物天竺葵精油中单萜和倍半萜化合物含量[１５]ꎬ提示ＤＸＳ基因在萜类生物合成途径中具有重要调控作用ꎮ迄今ꎬＤＸＳ基因已经在银杏[１６]㊁乌头[１７]㊁穿心莲[１８]㊁桔梗[１９]㊁荆芥[２０]等多种植物中完成克隆和初步研究ꎬ而从广藿香中探究ＤＸＳ基因的内容鲜见报道ꎮ本研究基于课题组前期获得的转录组数据克隆了广藿香ＤＸＳ基因ꎬ并对其进行生物信息学分析及在广藿香不同部位的表达分析ꎬ以期为今后深入研究该基因在萜类化合物代谢中的功能奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料本研究所用植物材料经广东药科大学中药学院严寒静教授鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香[Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.]ꎬ培育于广东药科大学中药学院ꎮ采集生长６个月的广藿香叶片液氮速冻ꎬ于－８０ħ超低温冰箱保存ꎬ用于ＲＮＡ提取与基因克隆ꎮ选取生长６个月状态良好的广藿香根㊁茎(第２㊁３对叶之间)㊁叶(第２对叶)㊁芽ꎬ经液氮速冻后置于－８０ħ冰箱ꎬ用于ＲＮＡ提取及组织特异性表达ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ꎮＤＨ５α感受态细胞㊁ＢＬ２１(ＤＥ３)表达菌株㊁ｐＥＴ２８ａ原核表达载体均购自北京庄盟国际生物９２㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析基因科技有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ链合成㊀将广藿香叶片样品经液氮研磨后ꎬ采用天根植物总ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡꎬ使用超微量紫外分光光度计ＵＶ２４５０测定其浓度和纯度ꎬ用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ完整性ꎮ使用ＴａＫａＲａ的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试剂盒合成ｃＤＮＡ第一链ꎮ１.２.２㊀基因克隆㊀根据课题组前期获得的转录组数据得到广藿香ＰｃＤＸＳ基因的ＣＤＳ序列ꎬ设计特异性引物(表１)ꎬ以反转录得到的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮＰＣＲ反应体系:ｃＤＮＡ１μＬꎬ上游引物ＰｃＤＸＳ－Ｆ１μＬꎬ下游引物ＰｃＤＸＳ－Ｒ１μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ２５μＬ㊁ｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ１０ｓꎬ５５ħ５ｓꎬ７２ħ１２ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ２ｍｉｎꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收ꎬ并检测浓度及纯度ꎬ使用庄盟ＺＴＯＰＯ－Ｂｌｕｎｔ/ＴＡ快速克隆试剂盒进行ＴＡ克隆ꎻ转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ经菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性克隆ꎬ送广州擎科生物科技股份有限公司测序ꎮ表１㊀引物序列引物名称用途引物序列(５ᶄ－３ᶄ)ＰｃＤＸＳ１－Ｆ基因克隆ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＰｃＤＸＳ１－ＲＴＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＰｃＤＸＳ２－ＦＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＰｃＤＸＳ２－ＲＴＴＡＧＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＣｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１－Ｆ构建原核表达载体ＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴ￣ＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１－ＲＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴ￣ＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＣＧｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２－ＦＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣ￣ＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２－ＲＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＴ￣ＴＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧ１８Ｓ－ＦｑＲＴ－ＰＣＲＴＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＣ１８Ｓ－ＲＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＣＣＡＴＡＣＴＣＣｑ－ＰｃＤＸＳ１－ＦＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣｑ－ＰｃＤＸＳ１－ＲＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧｑ－ＰｃＤＸＳ２－ＦＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴｑ－ＰｃＤＸＳ２－ＲＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＣＣＴＧ１.