高效液相色谱HPLC培训教程(经典)
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
高效液相色谱法指导培训讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
HPLC培训教程
HPLC培训教程HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种高效液相色谱技术，被广泛应用于化学、生物化学、药学等领域中的分析和纯化过程。
HPLC培训教程旨在向初学者介绍HPLC的原理、仪器组成、样品制备、方法开发以及常见问题解决等方面的知识。
一、HPLC原理HPLC是一种基于色谱原理的分析方法，通过在固定填充物（固定相）上进行流动相（液相）与样品之间的相互作用，实现对样品的分离和定量分析。
其主要原理包括分配作用、吸附作用和离子交换作用。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由流动相系统、分离柱、检测器和数据处理系统组成。
流动相系统包括溶剂供应部分和混合部分，用于供给流动相。
分离柱是药物分离的关键，通常由填料柱和色谱柱两部分组成。
检测器用于检测分离柱出口的组分，并生成相应的信号。
数据处理系统将检测器信号转化为可读取的结果。
三、样品制备样品制备是HPLC分析的关键步骤，正确的样品制备可以确保分离柱正常工作并获得准确的结果。
常见的样品制备包括溶解、过滤、稀释和净化等。
溶解样品时要选择适当的溶剂，并根据样品性质进行必要的处理。
过滤可以去除杂质颗粒和减少背景噪声。
稀释可以使样品浓度适合分析要求。
净化可以去除干扰物，保证仪器的稳定性和分析结果的准确性。
四、方法开发HPLC方法开发是为了针对特定的分析目标选择适当的仪器参数和操作条件。
方法开发的关键是选择分离柱和优化流动相组成与流速，以获得较好的分离效果和分析结果。
在方法开发过程中，应该考虑分析目标、样品矩阵、仪器性能以及分析时间等因素，进行试错实验，根据实验结果进行参数调整，直到得到满意的分析方法。
五、常见问题解决在HPLC分析过程中，常常会遇到一些问题，需要及时解决。
常见问题包括峰形异常、峰分离不佳、信号漂移、背景噪声等。
为了解决这些问题，需要对仪器进行校准和维护，检查和修复分离柱，优化操作条件等。
此外，还可以通过尝试不同的分析方法或更换试剂等方法进行排除。
HPLC高效液相色谱法培训解析说课讲解
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超声波振荡脱气
将流动相置 于超声波清洗机 中，用超声波振 荡10~30min， 即可。
吹氦脱气
用在液体中比空 气中溶解度低的氦 气，以60mL／min 的流速缓缓地通过 流动相10~15min， 除去溶于流动相中 气体。
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高压输液泵
• 是HPLC系统中最重要的部件之一。 • 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统
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梯度洗脱装置
• 用途：梯度洗脱。 等度(isocratic)
• 高效液相洗脱方式 梯度(gradient)
低压梯度（外梯度） • 梯度洗脱方式
高压梯度（内梯度）
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低压梯度
• 在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输 入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵将 流动相以一定的流量输出至色谱柱。
• 常见的是四元泵，如waters 2690/2695； Agilent 1100。
不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则 会损坏六通阀。 • 进样方式：有部分装液法和完全装液法
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进样方式
• ①部分装液法：注入的样品体积应不大于 定量环体积的50%，并要求每次进样体积 准确、相同。
• ②完全装液法：注入的样品体积应最少是 定量环体积的3倍，以完全置换定量环内流 动相，消除管壁效应，确保进样准确度及 重现性。
一致。色谱柱的柱管外壁都以箭头显著地 标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱 柱时要使流动相按箭头所指方向流动。
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色谱柱(尺寸)
分析型：Ø 4.6mm 制备型：Ø＞5mm以上 微径柱：Ø <2.1mm 柱长：10～25cm，30cm 少见 柱体：直型优质不锈钢柱管
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高效液相色谱法培训课件
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小， 因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
1
第一节 概 述
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第二节 高效液相色谱仪
合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调
整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的 程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通 过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温 度（温度程序）来达到。
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀， 密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
高效液相色谱培训(HPLC使用与维护)
常见故障排除
流动相不流动
检查泵密封圈是否磨损或损坏， 管路是否堵塞，流动相是否足够。
峰形异常
检查进样器是否堵塞，色谱柱是否 受损或污染，检测器是否正常工作。
基线漂移
检查流动相是否纯净，检测器是否 正常工作，仪器是否处于良好状态。
仪器保养与校准
01
02
03
定期校准
按照厂商推荐的时间间隔 和校准方法，对HPLC进 行校准，以确保仪器性能 和测量精度。
详细描述
HPLC技术在化学领域中广泛应用于有机化合物、无机化合物的分离和测定。在生物领域，HPLC用于 蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。在医学领域，HPLC用于药物分析、临床检验、毒物分析 等方面，为医学研究和诊断提供重要的技术支持。
HPLC的优点与局限性
总结词
HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选 择性等优点，但也存在一些局限性，如 对样品的前处理要求高、对流动相的纯 度要求高等。
考察学员在遇到问题时能否迅速、准确地 判断并采取有效措施解决问题。
实践操作与考核经验分享
严格遵守操作规程
在实践操作过程中，务必遵循正确的操 作规程和安全规范，确保实验结果的准
确性和可靠性。
团队协作与沟通
积极参与团队协作，与团队成员保持 良好的沟通，共同解决问题，提高工
作效率。
充分准备与复习
在考核前，充分复习理论知识，熟悉 实验操作流程和仪器设备的使用方法。
HPLC仪器操作流程
准备工作
检查仪器各部件是否正常，流动相是否充足 ，确保电源和气源连接正常。
流动相制备
根据实验要求配制流动相，并进行过滤和脱气 。
仪器启动
打开电源和气源，启动仪器，进行系统冲洗和平 衡。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
《高效液相色谱培训》课件
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
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流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
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合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
