碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
碱的滴定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握碱的滴定原理和方法。
2. 学习使用滴定仪器，如滴定管、锥形瓶等。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
4. 了解滴定终点判断的依据和操作技巧。
二、实验原理碱的滴定是指利用已知浓度的酸溶液来测定未知浓度的碱溶液浓度的方法。
实验过程中，酸和碱发生中和反应，根据化学计量关系计算出碱的浓度。
本实验采用酚酞作指示剂，当溶液由碱性变为弱酸性时，酚酞由无色变为粉红色，表示滴定终点。
三、实验仪器与药品仪器：- 酸式滴定管- 碱式滴定管- 锥形瓶- 铁架台- 滴定管夹- 烧杯- 移液管- 胶头滴管- 滴定台药品：- 0.1 mol/L NaOH溶液（标准溶液）- 0.1 mol/L HCl溶液（标准溶液）- 酚酞指示剂- 甲基橙指示剂四、实验步骤1. 准备实验用品：检查仪器是否完好，配制0.1 mol/L NaOH溶液，用甲基橙指示剂标定HCl溶液浓度。
2. 取样：准确移取25.00 mL未知浓度的NaOH溶液于锥形瓶中。
3. 滴定：向锥形瓶中加入2～3滴酚酞指示剂，用已知浓度的HCl溶液进行滴定。
边滴定边振荡锥形瓶，观察溶液颜色变化。
4. 记录数据：记录滴定过程中加入的HCl溶液体积，直至溶液颜色由无色变为浅红色，保持30秒不褪色，即为滴定终点。
5. 重复实验：重复以上步骤，进行至少三次实验，求平均值。
五、数据处理1. 根据实验数据，计算未知浓度NaOH溶液的浓度。
2. 计算滴定过程中消耗的HCl溶液体积的平均值。
3. 根据化学计量关系，计算NaOH溶液的浓度。
六、结果与分析1. 结果：通过实验，求得未知浓度NaOH溶液的平均浓度为（填写计算结果）mol/L。
2. 分析：（1）实验过程中，滴定终点的判断依据是酚酞指示剂的颜色变化。
酚酞在碱性溶液中呈无色，在弱酸性溶液中呈粉红色。
因此，当溶液颜色由无色变为浅红色，并保持30秒不褪色时，即为滴定终点。
（2）实验过程中，滴定速度不宜过快，以免产生误差。
血清碱性磷酸酶活力测定
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
铁氰化钾溶液
3.00
3.00
3.00
3.00
血清
——
———
——
0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
计算
ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白） *0.05*100(金氏单位）
临床意义：
血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
实验操作
1.取试管4支，按下表操作
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
1.00
1.00
注意事项
1. 目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能 久置
2. 底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明 磷酸苯二钠已分解，不宜使用。
3. 加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结 果会有影响。
标准曲线法
制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、 2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟， 各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾 2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比 色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶 单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸 上作图，绘制成标准曲线。
碱性蛋白酶活力的测定
碱性蛋白酶活力的测定1、实验原理蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2、实验试剂2.1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1 000mL。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
2.2. 碳酸钠溶液（Na 2CO3）=0.4mol／l 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.3. 三氯乙酸c（CCl 3·COOH）＝0.4mol／l 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.4. 氢氧化钠溶液（NaOH）＝0.5mol／l2.5. 盐酸溶液（HCl）＝lmol／l及0.lmol／l2.6. 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1 000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1 000mL。
使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1 000mL。
上述各种缓冲溶液，均需用pH计校正。
2.7. 10g／L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol／L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。