２.３㊀生物信息学分析㊀依照对应的生物信息学在线工具(表２)对广藿香的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２进行序列分析ꎮ从ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ比对ꎬ获得ＰｃＤＸＳ同源序列ꎬ利用ＭＥＧＡ.１１邻接法构建进化树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ值设置为１０００次重复ꎮ表２㊀在线工具、用途及网址在线工具用途网址ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ蛋白质理化性质分析ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅ疏水性分析ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａｌｅ/Ｐｌａｎｔ－ｍＰＬｏｃ亚细胞定位预测ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ/ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ跨膜结构预测ｈｔｔｐｓ://ｄｔｕ.ｂｉｏｌｉｂ.ｃｏｍ/ＤｅｅｐＴＭ￣ＨＭＭＳｉｇｎａｌＰ－６.０信号肽预测ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ￣６.０/ＮＣＢＩＣＤＳｅａｒｃｈ保守结构域分析ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉＳＯＰＭＡ二级结构预测ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ％２０＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ三级结构预测ｈｔｔｐｓ://ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/１.２.４㊀原核表达㊀设计ＰｃＤＸＳ基因与包含ｐＥＴ－２８ａ载体酶切位点的同源臂引物(表１)ꎬ构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ原核表达载体ꎮＰｃＤＸＳ基因引入ｐＥＴ－２８ａ载体同源臂反应体系为:ＴＡ－ＰｃＤＸＳ重组质粒１μＬꎬ上游引物ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ－Ｆ１μＬꎬ下游引物ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ－Ｒ１μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ２５μＬꎬｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ１０ｓꎬ５５ħ５ｓꎬ７２ħ１２ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ２ｍｉｎꎮ采用全式金ＢａｍＨⅠ酶将ｐＥＴ－２８ａ载体进行单酶切线性化ꎮＰＣＲ产物及酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收ꎬ将产物根据庄盟ＳＥ无缝克隆和组装试剂盒连接转化ＤＨ５α感受态细胞ꎬ菌液经ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性克隆ꎬ送广州擎科生物科技股份有限公司测序ꎮ将ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ质粒转化蛋白表达菌株ＢＬ２１(ＤＥ３)ꎬ经ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性菌液摇菌后ꎬ在５ｍＬ菌液中添加异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)至浓度分别为０.２５㊁０.５㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ꎬ１６０ｒ ｍｉｎ－１摇床㊁１６ħ培养１２ｈꎬ使用细胞破碎仪(ＡＭＰ２５％ꎬ开５ｓꎬ关５ｓ)破碎２ｍｉｎꎬ离心收集上清液和沉淀ꎬ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测ＰｃＤＸＳ蛋白表达情况ꎮ１.２.５㊀荧光定量ＰＣＲ表达分析㊀以转录合成的ｃＤＮＡ为模板ꎬ１８Ｓ为内参基因ꎮ根据ＰｃＤＸＳ基因的测序结果ꎬ使用Ｐｒｅｍｉｅｒ５.０设计ｑＲＴ－ＰＣＲ引物(表１)ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ采用２０μＬ反应体系:２ˑＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０μＬꎬｃＤ￣ＮＡ１.５μＬꎬ上㊁下游引物各０.４μＬꎬｄｄＨ２Ｏ７.７μＬꎮ扩增程序:９５ħꎬ３０ｓꎻ９５ħ５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ０３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀４０个循环ꎮ每个部位进行３次生物学重复ꎬ每个样品３个技术重复ꎮ采用２－әәＣｔ法计算ＰｃＤＸＳ基因在广藿香不同组织部位根㊁茎㊁叶㊁芽中的相对表达量ꎮ采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９.５软件进行单向方差多重比较分析数据ꎬ利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ作图并用字母标记法标记差异显著性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因克隆提取广藿香总ＲＮＡꎬ琼脂糖凝胶电泳显示有清晰条带ꎬ经超微量紫外分光光度计ＵＶ２４５０测定浓度和纯度合格ꎬ可用于后续实验ꎮ通过使用基因特异性引物ꎬ成功克隆获得两条序列长度为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐ的序列(图１)ꎬ测序结果与转录组序列相似度分别高达９９.