碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
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现代中西医结合杂志 M oder n Journal of Integrated T r aditional Chinese and Wester n M edicine 2008 Oct, 17( 30)
碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
孙凤卿1 , 罗建辉 2 , 康 司, 河北 石家庄 050035)
6 mL 0. 04 5. 32 52. 8
讨
论
试验表明 , 此方法适用于发酵生产过程中 , 可及时了解发 酵液中 P GA 酶活的增长趋势。利用电位滴定 仪进行滴定 , 可 以根据酶活的高低自动调整 滴定速率 , 使 pH 值稳定 , 使 得检 测结果精确 , 缺点是成本较高。温度对酶活的检测影响较大 , 可用精密温度计进行监 控 , 及时调整温度。 [
NaOH V0 / m L V5 / m L 酶活/ ( IU / mL ) RSD/ % 1 mL 0. 02 5. 06 50. 4
2 mL 0. 03 5. 12 50. 9
3 mL 0. 03 5. 23 52 . 0
4 mL 0. 03 4. 95 49. 2 2. 773
5 mL 0. 02 5. 29 52. 7
[ 摘要 ] 目的 建立碱滴定法测定发 酵液中 青霉 素酰化 酶酶 活的方 法 。 方法 以青霉 素为 反应底 物 , 温度 25 碱
辉1 , 赵
霞1
( 1. 石药集团河北中润制药有限公司, 河北 石家庄 050041; 2. 石药集团维生药业 ( 石家庄 ) 有限公
, pH 值维持在 7. 8, 采用电位滴定仪滴定氢氧化钠溶液 , 中和生成的苯乙 酸 , 计算出单位时间内青霉素的减少量 , 进 而计算出酶活 。 结果 [ 关键词 ] 酶活在 20~ 100 I U 范围内线性良 好 , 相关 系数 0. 999, 重现性好 , RSD 为 2. 773% 。 结论 液滴定检测发酵液中青霉素酰化酶酶活简便 、 准确 。 青霉素酰化酶 ; 碱滴定法 ; 酶活 ; 发酵液 R927. 11 [ 文献标识码 ] B [ 文章编号 ] 1008- 8849( 2008) 30- 4710- 01 [ 中图分类号 ]
[ 1]
钠缓冲液 , 开始搅 拌 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化钠 调 pH 值 至 7. 8 后 , 开始滴定并用秒表计时 , 维持 pH 为 7. 8, 记录 5 min 消耗 氢氧化钠溶 液 的毫 升数 ( V0 ) 。加入 40 mL 已预 先调 pH 值 7 8、 温度为 25. 0 、 10% 青霉 素 G 钾盐 溶液 , 开始滴 定并计 时 , 调整电位滴定 仪参数使 pH 维持在 7. 8, 记录 5 min 消耗氢
参
考
文
献
]
唐青涛 , 余若黔 , 程建华 . 青霉素酰化酶研究进展 [ J] . 国外医药 抗生素分册 , 2001, 22( 4) : 151- 155 [ 收稿日期 ] 2008- 04- 05
线性实验结果
2 mL 0. 03 2. 01 1. 98 3 mL 0. 03 3. 08 3. 05 4mL 0. 02 4. 12 4. 10
mL
5 mL 0. 04 5. 06 5. 02
Y = ( 1. 02X - 0. 034R ) / 0. 999
2 5 重 复性
取发酵液 ( 发酵 30 h) 照 上述 方法重 复检 酰化酶除了在医药工业上 用于大规 模生产 - 内 酰胺类抗生素中间体和半合成 - 内 酰胺类 抗生素 之外 , 还 有其他的一些潜在应用 , 对青霉素酰化酶 的研究一 直吸引着 各国科研人员的关注
[ 1]
氧化钠的毫升数 ( V 5) 。公 式 : 酶活 ( IU / mL ) = ( ( V5 - V0 ) ∀ M ∀ 1000) / ( 5 ∀ V) , 式中 V 5: 样 品消耗 氢氧化 钠溶 液的毫 升 数 ( mL) ; V 0: 空白消耗氢氧化钠溶液的毫升数 ( mL) ; M : 氢氧化 钠溶液浓度 ( mol/ L) ; 5: 反应时间( min) ; V: 取样体积 ( mL) 。 2 4 线性范围 分别精密量取发酵液 ( 发 酵 30 h 样品 ) 1, 2, 3, 4, 5 mL 按照 上述方法进行检 测 , 结 果见表 1。 以取样 体积 与消耗氢氧化钠溶液 的量做 线型图 , 结果 表明所 取样品 酶活 量在 20~ 100 IU 范围内呈 良好线性 , 相关系数 0. 999 。 表1