血清碱性磷酸酶活性测定
器材：
5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿 37°C水浴锅
实验操作
取4支试管，如下操作：
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色， 以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C
计算公式
ALP活性金氏单位定义: 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
反应速度↑ 活力↑
酶活力测定方法
• 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶 促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平 均速度。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
血清碱性磷酸酶的活性测定
思考
结合参考值范围、临床意义分析本小组 的实验结果
12
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高
2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄
疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
8
计算公式
9
注意事项
1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色 即作废。铁氰化钾 的水溶液受到光线 的作用，就会分解成黄血盐钾 K4[Fe(CN)6]
2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空 白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解， 不宜继续使用
3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则 显色不充分
10
临床意义
6
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替 比林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。 棕色瓶贮存。
磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
1
实验目的
1.熟悉酶活力测定方法的一般原理 2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理
与临床意义。 3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、
体液中酶的存在于含量。
2
实验原理
一.基本概念 1.酶活力测定 酶的催化功能可以用在一定条件下
酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反 应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定 酶活力实际上是测定酶促反应速率。 2.酶的活力单位 a.国际 在特定的条件下，1min内将1μmol底物转 化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。 1IU=16.67×10-9Katal b.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清 在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1 个金氏单位。 c.Kat单位 在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。1Kat=6×107 IU
碱性蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶活力测定1 定义1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1µg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
2 福林法2.1 原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2.2 试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配2.2.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)21.2g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.3 三氯乙酸（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L按GB601配制。
2.2.5 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述缓冲溶液，需用pH计校正。
2.2.6 10g/L 酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。
2.2.7100µg/mL L-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100µg/mL L-酪氨酸标准溶液。
表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶
２ ． 表 面活 性 剂 法 优 于 其 他 提 取 方 法 ． 该法操作简单 ． 提取 收率高 ， 减 少 了水 、 电等 能 耗 ， 且 避 免 了高 压 均 质 机 等 高 压 设 备 的使 用 ， 是 一 种 利 于 推 广 的毕 赤 酵 母 的 破 壁 提 取 方 法 。 （ 作 者 单位 ： 华 北 制 药 股份 有 限公 司 ）
关 系
稀释 １ ． ５倍 。
２ ． 试剂 准备 ： １ Ｏ ％ 十六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 （ Ｃ Ｔ Ａ Ｂ ） （ 表 面
活性剂 ） 。 ６ ０ ｏ Ｃ 热 水溶 解 ； １ ｍ ｏ ｌ ｌ ＬＮ ａ Ｏ Ｈ。
二、 方法 与计 算
酶 活 收率 ＝ 离 心 上 清 液 酶 活／ 混 液 酶 活
应 用 技 术
暑 ■ — ＿馕 富
表面活性剂法破壁提取青霉素酰化酶
李 涛
． 一 ｛ Leabharlann 霉 素 酰 化 酶 广 泛 应 用 于 半 合 成抗 生 素 及 中 间体 的制 备 、手 性 药 物 的拆 分 和 多 肽 合 成 等 方 面 。 由 巴斯 德 毕 赤 酵母 产 生 的 青 霉 素
加入 １ ０ ％表 面 活性 剂 溶 液 （ Ｃ Ｔ Ａ Ｂ ） ． 搅拌均匀后升温至 ４ １ ℃， 保 温 ２小 时 ， 期 间维持 ｐ Ｈ ６ ． ７ ￣ ０ ． １ ， 保 温 结 束 后 检 测 发 酵 液
混液酶活和上清液酶活， 计 算 酶 活 收率 。
为 低温 条件 下 酶 由细胞 内释 放 到细胞 外速 度 较慢 ． 而温 度 ４ ３℃ 时酶 活 损 失 明 显 ． 应该 是 温 度 过 高 对 活性 蛋 自的破 坏导 致 ． 由 此 确定青霉 素酰化酶 破壁温度保 持在 ４ １℃至 ４ ２℃可 使 酶
碱性蛋白酶活力的测定
实验四碱性蛋白酶活力的测定一、实验原理以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。
溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂和仪器试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、酶液的萃取称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。
空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
实验碱性磷酸酶比活力测定
将测定的数据或计算结果用下表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录。（此为例子）
步骤 总体 积 mL 400 蛋白 mg/ mL 7.24 总蛋 白 mg
酶活 力 U/mL
总活 力 U
比活 力 U/mg
纯 化 倍 数
得 率 %
匀浆过滤液
20.3
正丁醇处理上清液
0.35饱和(NH4)2SO4上 清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。
酶活DNS法测定
酶活DNS法测定一、将初筛的菌株接入100mL 种子培养基(250ml 三角瓶) 中, 25 ℃150r ·min - 1 培养24h（此步骤在初筛期省略）,取培养至对数生长期的种子液3mL 接入60mL 发酵培养基(250mL规格三角瓶)中发酵培养。
在30℃,150r ·min - 1 转速下培养144h ,8000r ·min - 14 ℃离心10min ,取上清用DNS 法测酶活。
二、标准曲线的制作精确称取100 ℃干燥至恒重的葡萄糖0. 10g ,加蒸馏水溶解并定容至100mL ,配成1.00mg ·mL - 1浓度的溶液,（按表1）在各比色管中加入溶液,沸水浴反应5min ,冷却加蒸馏水定容至25mL 后,以去离子水作为空白校正,用紫外分光光度计于550nm下测A值。
三、褐藻酸酶活力测定- DNS 法3 ,5-二硝基水杨酸法测定酶活力 ,利用比色法测定酶解后还原产物的生成量 ,以表示酶的活力。
具体为:吸取 1 mL 发酵液 ,2 mL 1 %褐藻酸钠溶液(pH7. 0 的 1/ 15N 的磷酸缓冲液配制) ,于试管中混匀 ,并且以 1 mL 蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。
置于40 摄氏度水浴糖化30 min ,取出后立即于沸水中煮沸 15 min 使酶失活。
冷却 ,过滤 ,吸取 1 mL 滤液于比色管中 ,加入 3 ,5-二硝基水杨酸显色剂3 mL,再沸水浴 15 min ,冷却 ,用蒸馏水定容至 25 mL ，混匀 ,在 550 nm 下测光密度(用蒸馏水调零) 。
酶活力单位定义为 ,在实验条件下 ,每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成 1μg还原糖所需的量。
4、菌株的产酶曲线的测定在复筛培养基中接入2mL 对数生长期的菌株一组,从48小时起，每隔18--24h测量发酵液的酶活力,并且测量发酵液于550nm下的A值,从而做出产酶曲线，得到最大酶活时间并为以后的测定提供参考时间。
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现代中西医结合杂志 M oder n Journal of Integrated T r aditional Chinese and Wester n M edicine 2008 Oct, 17( 30)
碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
孙凤卿1 , 罗建辉 2 , 康 司, 河北 石家庄 050035)
6 mL 0. 04 5. 32 52. 8
讨
论
试验表明 , 此方法适用于发酵生产过程中 , 可及时了解发 酵液中 P GA 酶活的增长趋势。利用电位滴定 仪进行滴定 , 可 以根据酶活的高低自动调整 滴定速率 , 使 pH 值稳定 , 使 得检 测结果精确 , 缺点是成本较高。温度对酶活的检测影响较大 , 可用精密温度计进行监 控 , 及时调整温度。 [