９５％和１００％ꎬ分别编码７１６个和６３５个氨基酸ꎬ命名为ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＰｃＤＸＳ１基因ＰＣＲ扩增产物ꎻ２:ＰｃＤＸＳ２基因ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因克隆２.２㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白理化性质分析经ＰｒｏｔＰａｒａｍ预测分析ꎬＰｃＤＸＳ１蛋白分子式为Ｃ３４７３Ｈ５４９６Ｎ８４０Ｏ１０３８Ｓ３９ꎬ为亲水且稳定的弱酸性蛋白ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白分子式为Ｃ３００９Ｈ４７９０Ｎ８４０Ｏ８９９Ｓ２５ꎬ为亲水不稳定的弱酸性蛋白(表３)ꎬＰｒｏｔＳｃａｌｅ分析也表明ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２均为亲水性蛋白(图２)ꎮ两蛋白均定位在叶绿体ꎮ表３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ１蛋白理化性质蛋白氨基酸数分子量/ｋＤａ正电残基个数负电残基个数等电点亲水性总平均值(ＧＲＡＶＹ)脂肪系数不稳定系数跨膜区域信号肽ＰｃＤＸＳ１７１６７８.３３８４６６５.７８－０.０２８９２.３５３９.３５无无ＰｃＤＸＳ２６３５６７.９２７１６５６.３６－０.０４４９１.４５４２.８４无无正值表示疏水ꎻ负值表示亲水ꎮ图２㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白亲疏水性预测２.３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２保守结构域及二级和三级结构分析ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白保守结构域分析结果显示ꎬ两者都属于ＤＸＳ超家族ꎬ含有从Ｎ端到Ｃ端的ＤＸＰ＿ｓｙｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏ￣ｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块(图３)ꎮＰｃＤＸＳ１蛋白二级结构中无规则卷曲占比最高ꎬ为３９.８０％ꎬ还含有３７.８５％的α－螺旋㊁１５.９２％的折叠延伸链㊁６.４２％的β－折叠ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白中占比最高的是α－螺旋ꎬ为４１.８９％ꎬ还含有１５.５９％的折叠延伸链㊁８.０３％的β－折叠㊁３４.４９％的无规则卷曲(图４)ꎮ通过ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ构建了两蛋白的三级结构ꎬ对ＰｃＤＸＳ１蛋白ꎬ以叶绿体ＤＸＰＳ为模板ꎬ序列一致性５５.７８％ꎬＧＭＱＥ得分为０.６４(０~１范围内数值越大表明预期质量越高)ꎬＧＭＥＡＮ得分为１３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析０.６７(分数趋近于０反映 类似原生 的结构ꎬ低于－４.０的 ＱＭＥＡＮ 分数表示模型质量较低)ꎬ可视为获得了良好的ＰｃＤＸＳ１蛋白三级结构模型ꎮ对ＰｃＤＸＳ２蛋白ꎬ以番茄ＤＸＳ１为模板ꎬ二者的相似度高达９１.０２％ꎬＧＭＱＥ得分为０.９０ꎬ该模型可较好地预测ＰｃＤＸＳ２蛋白的三级结构(图５)ꎮ图３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白保守结构域分析结果２.４㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因系统进化分析使用ＭＥＧＡ１１构建ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２与其他物种ＤＸＳ基因的系统发育树ꎬ结果(图６)显示ꎬＰｃＤＸＳ１与半枝莲ＤＸＳ(ＭＫ０３５０４０.１)聚为一支ꎬＰｃＤＸＳ２与糙苏ＤＸＳ(ＫＵ３１７５０８.１)聚为一支ꎬ亲缘关系较近ꎮＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２之间存在系统发育距离ꎬ可能存在功能差异ꎮ蓝色表示α－螺旋ꎻ红色表示β－折叠ꎻ绿色表示β－转角ꎻ紫色表示无规则卷曲ꎮ图４㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白的二级结构图５㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白的三级结构Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ:山茶花ꎻＡｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ:猕猴桃ꎻＰｒｕｎｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ:夏枯草ꎻＧａｒｄｅｎｉａｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ:栀子ꎻＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ:马尾松ꎻＴｈｕｊａｐｌｉｃａｔａ:北美乔柏ꎻＡｑｕｉｌａｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ:土沉香ꎻＰｈｌｏｍｉｓｕｍｂｒｏｓａ:糙苏ꎻＴａｒａｘａｃｕｍｋｏｋ￣ｓａｇｈｙｚ:橡胶草ꎻＷｉｔｈａｎｉａｓｏｍｎｉｆｅｒａ:南非醉茄ꎻＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａ:半枝莲ꎻＬｙｃｉｕｍｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ:枸杞ꎻＰｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓｂａｒｂａｔｕｓ:左手香ꎮ图６㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因系统发育进化树２３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀２.５㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２原核表达分析将ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因引入同源臂与ｐＥＴ－２８ａ线性化载体连接ꎬ测序分析结果同克隆序列一致ꎬ表明成功构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１㊁ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２原核表达载体ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白分子量分别为７８.３３ｋＤａ和６７.９２ｋＤａꎬ加上Ｈｉｓ标签后蛋白大小分别约为８４.６ｋＤａ和７６.１ｋＤａꎮ将重组质粒转化ＢＬ２１(ＤＥ３)菌株ꎬ挑取阳性菌在１６ħ条件下分别用０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导表达１２ｈꎬ经细胞破碎仪破碎㊁离心㊁ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测ꎬ结果(图７)显示ꎬ在沉淀中分别有８４.６ｋＤａ和７６.１ｋＤａ的蛋白条带ꎬ说明ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２重组蛋白被成功诱导表达ꎬＰｃＤＸＳ２重组蛋白表达较少ꎬ主要在沉淀中表达ꎬＩＰＴＧ浓度变化对蛋白表达无明显影响ꎮＭ:ＢｌｕｅＰｌｕｓ®ＩＩＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ(１４~１２０ｋＤａ)ꎻ１㊁３㊁５㊁７㊁９:分别为０㊁０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.００ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达后的破碎菌体上清ꎻ２㊁４㊁６㊁８㊁１０:分别为０㊁０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达后的破碎菌体沉淀ꎮ图７㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２原核表达分析的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果２.６㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２表达的组织特异性分析结果(图８)显示ꎬＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎮ其中ꎬＰｃＤＸＳ１在叶中表达量最高ꎬ在芽和茎中表达量也较高ꎬ均显著高于在根中的表达量ꎻＰｃＤＸＳ２在茎㊁叶㊁芽中的表达量相当ꎬ且均显著高于在根中的表达量ꎮ柱上不同小写字母表示组织间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图８㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香不同部位中的表达差异３㊀讨论目前已从多种植物中挖掘出ＤＸＳ基因ꎬ并对其在萜类化合物生物合成过程中的功能进行了研究ꎬ但ＤＸＳ基因对广藿香萜类代谢调控的影响尚未见研究报道ꎮＤＸＳ基因家族具有较高的保守性[２１]ꎬ多含有ＤＸＰ＿ｓｙｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块[２２]ꎮ本研究从广藿香中克隆出两个ＤＸＳ基因(ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２)ꎬ均包含该３个保守结构域模块ꎬ符合ＤＸＳ基因家族结构特征ꎮＤＸＳ亚家族中ꎬＤＸＳ１被认为是管家基因[２３]ꎬＤＸＳ１蛋白主要在叶绿体中表达ꎬ是合成光合色素和植物激素所必需的[２４]ꎬ在植物叶片和茎的叶绿体以及果实的有色质体中大量表达[１２]ꎻＤＸＳ２蛋白位于非光合作用质体中ꎬ参与一些防御反应特异的萜类化合物的合成ꎬ优先在植物根的成熟体中表达[１２]ꎻＤＸＳ３蛋白的表达与参与胚胎后发３３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析育和繁殖的基因相关[２５]ꎮ本研究结果显示ꎬＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎬ且主要在地上部表达ꎬ在根中的表达量较低ꎬ尤其ＰｃＤＸＳ１在叶中显著高表达ꎬ符合ＤＸＳ１在光合组织中活跃的特征ꎻ亚细胞定位预测显示主要定位在叶绿体ꎬ说明ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２可能在叶绿体中发挥作用ꎮ原核表达是常见的表达外源蛋白的分子生物技术ꎬ大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)具有生长周期短㊁易于培养及遗传操纵的特点ꎬ是产生重组蛋白的重要宿主ꎬ优化重组蛋白的生物合成至关重要ꎬ常通过改变菌株的培养参数增加蛋白的表达和溶解度ꎬ用于生产重组蛋白[２６－２７]ꎮ对毛果杨ＤＸＳ蛋白进行诱导表达ꎬ在沉淀物中检测到ＰｔＤＸＳ靶蛋白[２８]ꎮ陈文意等[２９]考察了２０㊁３０ħ下ꎬ０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１和０.５ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导的广藿香Ｐｃ￣ＪＡＲ１融合蛋白表达ꎬ发现２０ħ㊁０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导下表达菌诱导蛋白在沉淀中更高表达ꎬ说明温度和ＩＰＴＧ浓度影响蛋白表达ꎮ本研究利用０.２５㊁０.５㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２重组蛋白在ＢＬ２１(ＤＥ３)中表达ꎬ结果表明两蛋白主要在沉淀中表达ꎬ表达量与ＩＰＴＧ浓度无明显关联ꎬＰｃＤＸＳ２重组蛋白在同样条件下表达量较少还可能与诱导温度和时间有关ꎮ研究发现ꎬＤＸＳ基因的表达水平一般与ＭＥＰ途径直接调控的萜类含量呈正相关ꎬ过表达薰衣草ＤＸＳ基因显著促进薰衣草精油中单萜化合物的积累[３０]ꎻ二萜类丹参酮是丹参的主要生物活性成分ꎬ丹参ＳｍＤＸＳ１和ＳｍＤＸＳ２的过表达显著增强其根系中丹参酮的积累[３１]ꎮ同时ꎬＤＸＳ基因也调控ＭＶＡ途径萜类化合物合成ꎬ其表达水平会影响ＭＶＡ途径萜类含量水平的高低ꎬ如沉默甘草ＤＸＳ基因促进了甘草毛状根中三萜类物质甘草酸的合成ꎬ而过表达ＤＸＳ基因则导致甘草酸含量下降[３２]ꎻ使用ＤＸＳ基因抑制剂氯马松(ＣＬＯ)处理檀香幼苗ꎬ倍半萜檀香醇的含量没有降低[３３]ꎮ４㊀结论本研究从广藿香中克隆得到ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２基因ꎬ其全长分别为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐꎬ分别编码７１６个和６３５个氨基酸ꎬ均定位于叶绿体ꎬ均为亲水性㊁非跨膜㊁非分泌蛋白ꎻＰｃＤＸＳ１蛋白为稳定蛋白ꎬＰｃＤＸＳ２蛋白为不稳定蛋白ꎬ均具有ＤＸＳ基因家族典型特征ꎮ原核表达分析发现两蛋白均受ＩＰＴＧ诱导表达ꎬ且主要在沉淀中表达ꎬ表达水平在不同ＩＰＴＧ浓度间无明显差异ꎮ两基因在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎬ但在根中的表达量均较低ꎬＰｃＤＸＳ１主要在叶中表达ꎬＰｃＤＸＳ２在茎㊁叶㊁芽中的表达量均较高且相当ꎮ这为深入研究ＤＸＳ基因在调控广藿香萜类化合物合成中的作用奠定基础ꎮ为此ꎬ本课题组已构建ＤＸＳ基因的过表达载体和沉默载体ꎬ期望通过进一步研究揭示其表达与广藿香有效成分积累之间的关系ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０２０:４６.[２]㊀ＸｕＦＦꎬＣａｉＷꎬＭａＴꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｕｓｅｓꎬｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙꎬｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌꎬｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｐｈａｒｍａ￣ｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｎｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ:ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０２２ꎬ５０(３):６９１－７２１.[３]㊀ＰｅｎｇＸＪꎬＡｎｇＳꎬＺｈａｎｇＹＺꎬｅｔａｌ.ＣｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２２ꎬ１０:９３８８５１. [４]㊀ＦａｔｉｍａＳꎬＦａｒｚｅｅｎＩꎬＡｓｈｒａｆＡꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐａｃｈｙｐｏｄｏｌ:ａｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｏｆａｎａｒｏｍａｔｉｃｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎＢｅｎｔｈ.[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２３ꎬ２８(８):３４６９.[５]㊀ＶａｎＢｅｅｋＴＡꎬＪｏｕｌａｉｎＤ.ＴｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉꎬＰｏｇ￣ｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＦｌａｖｏｕｒａｎｄＦｒａｇｒａｎｃｅＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ３３(１):６－５１.[６]㊀ＳｗａｍｙＫＭꎬＳｉｎｎｉａｈＲＵ.Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｐｈｙ￣ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰｏｇ￣ｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎＢｅｎｔｈ.:ａｎａｒｏｍａｔｉｃｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１５ꎬ２０(５):８５２１－８５４７. [７]㊀高阳ꎬ杜鑫ꎬ马雪ꎬ等.广藿香提取物在动物生产中的应用[Ｊ].黑龙江畜牧兽医ꎬ２０２３(２１):４９－５３.[８]㊀ＣｈａｐｐｅｌｌＪ.Ｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｉｓｏｐｒｅ￣ｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１０７(１):１－６. [９]㊀ＲｏｈｍｅｒＭ.Ｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｍｅｖａｌｏｎａｔｅ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｆｏｒｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａꎬａｌｇａｅａｎｄｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｐｏｒｔｓꎬ１９９９ꎬ１６(５):５６５－５７４. [１０]张婵ꎬ姚广龙ꎬ张军锋ꎬ等.广藿香百秋李醇分子调控及合成生物学研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０２１ꎬ３７(８):５５－６４.[１１]ＡｒｅｎｄｔＰꎬＰｏｌｌｉｅｒＪꎬＣａｌｌｅｗａｅｒｔＮꎬｅｔａｌ.Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌａｎｄｎｅｗ￣ｔｏ￣ｎａｔｕｒｅｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｉｎｐｈｏｔｏｓｙｎ￣ｔｈｅｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１６ꎬ８７(１):１６－３７.４３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[１２]ＧａｎｊｅｗａｌａＤꎬＫｕｍａｒＳꎬＬｕｔｈｒａＲ.Ａｎａｃｃｏｕｎｔｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｏｆｍｅｔｈｙｌ￣ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ￣４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐａｔｈｗａｙｏｆｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎ￣ｔｈｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１１(ｓ１):３５－４５.[１３]ＴｉａｎＳＫꎬＷａｎｇＤＤꎬＹａｎｇＬꎬｅｔａｌ.Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗｏｆ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅ￣ｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬ２０２２ꎬ９６:２２１－２３５. [１４]ＬｉＲꎬＣｈｅｎＰＺꎬＺｈｕＬＺꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅ１￣ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｇｅｎｅｒｅｌａｔ￣ｅｄｔｏｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２１ꎬ２２(２):８４８.[１５]ＪａｄａｕｎＪＳꎬＳａｎｇｗａｎＮＳꎬＮａｒｎｏｌｉｙａＬＫꎬｅｔａｌ.Ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＸＳｇｅｎｅｅｎｈａｎｃｅｓｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅａｃｃｕ￣ｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｒｏｓｅ￣ｓｃｅｎｔｅｄｇｅｒａｎｉｕｍａｎｄＷｉｔｈａｎｉａｓｏｍｎｉｆｅｒａ:ａｃ￣ｔｉｖｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｐｌａｓｔｉｄｉｓｏｐｒｅｎｏｇｅｎｉｃｐａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅｉｒｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍꎬ２０１７ꎬ１５９(４):３８１－４００. [１６]ＧｏｎｇＹＦꎬＬｉａｏＺＨꎬＧｕｏＢＨꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＤＸＳｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ１￣ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅꎬｔｈｅｆｉｒｓｔｃｏｍｍｉｔｔｅｄｅｎ￣ｚｙｍｅｏｆｔｈｅ２￣Ｃ￣ｍｅｔｈｙｌ￣Ｄ￣ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔａＭｅｄｉｃａꎬ２００６ꎬ７２(４):３２９－３３５.[１７]ＳｈａｒｍａＥꎬＰａｎｄｅｙＳꎬＧａｕｒＡＫ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＸＳ１ｇｅｎｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｃｏｎｉｔｕｍｂａｌｆｏｕｒｉｉＳｔａｐｆ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅＰｌａｎｔａｒｕｍꎬ２０１６ꎬ３８:２３３.[１８]ＳｒｉｎａｔｈＭꎬＳｈａｉｌａｊｉＡꎬＢｉｎｄｕＢＢＶꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｉｎＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｐａｎｉｃｕｌａｔａ(Ｂｕｒｍ.ｆ)Ｎｅｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ６３:１０９－１２４. [１９]董楠ꎬ余函纹ꎬ刘梦丽ꎬ等.桔梗ＤＸＳ基因的原核表达㊁亚细胞定位和酶活性分析[Ｊ].药学学报ꎬ２０２３ꎬ５８(４):１０５９－１０６８.[２０]林谷音ꎬ周佩娜ꎬ尹梦娇ꎬ等.荆芥１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析[Ｊ].中草药ꎬ２０２１ꎬ５２(２):５２７－５３７.[２１]毛积鹏ꎬ黄林旺ꎬ郝静ꎬ等.植物ＤＸＳ基因的系统发育和分子进化分析[Ｊ].生物学杂志ꎬ２０２２ꎬ３９(２):２３－２８. 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广东省立法保护的岭南道地药材(二)