次 , 记录每次测得结果并计算出酶活。结果见表 2 。
Na2HPO4!2H 2 O 溶于大 约 1 500 mL 蒸 馏水 中 , 用磷 酸调 pH 至 7. 8, 加水至 2 000 mL 。 2 1 2 pH 7. 8 的 10%( w/ v) 青霉素 G 钾盐 精称 20 g 青霉 素钾 盐加 入约 150 mL 蒸馏 水中 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化 钠调 pH 值至 7. 8, 加水至 200 mL。 2 2 样品的制备 精确量取适量体积 ( 可根据消耗氢氧化钠 3 的水 完全转 移至反 应器中 , 严 溶液的量进 行调 整 ) 均 匀的 发酵 液用 离心 机离 心 , 倒掉 上清 液 , 剩余固体物用 40 mL 、 25 2 3 实验方法 格按以下检测 PGA 溶液酶活的方法分析。 将盛有 40 mL 样品 稀释液的 反应器 放入水 , 加 1. 0 mL 50 mmol/ L、 pH 7. 8 的磷酸 浴中 , 保持恒温 28
NaOH V0 V5 V 5- V 0 线性方程 1 mL 0. 02 1. 00 0. 98
。在发酵 过程中 , 发酵 液的酶 活单位
是控制发酵 液质量的重要 指标 , 笔者发 现采用 碱液滴 定进行 酶活检测是行之有效的方法。 1 仪器和试剂 719S 型电位滴定仪 ( 带玻璃 pH 计 , 5 mL 滴定管 , 瑞士万 通公司产 ) ; 电子 恒 温水 浴 锅 ( 控温 25 , 上 海 电 子 水浴 锅 厂) ; 离心机 ( 北 京医 用离 心机 厂 ) ; 电动 搅拌 浆 ( 瑞 士万 通公 司) ; 二水合 磷酸氢二钠 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) ; 氢氧化钠 ( 分析 纯 , 天津市 永大 化学 试剂公 司 ) , 青霉 素 G 钾 盐( 纯度 2 2 1 2 1 1 99. 0% , 中润公司生 产) ; 磷酸 ( 分析纯 , 天津市永大 化学试剂公司 ) 。 方法与结果 试剂溶液的配制 50 mmol/ L、 pH 7. 8 磷 酸 钠 缓 冲 液 将 17. 8 g
现代中西医结合杂志 M oder n Journal of Integrated T r aditional Chinese and Wester n M edicine 2008 Oct, 17( 30)
碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
孙凤卿1 , 罗建辉 2 , 康 司, 河北 石家庄 050035)
6 mL 0. 04 5. 32 52. 8
讨
论
试验表明 , 此方法适用于发酵生产过程中 , 可及时了解发 酵液中 P GA 酶活的增长趋势。利用电位滴定 仪进行滴定 , 可 以根据酶活的高低自动调整 滴定速率 , 使 pH 值稳定 , 使 得检 测结果精确 , 缺点是成本较高。温度对酶活的检测影响较大 , 可用精密温度计进行监 控 , 及时调整温度。 [
NaOH V0 / m L V5 / m L 酶活/ ( IU / mL ) RSD/ % 1 mL 0. 02 5. 06 50. 4
2 mL 0. 03 5. 12 50. 9
3 mL 0. 03 5. 23 52 . 0
4 mL 0. 03 4. 95 49. 2 2. 773
5 mL 0. 02 5. 29 52. 7
[ 摘要 ] 目的 建立碱滴定法测定发 酵液中 青霉 素酰化 酶酶 活的方 法 。 方法 以青霉 素为 反应底 物 , 温度 25 碱
辉1 , 赵
霞1
( 1. 石药集团河北中润制药有限公司, 河北 石家庄 050041; 2. 石药集团维生药业 ( 石家庄 ) 有限公
, pH 值维持在 7. 8, 采用电位滴定仪滴定氢氧化钠溶液 , 中和生成的苯乙 酸 , 计算出单位时间内青霉素的减少量 , 进 而计算出酶活 。 结果 [ 关键词 ] 酶活在 20~ 100 I U 范围内线性良 好 , 相关 系数 0. 999, 重现性好 , RSD 为 2. 773% 。 结论 液滴定检测发酵液中青霉素酰化酶酶活简便 、 准确 。 青霉素酰化酶 ; 碱滴定法 ; 酶活 ; 发酵液 R927. 11 [ 文献标识码 ] B [ 文章编号 ] 1008- 8849( 2008) 30- 4710- 01 [ 中图分类号 ]
