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western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
《westernblot讲解》PPT课件
K和ɑ为常熟，de为蛋白质移动距离，do为小 分子示踪物的移动距离。
22
精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
24
精选课件ppt 25
19
精选课件ppt 20
图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
21
注释
精选课件ppt
SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
8
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仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
9
样品制备
精选课件ppt
样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
7
试剂及仪器准备
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TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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图像分析
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将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
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注释
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SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
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仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
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样品制备
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样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
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试剂及仪器准备
western blot技术 ppt课件
•
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实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为 1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物 素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释 液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液， 用1×TBST洗3次，每次5min。
PPT课件
7
仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
PPT课件
Western-blot 试验技术
PPT课件
1
概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 • 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 • 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
主要试剂
• • • • • • • • • • • • RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）
蛋白质印迹法westernblot应用介绍幻灯片PPT
(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
凝胶浓度（％） 6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶〔别离胶〕
静置1h后制上层胶〔浓缩胶〕 2、配制上层胶〔浓缩胶〕
加完后插上梳子，静置1h
制胶
制胶过程本卷须知：
➢操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 ➢加完别离胶后胶，加水液封时要很慢，否那么胶会 被冲变型。 ➢灌胶时开场可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 ➢别离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
Western Blot流 程
收集蛋白样品
(Protein sample preparation)
〔1〕贴壁细胞蛋白样品收集
分屡次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 参加PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心
收集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心
Western Blot 介 绍
蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克〔George Stark〕。在尼尔·伯奈特〔Neal Burnette〕于 1981年所著的?分析生物化学?〔Analytical Biochemistry〕中首 次被称为Western Blot。
Western Blot PPT
低背景高信噪比近红外荧光的波长范围在700800nm之间避开了nc膜pvdf膜微孔板等耗材的本底信号提高了检测的信噪比和相对灵敏度红外荧光直接检测膜上抗原一抗结合红外标记的二抗odyssey直接扫描infrareddyeird800alexa680不需要底物不需要底片暗室信号持久5302013双色
Western Blot实验及检测方法探讨
5/30/2013
In-Cell WesternTM Assay
（磷酸化、细胞处理效果和药物筛选的最佳选择）
The In-Cell Western (ICW) Assay is a high-throughput approach to simultaneously detect and quantify two separate proteins directly within cells.
INTENSITY
Background 0,0
TIME
High concentration / signal
0,0
Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
红外荧光 VS 化学发光
定量线性范围更宽
化学发光法
近红外荧光法
• 近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高） • 近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）
Infrared dye (IRD800, Alexa680)
膜上抗原
一抗结合
不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久
红外标记的二抗
Odyssey直接扫描