有报 道 广陈 皮 富含 挥发 油 ， 可达１ ． ２ ％～
・
：
、
图１ ０ 橘
图 １ Ｉ 药 材 陈 皮
图ｌ ２ 药 材 广陈 皮
２ ． ３ ． ２ 生 产现状
广 陈皮 今为 名贵药 材 ， 为广 东道
地药 材 “ 十 大广 药 ” 之 一， 出 口名 牌 药 材 ， 为 整 体 纵 开 ３～ ４瓣 ， 基部 相连 ， 果皮 肉质 较厚 １～ ２ ｍ ｉ ｌ ｌ ， 表 面 橙红 青黄 色 ， 有 干皱 纹 ， 密 布 大 而 均 匀 的 凹 陷 的 油 室； 内表 面淡黄 色 ， 粗糙 有 麻点 ， 较疏 松 ， 有 分布 不均
方 果也 ， 而闽、 广、 温、 台、 苏、 抚、 荆 州为 盛 ， 川 Ｉ 蜀虽有
匀 的海绵状 筋 络 ， 油室 孔 眼稍 凹下 ， 对 光视 可见 油室 孔 眼清 晰透亮 ， 排列 紧 密 圆 大 的油 室 ， 质柔软 ， 富 弹 性， 气 清香 ， 味 甘微 辛 ， 嚼 之 又麻 舌 感 。 因广 陈 皮 的 珍贵 ， 往 时果农 采 取 “ 卖 果 留皮 ” 之 法 收集 果 皮 ， 今 则 主要来 自罐 头厂 。 ２ ． ３ ． ３ 诸 家论述 广 陈 皮 究竟 何 时 人 药 的 呢？ 据 《 证类 本草 ・ 乳 柑子 》 条有 “ 陈藏 器 ： 产 后 肌浮 ， 柑皮 为末酒 下 ” 。《 开宝 本 草 》 说： “ 山柑 皮疗 咽 喉痛 效 ， 余 者 皮不堪 用 。其树若 橘 而圆大 ， 皮色 生青 熟黄 ， 未
岗梅根的功效与作用
岗梅根的功效与作用岗梅根，为冬青科植物梅叶冬青的根，主产于广西、广东、湖南、江西、福建、台湾等地。
含有冬青苷XXIX、冬青苷B、刺参苷F、长圆冬青苷B、毛冬青皂苷B、毛冬青酸和19-去氢乌索酸等成分。
有清热、生津、散瘀、解毒的作用。
主治感冒、头痛、眩晕、热病烦渴、痧气、热泻、肺痈等症。
一、生津止渴岗梅根有润肺止渴，可治热病烦渴、喉痛口渴、咳血、痧气。
可配麦冬，养阴润肺、生津止渴。
配丹皮，可增强清热、凉血、养阴生津的功效。
二、清热解毒岗梅为岭南地区道地药材,也是王老吉凉茶、沙溪凉茶等广东凉茶的主要原料。
其味苦性寒,具有清热解毒之功效,被广泛用于治疗热病、燥渴、热泻、咳血和喉痛、疔疮肿毒等。
可配牛蒡子，以增强滋阴清热、疏散风热之力。
三、活血散瘀岗梅根还有活血化瘀的作用，可治跌打损伤，岗梅根鲜者二两(切片酒炒)，鸡一只。
水酒各半炖服。
《生草药性备要》：“杀虫，理跌打损伤。
”四、营养价值对岗梅根的70％乙醇提取物进行了系统的化学成分研究,从中分离得到了三萜及其皂苷类化合物,分别鉴定为冬青苷XXIX、冬青苷B、刺参苷F、长圆冬青苷B、毛冬青皂苷B、毛冬青酸和19-去氢乌索酸。
1、用离体豚鼠心脏灌流岗梅注射液有增加冠脉流量、加强心收缩力的作用；在家兔以垂体后叶素引起的急性心肌缺血的心电图上，对T波的改变（高耸）有保护作用，S-T段偏移及节律紊乱亦有一定减少。
2、将岗梅根制成100％注射液，使用于外伤骨折、烧伤、泌尿系结石、肠梗阻、脑血管意外，用于防治各种感染。
3、岗梅鲜根四两，鲜金银花、凤尾草各二两。
煎水服。
或岗梅根加水在锈铁上磨汁内服，治食野菌或砒霜中毒。
三种岭南中草药化学成分的研究的开题报告
三种岭南中草药化学成分的研究的开题报告一、选题背景岭南地区人才辈出，物种丰富，地处南亚热带气候区，森林分布密集，具有许多中草药资源。
这些中草药因为生长环境的影响，其成分和功效与其他地区中草药有所不同，拥有独特的疗效。
为了挖掘和利用这些岭南地区的中草药资源，必须对其进行深入的研究。
本文将选择三种岭南地区中草药进行化学成分的研究。
二、研究目的本次研究的主要目的是探究三种岭南地区中草药的化学成分。
通过对其主要成分和功效的分析，探究其在临床上的应用价值。
三、研究对象本次研究将选择三种岭南地区中草药进行研究，其中包括：1. 五味子：五味子是一种常见的中药材，其主要功效是滋补肝肾、润肺止咳。
其化学成分主要包括五味子酸、五味子乙酸等。
2. 石斛：石斛是一种常见的中药材，其主要功效是滋阴补肾、养气安神。
其化学成分主要包括石斛多糖、石斛苷等。
3. 红景天：红景天是一种常见的中药材，其主要功效是抗氧化、抗衰老、抗疲劳。
其化学成分主要包括红景天苷等。
四、研究方法本次研究将采用以下方法进行：1. 提取：采用水、醇等多种溶剂进行提取。
2. 分离：通过纯化、柱层析等方法，对提取物进行分离和提纯处理。
3. 鉴定：采用HPLC、GC-MS等方法进行鉴定，确定其主要成分。
4. 功效研究：通过实验验证其在临床上的应用价值。
五、预期成果通过对三种岭南中草药的化学成分研究，预期可以得到以下成果：1. 确定三种中草药的主要成分。
2. 揭示三种中草药的功效和特点。
3. 探究其在临床上的应用价值。
4. 为中草药的研究和开发提供一定的参考和指导。
以上是本文选题的开题报告，仅供参考。
岭南特色药材知识产权保护之探讨
岭南特色药材知识产权保护之探讨
陈贤春
【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》
【年(卷),期】2004(006)005
【摘要】我国岭南地区地处热带、亚热带,气候温暖,地热、水热资源丰富,适合多种动植物生长繁育,中药资源品种丰富,分布广,产量大,有不少质量上乘的道地药材,素有"广药"之称.作者探讨岭南特色药材知识产权保护问题,提出了采用原产地域产品保护、特色药材专利保护和商标战略保护等措施.
【总页数】3页(P48-50)
【作者】陈贤春
【作者单位】广州中医药大学,广州,510405
【正文语种】中文
【中图分类】R2
【相关文献】
1.基于DNA条形码的岭南特色药材广东海桐皮、木棉花与其混淆品的分子鉴定[J], 黄娟;徐文;谭瑞湘;白俊其;李西文;黄志海
2.岭南特色药材现代化开发初探 [J], 陈贤春;荣莉
3.中药材茯苓农业知识产权保护与产业兴旺研究 [J], 孙元鹏; 吴喆; 孙燕玲; 程正; 司马学琴
4.中药材遗传资源知识产权保护问题及对策 [J], 李鹏蕾
5.后中药材GAP时代下道地药材的知识产权保护路径探析——以广西壮族自治区为例 [J], 蔡月