[ 1]
钠缓冲液 , 开始搅 拌 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化钠 调 pH 值 至 7. 8 后 , 开始滴定并用秒表计时 , 维持 pH 为 7. 8, 记录 5 min 消耗 氢氧化钠溶 液 的毫 升数 ( V0 ) 。加入 40 mL 已预 先调 pH 值 7 8、 温度为 25. 0 、 10% 青霉 素 G 钾盐 溶液 , 开始滴 定并计 时 , 调整电位滴定 仪参数使 pH 维持在 7. 8, 记录 5 min 消耗氢
参
考
文
献
]
唐青涛 , 余若黔 , 程建华 . 青霉素酰化酶研究进展 [ J] . 国外医药 抗生素分册 , 2001, 22( 4) : 151- 155 [ 收稿日期 ] 2008- 04- 05
线性实验结果
2 mL 0. 03 2. 01 1. 98 3 mL 0. 03 3. 08 3. 05 4mL 0. 02 4. 12 4. 10
mL
5 mL 0. 04 5. 06 5. 02
Y = ( 1. 02X - 0. 034R ) / 0. 999
2 5 重 复性
取发酵液 ( 发酵 30 h) 照 上述 方法重 复检 酰化酶除了在医药工业上 用于大规 模生产 - 内 酰胺类抗生素中间体和半合成 - 内 酰胺类 抗生素 之外 , 还 有其他的一些潜在应用 , 对青霉素酰化酶 的研究一 直吸引着 各国科研人员的关注
[ 1]
氧化钠的毫升数 ( V 5) 。公 式 : 酶活 ( IU / mL ) = ( ( V5 - V0 ) ∀ M ∀ 1000) / ( 5 ∀ V) , 式中 V 5: 样 品消耗 氢氧化 钠溶 液的毫 升 数 ( mL) ; V 0: 空白消耗氢氧化钠溶液的毫升数 ( mL) ; M : 氢氧化 钠溶液浓度 ( mol/ L) ; 5: 反应时间( min) ; V: 取样体积 ( mL) 。 2 4 线性范围 分别精密量取发酵液 ( 发 酵 30 h 样品 ) 1, 2, 3, 4, 5 mL 按照 上述方法进行检 测 , 结 果见表 1。 以取样 体积 与消耗氢氧化钠溶液 的量做 线型图 , 结果 表明所 取样品 酶活 量在 20~ 100 IU 范围内呈 良好线性 , 相关系数 0. 999 。 表1
次 , 记录每次测得结果并计算出酶活。结果见表 2 。
Na2HPO4!2H 2 O 溶于大 约 1 500 mL 蒸 馏水 中 , 用磷 酸调 pH 至 7. 8, 加水至 2 000 mL 。 2 1 2 pH 7. 8 的 10%( w/ v) 青霉素 G 钾盐 精称 20 g 青霉 素钾 盐加 入约 150 mL 蒸馏 水中 , 用 0. 1 mol/ L 氢氧 化 钠调 pH 值至 7. 8, 加水至 200 mL。 2 2 样品的制备 精确量取适量体积 ( 可根据消耗氢氧化钠 3 的水 完全转 移至反 应器中 , 严 溶液的量进 行调 整 ) 均 匀的 发酵 液用 离心 机离 心 , 倒掉 上清 液 , 剩余固体物用 40 mL 、 25 2 3 实验方法 格按以下检测 PGA 溶液酶活的方法分析。 将盛有 40 mL 样品 稀释液的 反应器 放入水 , 加 1. 0 mL 50 mmol/ L、 pH 7. 8 的磷酸 浴中 , 保持恒温 28
NaOH V0 V5 V 5- V 0 线性方程 1 mL 0. 02 1. 00 0. 98
。在发酵 过程中 , 发酵 液的酶 活单位
是控制发酵 液质量的重要 指标 , 笔者发 现采用 碱液滴 定进行 酶活检测是行之有效的方法。 1 仪器和试剂 719S 型电位滴定仪 ( 带玻璃 pH 计 , 5 mL 滴定管 , 瑞士万 通公司产 ) ; 电子 恒 温水 浴 锅 ( 控温 25 , 上 海 电 子 水浴 锅 厂) ; 离心机 ( 北 京医 用离 心机 厂 ) ; 电动 搅拌 浆 ( 瑞 士万 通公 司) ; 二水合 磷酸氢二钠 ( 分析纯 , 天津市永大化学试剂公司 ) ; 氢氧化钠 ( 分析 纯 , 天津市 永大 化学 试剂公 司 ) , 青霉 素 G 钾 盐( 纯度 2 2 1 2 1 1 99. 0% , 中润公司生 产) ; 磷酸 ( 分析纯 , 天津市永大 化学试剂公司 ) 。 方法与结果 试剂溶液的配制 50 mmol/ L、 pH 7. 8 磷 酸 钠 缓 冲 液 将 17. 8 g