NaOH V0 / m L V5 / m L 酶活/ ( IU / mL ) RSD/ % 1 mL 0. 02 5. 06 50. 4
2 mL 0. 03 5. 12 50. 9
3 mL 0. 03 5. 23 52 . 0
4 mL 0. 03 4. 95 49. 2 2. 773
5 mL 0. 02 5. 29 52. 7
[ 摘要 ] 目的 建立碱滴定法测定发 酵液中 青霉 素酰化 酶酶 活的方 法 。 方法 以青霉 素为 反应底 物 , 温度 25 碱
辉1 , 赵
霞1
( 1. 石药集团河北中润制药有限公司, 河北 石家庄 050041; 2. 石药集团维生药业 ( 石家庄 ) 有限公
, pH 值维持在 7. 8, 采用电位滴定仪滴定氢氧化钠溶液 , 中和生成的苯乙 酸 , 计算出单位时间内青霉素的减少量 , 进 而计算出酶活 。 结果 [ 关键词 ] 酶活在 20~ 100 I U 范围内线性良 好 , 相关 系数 0. 999, 重现性好 , RSD 为 2. 773% 。 结论 液滴定检测发酵液中青霉素酰化酶酶活简便 、 准确 。 青霉素酰化酶 ; 碱滴定法 ; 酶活 ; 发酵液 R927. 11 [ 文献标识码 ] B [ 文章编号 ] 1008- 8849( 2008) 30- 4710- 01 [ 中图分类号 ]
[ 1]
钠缓冲液 , 开始搅 拌 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化钠 调 pH 值 至 7. 8 后 , 开始滴定并用秒表计时 , 维持 pH 为 7. 8, 记录 5 min 消耗 氢氧化钠溶 液 的毫 升数 ( V0 ) 。加入 40 mL 已预 先调 pH 值 7 8、 温度为 25. 0 、 10% 青霉 素 G 钾盐 溶液 , 开始滴 定并计 时 , 调整电位滴定 仪参数使 pH 维持在 7. 8, 记录 5 min 消耗氢
参
考
文
献
]
唐青涛 , 余若黔 , 程建华 . 青霉素酰化酶研究进展 [ J] . 国外医药 抗生素分册 , 2001, 22( 4) : 151- 155 [ 收稿日期 ] 2008- 04- 05
线性实验结果
2 mL 0. 03 2. 01 1. 98 3 mL 0. 03 3. 08 3. 05 4mL 0. 02 4. 12 4. 10
mL
5 mL 0. 04 5. 06 5. 02
Y = ( 1. 02X - 0. 034R ) / 0. 999
2 5 重 复性
取发酵液 ( 发酵 30 h) 照 上述 方法重 复检 酰化酶除了在医药工业上 用于大规 模生产 - 内 酰胺类抗生素中间体和半合成 - 内 酰胺类 抗生素 之外 , 还 有其他的一些潜在应用 , 对青霉素酰化酶 的研究一 直吸引着 各国科研人员的关注
[ 1]
氧化钠的毫升数 ( V 5) 。公 式 : 酶活 ( IU / mL ) = ( ( V5 - V0 ) ∀ M ∀ 1000) / ( 5 ∀ V) , 式中 V 5: 样 品消耗 氢氧化 钠溶 液的毫 升 数 ( mL) ; V 0: 空白消耗氢氧化钠溶液的毫升数 ( mL) ; M : 氢氧化 钠溶液浓度 ( mol/ L) ; 5: 反应时间( min) ; V: 取样体积 ( mL) 。 2 4 线性范围 分别精密量取发酵液 ( 发 酵 30 h 样品 ) 1, 2, 3, 4, 5 mL 按照 上述方法进行检 测 , 结 果见表 1。 以取样 体积 与消耗氢氧化钠溶液 的量做 线型图 , 结果 表明所 取样品 酶活 量在 20~ 100 IU 范围内呈 良好线性 , 相关系数 0. 999 。 表1
次 , 记录每次测得结果并计算出酶活。结果见表 2 。
Na2HPO4!2H 2 O 溶于大 约 1 500 mL 蒸 馏水 中 , 用磷 酸调 pH 至 7. 8, 加水至 2 000 mL 。 2 1 2 pH 7. 8 的 10%( w/ v) 青霉素 G 钾盐 精称 20 g 青霉 素钾 盐加 入约 150 mL 蒸馏 水中 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化 钠调 pH 值至 7. 8, 加水至 200 mL。 2 2 样品的制备 精确量取适量体积 ( 可根据消耗氢氧化钠 3 的水 完全转 移至反 应器中 , 严 溶液的量进 行调 整 ) 均 匀的 发酵 液用 离心 机离 心 , 倒掉 上清 液 , 剩余固体物用 40 mL 、 25 2 3 实验方法 格按以下检测 PGA 溶液酶活的方法分析。 将盛有 40 mL 样品 稀释液的 反应器 放入水 , 加 1. 0 mL 50 mmol/ L、 pH 7. 8 的磷酸 浴中 , 保持恒温 28
NaOH V0 V5 V 5- V 0 线性方程 1 mL 0. 02 1. 00 0. 98
。在发酵 过程中 , 发酵 液的酶 活单位
是控制发酵 液质量的重要 指标 , 笔者发 现采用 碱液滴 定进行 酶活检测是行之有效的方法。 1 仪器和试剂 719S 型电位滴定仪 ( 带玻璃 pH 计 , 5 mL 滴定管 , 瑞士万 通公司产 ) ; 电子 恒 温水 浴 锅 ( 控温 25 , 上 海 电 子 水浴 锅 厂) ; 离心机 ( 北 京医 用离 心机 厂 ) ; 电动 搅拌 浆 ( 瑞 士万 通公 司) ; 二水合 磷酸氢二钠 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) ; 氢氧化钠 ( 分析 纯 , 天津市 永大 化学 试剂公 司 ) , 青霉 素 G 钾 盐( 纯度 2 2 1 2 1 1 99. 0% , 中润公司生 产) ; 磷酸 ( 分析纯 , 天津市永大 化学试剂公司 ) 。 方法与结果 试剂溶液的配制 50 mmol/ L、 pH 7. 8 磷 酸 钠 缓 冲 液 将 17. 8 g