高效液相色谱法培训课件
欢迎参加本次高效液相色谱法（HPLC）培训。在这个课程中，我们将会探究 这项重要的分析技术，介绍其原理、仪器和设备，体相和一列分离材料（通常是一种固定的液相柱）分 离并分析混合物。我们将介绍是什么让HPLC区别于其他分析方法，深入探讨 液相柱，以及如何选择适当的流动相。
环境监测
HPLC在环境监测中亦有 广泛的应用，我们将探究 HPLC在环境监测领域中 的各种应用。
食品安全检测
HPLC在食品安全检测领 域中也被广泛使用，例如 检测食品中的添加剂、有 害物质以及质量控制。
样品准备与处理
我们将讨论如何选择适当的样品处理方法，如何处理样品，以及样品前处理 的步骤。我们还将探讨如何选择适量的标准品和如何使用标准曲线。
常见问题与解决方法
色谱峰形不对称的原因与调整 方法
我们将探究造成色谱峰形不对称的原因，以及 如何调整色谱峰。
杂质峰的出现与解决方法
我们将探究杂质峰出现的原因，以及如何从样 品中去除杂质峰。
HPLC的仪器和设备
HPLC可能需要用到多种仪器，例如梯度系统和检测器。我们将介绍这些仪器 的功能以及如何在实验室中使用它们。我们还会详细介绍如何使用手动和自 动进样器。
操作流程
样品准备
样品制备可能是HPLC分析过程中最重要的部分 之一。我们将讨论如何正确样品准备以及如何 处理样品中的杂质。
色谱柱和流动相的选择
颜色、粘度和PH值等都会影响流动相的选择。 我们将详细讨论如何选择适当的流动相以及如 何选择适当的色谱柱。
手动和自动化进样的步骤
手动和自动化进样器的使用会影响实验的结果， 这个章节将讨论如何正确使用手动和自动化进
梯度洗脱的方法
我们将讨论什么是梯度洗脱，如何正确选择梯 度的组成。
高液相色谱HPLC培训教程
高压液相色谱HPLC培训教程(一)I．概论一、液相色谱理论开展简况色谱法的别离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用〔吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和〕的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特〔Tswett〕在1906年研究用碳酸钙别离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长〔常有几个小时〕。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的根底上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速开展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速-流速为0.1~10.0 ml/min。
高效-可达5000塔板每米。
在一根柱中同时别离成份可达100种。
高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高-可选择固定相和流动相以到达最正确别离效果。
高效液相色谱仪基础培训课程
Majors 和 Kirkland 发明 microparticulate packed columns 1977 Microprocessor controlled pumps 1978 Micron packing 1983 Microbore column
作用
参与分离作用
分析样品无分子量限制
分析样品分子量一般小于 500 amu
液相色谱的分类
❖ 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法
液相色谱分离模式 流动相 固定相
分离机制
吸附法
非极性溶剂 极性填料
吸附
反相色谱
分配法
正相色谱
尺寸排阻 离子交换
极性溶剂
非极性溶剂 非交互作用溶
剂 离子对试剂
非极性 极性固相
分配系数K
❖ 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关， 也与温度、压力有关。
❖ 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样 品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的 性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件， 在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况 下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰； 而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前 延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内 浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
应用领域 药物分析 生物化学
食品、饮料 化学工业 环境分析 滥用药物
临床实验
样
品
抗生素, 镇静剂, 类固醇, 止痛?
市场比例 30
氨基酸, 蛋白, 糖类, 脂质类
10
人工合成甜味剂, 抗氧化剂, 黄曲霉素, 添 加剂
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高效液相色谱HPLC培训教程（经典）I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速-流速为0.1~10.0 ml/min。
高效-可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC 同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。
按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。
但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。
有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高～中 中～低流动相极性 低～中 中～高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。
被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。
被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。
pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。
流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。
它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。
主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。
另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。
被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。
小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。
它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。
常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
II．基本概念和理论一、基本概念和术语1．色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音(noise)--基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。
Wh/2＝2.355σ标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。
2．定性参数（保留值）死时间(dead time，t)--不保留组分的保留时间。
即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。
V0＝F×t（F为流速）保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。
又称洗脱体积。
VR ＝F×tR调整保留时间(adjusted retention time，t'R)--扣除死时间后的保留时间。
也称折合保留时间(reduced retention time)。