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建设岭南药博物馆
• 二、岭南药植物园 • 在原有岭南中草药圃的基础上增设岭
南民族药苑，专门收集栽培岭南民族 药品种，并逐年增加新品种，争取3年 后达到近千个品种。用于教学科研、 科普。
• 三、岭南药数字博物馆网站
• 包括：岭南药原植物图片库、岭南药 饮片与药材图片库、岭南药显微鉴定 图片库。在人机交互上可采用多种途 径检索，以满足不同专业学生及公众 的需求。设立岭南药科普园地、中医 药专家在线答疑、岭南药博物馆新闻 窗等栏目
•积极响应政府号召，建设 广东中医药强省，建成一 个特色突出、风格优雅、 内容充实、具有现代化管 理的大型岭南药博物馆。
十大广药
十大广药产粤乡， 新会陈皮广藿香； 春砂化橘南肉桂， 连州玉竹雷州姜； 首乌巴戟德庆产， 肇庆芡实美名扬。
建设岭南药博物馆
2021年8月20日星期五
• 充分利用学科优势和地域优势，系统 整理有关岭南中草药自然资源、地理 环境、历史文化背景、临床应用及开 发利用等方面的资料，建设一个特色 突出、风格优雅、内容充实、具有现 代化管理的大型岭南药博物馆。
• 为加强中医药专业教学，搭建岭南药 科研平台服务；
• 一、岭南药标本馆 • 岭南药标本馆包括6个分馆： • 岭南药文献分馆――收集展示有关岭
南中草药的历史、人物、传说、故事、 书籍等，并定期开展群众性的文学作 品征集和参赛活动。
• 岭南药艺术分馆――收集展示有关岭南 中草药的绘画、摄影及造型艺术等作 品，并定期开展群众性的绘画、摄影、 插花、盆景比赛等活动。
• 建馆条件与基础： • 中药博物馆具备申请国际代码的资格。 • 中药博物馆设有岭南草药、粤北瑶族
民间药等专柜。
• 药圃栽培药用植物600余种，除栽培岭 南地道药材30余种外，还特设岭南草 药苑,收集栽培岭南草药60余种。
首届岭南中药材保护研讨会暨岭南中药材保护品种展举行
首届岭南中药材保护研讨会暨岭南中药材保护品种展举行
首届岭南中药材保护研讨会暨岭南中药材保护品种展举行为学习贯彻*总书记视察广东重要讲话精神，贯彻落实《广东省岭南中药材保护条例》，由广东省中医药局、广州中医药大学指导，广东中医药博物馆主办的首届岭南中药材保护研讨会暨中药材保护品种展览于近日在粤举行。
广东省卫生健康委副主任、省中医药局党组书记、局长徐庆锋等出席开幕式。
研讨会上，与会专家围绕岭南中药材保护、岭南中医药文化保护、中医药人才培养、广东省岭南中药材保护条例释义等主题进行探讨。
广州中医药大学党委副书记翟理祥作了《中医药发展与人才培养》的报告，从中医药人才培养的角度阐述人才对于中医药发展的重要性，并对如何培养优秀的中医药人才提出新观点;广州中医药大学潘华峰副校长与各位代表探讨《岭南中医药文化的传承与传播》，从岭南中药材资源丰富、岭南中医药文化特色、岭南中医药文化传播几方面清晰论述岭南中医药文化保护的重要性以及传承传播方式;广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺主任跟大家分享《岭南中药的传承保护与研发应用的实践与思考》。
同期，岭南中药材保护品种展览在广东省江门新会陈皮村举行，展出了化橘红、广陈皮、阳春砂仁等8种首批被列入《广东省岭南中药材保护条例》的中药材。
农业农村部对十三届全国人大四次会议第7892号建议的答复
农业农村部对十三届全国人大四次会议第7892号建议的答复文章属性•【制定机关】农业农村部•【公布日期】2021.07.12•【文号】农办议〔2021〕151号•【施行日期】2021.07.12•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】种植业正文对十三届全国人大四次会议第7892号建议的答复农办议〔2021〕151号黄汉标等5名代表：你们提出的关于支持广东省云浮市创建“一带一路”药用资源（南药）种质库的建议收悉。
经商财政部、外交部、国家发展改革委，现答复如下。
一、关于支持云浮市探索构建南药种业体系我部一直高度重视中药材种业发展。
一是强化顶层设计。
2018年底，我部与国家药品监督管理局、国家中医药管理局联合印发《全国道地药材生产基地建设规划（2018—2025年）》，明确提出，保护利用道地药材种质资源，开展联合攻关，推进特色品种提纯复壮，加快选育一批新品种，加快建设一批道地药材种子种苗繁育基地，提高道地药材供种供苗能力。
加强种子（苗）质量监管，实施品种登记制度，强化品种保护和监管。
二是推动建设中药材良种繁育基地。
2019年，我部开展了第二批国家区域性良种繁育基地认定工作，首次认定了甘肃陇西等8个国家中药材种子区域性良种繁育基地，并纳入现代种业提升工程支持范围。
三是完善中药材相关技术标准。
制定道地药材标准框架，建立健全生产技术、产地初加工、质量安全等标准体系。
截至2020年底，相关部委共制修订了43项（现行有效）中药材国家标准和行业标准，涉及中药材发展的生产技术、防病技术、加工技术、包装技术及质量评价技术等技术，基本实现有标可依。
下一步，我部将继续加大对中药材种业发展支持力度。
一是适机启动国家区域性良种繁育基地认定工作，云浮市可根据有关工作要求申报。
二是结合实施《“十四五”现代种业提升工程建设规划》，围绕种质资源保护、育种创新、测试评价、良种繁育四个关键环节，加大对中药材种业支持力度，完善种业基础设施体系。
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② 建立 GA 规范化种植基地； ③ 建立品质评价的体系。 项目完成后的主要成果 ① 野生转家种繁育基地建立 ②GA 规范化种植基地建立
③种质资源品质评价的建立. 项目的主要用途和使用范围为岭南道地药材毛冬青等资源的可持续发展为广东 省名牌中成药企业的可持续发展奠定物质基础。
岭南道地药材毛冬青等规范化种植及种质资源品质评价的 研究
研究时间：
2008
研究单位： 广州中医药大学 研究者： 丁平
研究领域:
中药与天然药
内容简介:
项目主要研究毛冬青、救必应是广东及岭南地区常用的道地药材广泛用于中成药 及凉茶的制剂中。但由于近几年来用量的巨增资源面临着濒危的局面直接影响着 我省优质名牌中成药的生产和走向国际化基于此本项目进行如下研究：野生转家 种的实验研究；GA 规范化种植的研究；种质资源的收集及品质评价的研究。