双色：拓展应用空间
800 nm
700 nm
5/30/2013
Western Blot实验及检测方法探讨
5/30/2013
In-Cell WesternTM Assay
（磷酸化、细胞处理效果和药物筛选的最佳选择）
The In-Cell Western (ICW) Assay is a high-throughput approach to simultaneously detect and quantify two separate proteins directly within cells.
INTENSITY
Background 0,0
TIME
High concentration / signal
0,0
Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
红外荧光 VS 化学发光
定量线性范围更宽
化学发光法
近红外荧光法
• 近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高） • 近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）
Infrared dye (IRD800, Alexa680)
膜上抗原
一抗结合
不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久
红外标记的二抗
Odyssey直接扫描
双色：拓展应用空间
800 nm
700 nm
5/30/2013
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
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1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
WestenBlot详解及问题分析课件
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western Blot
Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防
止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
1M Tris-HCl(pH6.8)
1M DTT SDS
甘油 溴酚蓝 总体积
10 ml
20 ml 4g
20 ml 0.2 g 100ml
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
Western Blot
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western Blot
Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防
止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
1M Tris-HCl(pH6.8)
1M DTT SDS
甘油 溴酚蓝 总体积
10 ml
20 ml 4g
20 ml 0.2 g 100ml
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
Western Blot
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配胶问题
胶类型的选择：PAGE、SDS-PAGE、tricineSDS-PAGE 、IEF、2D
胶的浓度选择：蛋白大小、数目、个人经 验 配胶时间：
蛋白分子量 （ku） 4-40 10-43
凝胶浓度 （％） 20 15
忌即配即用（防凝固不均）； 忌长期冰箱放置（防SDS结晶）； 保存≤4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）
人源目的蛋白 固相载体
抗体问题
一抗：
根据目的蛋白的性质、种属选择合适一抗。 注意一抗的种属，单/多克隆及适用方法等。 根据说明书推荐或预实验优化最佳稀释比例。 加叠氮钠，４℃分装保存，忌反复冻融。
Dot blot
二抗：
根据一抗的来源种属以及Ig亚型（G、A、M等）选择合适二抗。 选择合适的标记物（HRP 、AP、 GOD、生物素、 荧光素、胶体金） 加或不加硫柳汞， ４℃分装保存，忌反复冻融。 根据说明书推荐或预实验（Dot blotting）优化最佳稀释比例。
凝胶条件 还原，变 性 还原，不 变性 不还原， 变性 不还原， 不变性
上样buffer 含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS 含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS 不含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS 不含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
电泳buffer 含SDS 不含SDS 含SDS 不含SDS
鼠 源 一 抗
鼠
HRP 兔 E 兔源二抗(抗鼠Fc段)
人源目的蛋白 固相载体
蛋白样品提取问题
明确蛋白样品的来源（组织； 细胞；体液） 选择适当的裂解方式（研磨； 超声；剪切；冻融等） 选择适当的裂解buffer（SDS； RIPA；NP-40；商品化试剂盒） 加入合适的蛋白酶抑制剂 （Aprotinin ；PMSF； leupeptin ; pepstantinA; PIC; EDTA；EGTA）
100%甲醇润湿!!!
胶体金、丽春红、酰胺黑、 印度墨汁、考马斯亮兰 显色法、化学发光、荧光、 放射性、化学荧光、快 速免疫检测 普通蛋白WB、糖蛋白检 测、蛋白质测序、氨基 酸分析 高
显色法、化学发光、荧光、 显色、化学发光、放射性 放射性 普通蛋白WB、氨基酸分 析。0.1um膜适用于 7kDa以下蛋白 较低 低浓度小分子蛋白、酸性蛋 白、糖蛋白、蛋白多糖、 核酸检测常用 低
转膜效果问题
(A) (B) (C) (D) (E)
透视法, 考马斯亮蓝染色 丽春红（可逆） 酰胺黑 CPTS 总蛋白染色.
丽春红S染色法：带负电丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合,从而形成 红色条带. 透视法：①干燥PVDF膜后，20%甲醇浸湿；②蛋白区透明③方便、可逆、蛋白不损、无需染料
小分子蛋白的 “流穿”问题
使用0.2μm的PVDF转印膜（PSQ，呈淡蓝色）
转移缓冲液中适当增加甲醇（防止平衡时小分子流失）
转移缓冲液中适当减少SDS（防止SDS抑制膜与蛋白的结合）
降低凝胶的平衡时间（≤10min）
降低电泳转膜时间（＜25min）
tricine-SDS-PAGE
封闭问题
氧自由基
TEMED促使AP形成氧自由基，进而催 化Acr单体为长链，Bis再使长链彼此 联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶 注：O2为终止剂 （PAG）。
聚丙烯酰胺凝胶
凝胶浓度，凝胶孔径↓，机械强度
“两胶三缓冲”
sample
浓 缩 胶
SDS-PAGE
-
[Tris-HCl pH6.8; 甘油； SDS；巯基乙醇；溴酚蓝]
重点理解：先导快离子后方----离子强度 ----低电导区 ---电场强度 ， 使glycine和protein加速移动。
浓 缩 胶
HCl全部解离成Cl-，迁移最快，走在最前----“先导离子”
分 离 胶
pH 8.8
蛋白样品受“夹板气”，被“压缩”，达“稳态”
protein浓 缩 胶
高E 低E 大分子
特点
灵敏度和分辨率
PVDF膜
高
NC膜
高
尼龙膜
高
背景
蛋白结合能力 机械强度 溶剂抗性 使用前是否需要浸润 适用染色方法 适用检测方法
低
100-200ug/cm2（适用于SDS 存在时与蛋白结合） 强 强
低
80-100ug/cm2 干的膜易脆 差 缓冲液润湿 胶体金、丽春红、酰胺黑、 印度墨汁
较高
>400ug/cm2 软而结实 差 缓冲液润湿 不能用阴离子染料
转膜问题
转膜方式：
A.
B.
