我的小熊软糖里有没有猪肉提取物

我的小熊软糖里有没有猪肉提取物？通过LC-MS/MS进行明胶种类鉴定

作者：Chor Teck Tan1 和Stephen Lock2

1AB SCIEX公司新加坡；2AB SCIEX 公司, 英国沃灵顿

概览

来自不同物种的肉类和动物产品的无意或欺骗性混合严重关系

到消费者的禁食伦理，诸如犹太人和穆斯林社区就禁食猪肉和

马肉。在这项工作中，我们展示了一种基于AB SCIEX

TripleTOF®5600和4000QTRAP® LC/MS/MS系统，用来检测

食品以及药物胶囊中所用明胶的来源的LC-MS/MS（液相色谱质

谱联用仪）方法的初步发展成果。

简介

英国食品标准局（FSA）今年一月份发出的通告称：在几家连锁超市的牛肉产品中均发现有马和猪的DNA，随后在欧洲及周边地区的进一步检测显示普遍存在此类食品污染问题。为了经济利益故意掺假或者肉类制品粗心导致的错误申报，对于从伦理或宗教上不能接受猪或马消费的消费者而言，这是个严重的问题，尤其是对约占全球人口23%的穆斯林或犹太教社区，更是如此。由于宗教原因，对食品中猪和马的含量属于零容忍，检测限（LOD）要求尽可能低，因此继续开发更敏感的检测方法是必要的。

然而猪肉制品不仅用作食用肉类，而且还可以用于食品（如糖果、冰淇淋和棉花糖）以及化妆品和制药工业中的明胶。明胶是由胶原蛋白制成。胶原蛋白是一种蛋白质，是从动物（如牛、鸡、猪或鱼）的皮肤、骨骼及结缔组织中提取的。提取出的胶原部分水解形成明胶。明胶是多肽和蛋白质的混合物，可以以片状、颗粒或粉末的形式使用。

在生产明胶的过程中，蛋白通常在热水或酸性条件下进行水解。这样生产出的明胶经净化后用于食品生产，这种工艺可能会再次涉及高温。在这些条件下，最初动物的物种特异性DNA常常发生变性或被去除掉了，这使得通常用于物种鉴定的聚合酶链式反应（PCR）很难甚至无法用于明胶鉴定。另一种基于蛋白质的替代方法，ELISA法（酶联免疫吸附测定），也一直用于物种鉴定。但这种方法也有局限性，包括它检测到的仅仅是蛋白的一部分而不是多蛋白标志物。因此这种方法存在造成假阴性和阳性的风险。

LC-MS/MS方法可以检测多个胰蛋白酶肽并将其标志进行确认, 所以相对于PCR或ELISA法，它可以为明胶形态的鉴定提供更精确可靠的方式。标志物的初步鉴定是利用高分辨率质谱仪（AB SCIEX TripleTOF®5600系统与 Eksigent LC 系统结合使用）进行鸟枪蛋白质组学。在这种研制出的方法中使用的AB SCIEX 4000 QTRAP®系统，采用多反应监测（MRM）方法来检测标志物，随后该标志物会自动触发增强型子离子扫描（EPI），提供额外的序列信息来进一步确定多肽和蛋白质，最终确定明胶物种。

步骤 时间 A (%) B (%) 0

0.0 95.0 5.0 1 2.0 95.0 5.0 2 12.0 60.0 40.0 3 12.5 10.0 90.0 4 13.0 95.0 5.0 5

19.0

95.0

5.0

实验部分

样品制备

每种样品（5mg ）溶解在600μL 浓度为50mM （毫摩尔每升）的碳酸氢铵缓冲液（37℃下保持10〜15分钟）。这个提取物用胰蛋白酶（在碳酸氢铵缓冲液中浓度为50mM ）消化，胰蛋白酶与样品的比例为1:100，消化过程或者在37℃下过夜（10-15小时），或者使用微波消解方法。微波消解方法将样品放置在冰上以接受5次每次30秒的微波消解，每次微波消解之间震荡样品。

一旦消解，样品即被离心（转速为12,000 rpm ，并持续5分钟）。小心除去最上层的清液（500µL ），不扰动底部沉积物，并再次离心（转速为12,000 rpm ，并持续5分钟）。对上层清液的顶层部分（200µL ）被用于分析。

LC-MS/MS （液相色谱质谱联用仪）

胰蛋白酶消解的猪肉胶和牛明胶, 其物种特异性肽段的初步鉴定由鸟枪蛋白质组学方法完成。该方法将高分辨率高精度的AB SCIEX TripleTOF ® 5600系统与Eksigent ekspert™ultraLC 100-XL 系统结合使用。在这些测定实验中在250μL/min 流速下使用45分钟的梯度，使用菲罗门色谱柱Aeris 大孔色谱柱进行多肽的分离。信息相关扫描（IDA ）方法可用于从TOF-MS 扫描的信息中自

动触发30 TOF-MS/ MS 图谱。使用MarkerView ™软件进行主成分分析，这些分析结果随后被用来确定物种特异性标志物（如图1 和2所示）。

图 2. 两组猪的标志物混合物的TOF-MS 以及 TOF-MS/MS 数据， TripleTOF ®数据被用来开发MRM 方法.

7个标志物被加以标识，而且该方法被转移到AB SCIEX 4000Q TRAP ®系统，这个系统对每个标志物的多反应监测（MRM ）离子对信息进行了优化。在最终筛选法里使用表1中显示的梯度，样品在一个C18柱上得到分离，其中流动相A 为水，流动相B 为乙腈，二者的流动相均含有0.1％甲酸。流速设为250 μL/min ，柱温为40℃，进样体积为20µL 。

表格 1. 在250 µL/min 流速下，液相质谱（LC ）用于分离的梯度条件

图1. MarkerView™软件用于识别明胶形态的特征标志，牛、猪和鱼的

PCA 得分图（左）和PCA 载荷显示特性标志物（右）

在经优化的方法中，Turbo V™离子源条件为：气体1和气体2设定在30 psi ；气帘气设定为30 psi ；离子源温度设为450℃；IS 电压设为5500V 。

表2给出了最强烈标志物的MRM 离子对条件。另外，为每种多肽标志物监测到3对定性离子对。在20毫秒的驻留时间内扫描到MRM 离子对信息并用作IDA 触发器以自动扫描全扫描EPI 谱图，以鉴定明胶标志物。