广东虫草对免疫功能低下小鼠自然杀伤细胞活性的影响

广东虫草对免疫功能低下小鼠自然杀伤细胞活性的影响采用环磷酰胺腹腔注射建造免疫功能低下小鼠模型，通过灌胃分别给予纯净水、生理盐水、人参乌鸡口服液以及广东虫草子实体作为正常对照组、模型对照组、阳性对照组以及样品组，灌胃量均为0.02 mL/g·bw·d。

经酶标仪检测吸光度值，以胸腺指数、脾脏指数及自然杀伤细胞活性为指标来评价各组小鼠的免疫水平。

结果显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠胸腺指数、脾脏指数均极显著性减轻（P＜0.01），自然杀伤细胞活性显著性降低（P＜0.05）；广东虫草样品组的脾脏指数（0.46%）显著高于模型对照组（0.21%），并且接近正常对照组（0.47%）和阳性对照组（0.50%）；同时，广东虫草样品组的自然杀伤细胞活性（31.96%）显著高于模型对照组（26.07%），并且接近阳性对照组（31.76%）及正常对照组（35.16%）。

表明广东虫草子实体具有显著增强免疫功能低下小鼠自然杀伤细胞的作用，并可使其免疫力恢复到接近健康动物的正常水平，具有良好的免疫调节作用。

新资源食品；广东虫草子实体；免疫调节功能广东虫草（Cordyceps guangdongensis）子实体于2013年1月被国家卫生部正式批准为新资源食品，其安全无毒[1]，具有良好的抗疲劳[2]、抗氧化[3]、抗禽流感病毒[4]、延长果蝇寿命[5]、防治慢性肾衰竭[6]等作用，但广东虫草子实体调节免疫力方面的研究尚未报道。

笔者就广东虫草子实体对免疫功能低下小鼠自然杀伤细胞功能的影响进行探讨，以期为广东虫草子实体免疫调节剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法1.1供试菌株广东虫草（C. guangdongensis）子实体由广东省微生物研究所真菌资源研究室提供，批号为：CG12043。

1.2主要仪器及试剂Multiskan GO全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司，中国）；Hank’s，批号为13051508 （杭州吉诺生物医药有限公司，中国）；含1% 青链霉素RPMI1640培养基，批号为：NXC0599（Hyclone公司，美国）；胎牛血清FBS （Biological Industries公司，以色列）。

乳酸锂、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）、Triton X100及台酚蓝均由广州威佳科技有限公司提供。

RPMI1640完全培养液：在500 mL RPMI1640培养液中加入5.6 mL青霉素链霉素溶液（100×），胎牛血清56 mL，混匀。

LDH基质液：将5×10-2 mol/L乳酸锂、6.6×10-4 mol/L INT、2.8×10-4 mol/L PMS、1.3×10-3 mol/L NAD溶于0.2 mol/L的TrisHCl缓冲液中（pH 8.2），现配现用。

人参乌鸡口服液由北京同仁堂健康药业股份有限公司生产，成人临床推荐用量为0.1667 mL/kg·d，批号为1205011；环磷酰胺由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号为12010825；生理盐水由广东利泰制药股份有限公司生产，批号为11100852。

1.3实验动物及饲养条件无特定病原物（SPF）级BALB/c小鼠，体重19.5～22.4 g，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：0116838。

饲养于广东省医学实验动物中心SPF级动物实验室，环境设施合格证：SYXK（粤）20080002；室温20～26 ℃，湿度40%～70%，采用10 h∶14 h昼夜间断照明；动物分笼喂养，每笼11只，自由饮水、进食。

颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供。

1.4剂量设计广东虫草子实体剂量设计依据为：按体重60 kg的成人每天临床用量为 3 g 原材料计算，得出临床用量为0.05 g/kg·d。

小鼠按人临床用量30倍设计剂量，为1.5 g/kg·d。

样品浓度为0.075 g/mL。

闫文娟，等：广东虫草对免疫功能低下小鼠自然杀伤细胞活性的影响1.5分组及免疫力低下小鼠模型的建造按体重将44只雄性小鼠随机各分为4组，即正常对照组、模型对照组、阳性对照组及试验样品组，每组11只小鼠，实验期间动物自由进食、饮水。