电泳转移(半干转、湿转) 虹吸转移
转膜电压： 10~25V（半干转） 转膜电流： 1~2mA/cm2，10% gel
滤纸 膜 胶 虹 吸 转 移 滤纸 胶 膜 滤纸
+
转膜问题
转膜时间
A. 根据蛋白分子量、胶浓度、具体情况决定。
B. 检测多个蛋白时，需进行切胶，分别转膜。
WB常见问题
无信号(白板)或 弱信号(不是白板胜似白板) 高背景(黑板、几尽黑板) 非特异性条带（杂带） 脏带（操作）、补丁染色 表情条带（微笑、皱眉） 闹鬼（鬼带、鬼影） 拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带 其它
+
分 离 胶
中分子 小分子
甘氨酸大量解离，迁移加快，走在蛋白前，跟着Cl-跑了。 样品蛋白在均一的电场强度和PH中“尽情”泳动 根据样品成员的分子大小，不同的迁移率，实现分离 （分子越小，跑得越快 ）
-glycine-
Cl-
大致流程
提取与处理样品蛋白 电泳分离样品蛋白 转移蛋白至杂交膜 封闭非特异性位点 一抗孵育 洗涤 二抗孵育 洗涤 底物显色或曝光检测
内参问题
内参名称
beta-actin GAPDH Tubulin VCDA1/Porin COXIV
分子量大小
43kDa 30-40kDa 55kDa 31kDa 16kDa
适用范围
胞浆和全细胞 胞浆和全细胞 胞浆和全细胞 线粒体 线粒体
根据内参蛋白与 目的蛋白的分子大 小选择 根据内参蛋白的 存在部位 确定内参不受实 验处理因素影响
适用范围
价格
PVDF膜的选择问题Байду номын сангаас
转膜缓冲液问题
最好现用现配!
夹心结构问题
夹心结构: 正—滤、膜、胶、滤—负 大小：
滤纸>=膜>=胶
纤 维 垫
注意事项: ①膜用甲醇预处理
②膜随时保持湿润（传统） ③尽量使用新滤纸 ④各层叠放次序正确 ⑤不能有气泡
平衡问题：
①膜与胶泡于转膜缓冲液中 ②5~120min(蛋白分子愈小,时间愈短)
上样缓冲液（Loading buffer）
Tris/HCl pH 6.8
电泳缓冲液（running buffer） [ tris-HCl; glycine;SDS ]
分 离 胶
Tris/HCl pH 8.8 ( Acrylamide;bis; SDS; AP; TEMED)
转膜缓冲液（transfer buffer） [ tris-HCl; glycine ]
+
“消除电荷差、构像差”
电泳三离子： glycine-
Cl-
- Protien - -
SDS
-
- - -带负电的蛋白胶束
压缩,分离效应
电泳三离子： glycineClProtienSDS-PAGE
glycineproteinCl-
pH 6.8
甘氨酸仅有0.1～1%解离成Gly-，迁移最慢，走在最后--- “尾随离子”
对照问题
设置合适的对照组
阳性对照：明确表达目的蛋白，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：明确不表达目的蛋白，用于检测抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性及stripping效果
内参对照：检测实验体系是否正常工作、进行半定量分析
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的封闭及 stripping效果
定义:
使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂 的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜 上的非特异性位点
举例:
① non-fat milk(脱脂奶粉 ② BSA（胎牛血清） ③ casein（酪蛋白） ④ Tween-20（吐温-20） ⑤ gelatin(明胶) ⑥ 商业化的封闭试剂
封
闭
封闭问题
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
分子筛效应
AP-TEMED系统
单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）
催化剂：过硫酸铵（AP）
诱发剂：四甲基乙二胺（TEMED）
蛋白样品处理问题 根据目的蛋白的状态确定电泳条件：
抗体识别蛋白的空间型抗原表位时，不可加热及SDS变性 抗体识别蛋白的氧化状态时，就不可加还原剂（ β-巯基乙醇或DTT）
待测蛋白状态 ReducedDenatured ReducedNative OxidizedDenatured OxidizedNative
蛋白位置 全细胞
推荐buffer NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋 白）
胞浆（骨架结合 蛋白） 膜蛋白 核蛋白 线粒体蛋白
Tris-HCl
Tris-Triton NP-40 or RIPA RIPA or 核蛋白 提取试剂盒 RIPA or 线粒体 分离试剂盒