除正常对照组外，其它组小鼠分别在实验的第20、22、24、26、28天进行给药造模，每次按0.02 mL/g·bw腹腔注射2.5 mg/mL环磷酰胺药液，用于建造免疫抑制小鼠模型，正常对照组腹腔注射等量生理盐水，共注射5次。

通过灌胃分别给予纯净水、生理盐水、人参乌鸡口服液以及广东虫草子实体作为正常对照组、模型对照组、阳性对照组以及样品组，灌胃量均为0.02 mL/g·bw·d，连续给药30 d。

1.6脾细胞悬液制备在第30天灌胃给药1 h后，解剖小鼠，无菌取出胸腺、脾脏，并称量其重量，计算脏器指数。

同时将脾脏置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。

经200目筛网过滤。

弃上清，将细胞浆中加入0.5 mL灭菌水，20 s，裂解红细胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，离心（96 g，10 min），用1 mL RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为每毫升2×107个。

1.7自然杀伤细胞活性检测取靶细胞和效应细胞各100 μL（效靶比50∶1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5% Triton X100各100 μL；上述各项均设三个平行孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h，离心（144 g，5 min），每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，室温反应5 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，在酶标仪490 nm处测定光密度值（OD）。

采用SPSS16.0方差分析进行差异显著性检验。

NKCA（%）=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100%2 结果与分析当效靶比为50时，利用酶标仪测定吸光度值，计算NKCA，结果见表1。

与正常对照组相比，模型对照组小鼠胸腺指数、脾脏指数均极显著性减轻（P＜0.01），NKCA显著性降低（P＜0.05）；与模型对照组相比，阳性对照组小鼠的胸腺指数和脾脏指数，以及样品组的脾脏指数极显著性增加（P＜0.01），阳性对照组及样品组的NKCA显著性增加（P＜0.05）。

表 1 不同处理对免疫功能低下小鼠胸腺指数、脾脏指数以及自然杀伤细胞活性（NKCA）的影响Table 1 Effect of different treatments on spleenand thymus indices，and natural killer cell activity，in immunedeficient mice组别Group胸腺指数Thymus index （%）脾脏指数Spleen index （%）自然杀伤细胞活性NKCA（%）正常对照组Normal control0.12±0.030.47±0.0935.16±7.98模型对照组Model control0.03±0.01**0.21±0.04**26.07±7.28*续表组别Group胸腺指数Thymus index （%）脾脏指数Spleen index （%）自然杀伤细胞活性NKCA（%）人参乌鸡口服液#Ginseng chicken oral liquid0.05±0.02△△0.50±0.18△△31.76±7.77△广东虫草子实体组Cordyceps guangdongensis fruit body 0.03±0.010.46±0.19△△31.96±6.62△数据为10只小鼠的平均值±标准误，与阴性对照组比较，*P＜0.05 ，**P ＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01 *或**表示与正常对照组比较P＜0.05或P＜0.01的差异显著性Stomachs of test mice were perfused with 0.02 mL/g·bw·d of a aqueous suspension （0.075 g/mL）of powdered C. guangdongensis fruit bodies. # Ginseng chicken oral liquid （Catalogue No. 1205011），（Beijing Tongrentang Co. Ltd，Beijing，China）Values representthe means（n=10）±SD；* and ** indicate significant differences at P <0.05 and P <0.01，respectively compared with the normal control group；△and △△indicate significant differences at P <0.05 and P <0.01，respectively compared with the model control group3 小结广东虫草子实体是继蛹虫草之后第二个被国家卫生部批准的虫草类新资源食品。

前期研究表明，广东虫草子实体具有与冬虫夏草相似的有效成分和相近的活性功能。

在本实验条件下，广东虫草子实体在1.5 g/kg·d的剂量时（相当于推荐用量）可显著增加免疫功能低下小鼠的脾脏指数和自然杀伤细胞活性，并使其接近正常动物的水平。

有研究表明，自然杀伤细胞是机体中不同于T、B 淋巴细胞的一类淋巴样细胞，主要分布于脾脏和外周血，是机体免疫防御系统的第一道防线[79]。

因此，我们推测，广东虫草子实体可通过促进脾脏生成自然杀伤细胞，以及直接增强自然杀伤细胞的活性，从而增强机体的固有免疫力来发挥免疫调节的作用。

这与冬虫夏草的免疫调节作用是一致的[10]。

下一步，将对其免疫调节的作用机理做深入研究。

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