第六章_分子生物学研究方法(上)基因工程技...

• 1993 基因工程西红柿在美国上市 • 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 • 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负 中国获准加入人类基因组计划. 责测定人类基因组全部序列的1% 责测定人类基因组全部序列的1% • 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 • 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 • 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 工程、 工程、细胞工程
自然界的基因转移和重组
• 基因重组(genetic recombination) 基因重组(genetic recombination)——整段 整段 DNA在细胞内或细胞间 在细胞内或细胞间, DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交 并能在新的位置上复制, 换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 • 自然界的基因转移和重组是无目的 • 基因工程有目的
三类限制性核酸内切酶性质比较
性 质 第一类 第二类 第三类 多功能酶 二种不同亚 基 ATP、 Mg 2+、ATP、 SAM* 大 特定， 特定，离识 别位点24 24别位点2426处 26处 限制限制-修饰活 多功能酶 限制酶与修 性 饰酶分开 蛋 白 质 结 构 三种不同亚 相同亚基 基 ATP、 辅 助 因 子 Mg 2+、ATP、 Mg 2+ SAM 分 子 量 大 小 非特定， 特定， 切 割 位 点 非特定，离 特定，在识 识别位点 别位点内 1Kb
5、限制性核酸内切酶的作用特点: 限制性核酸内切酶的作用特点:
识别位点的DNA 序列呈二重旋转对称（ DNA序列呈二重旋转对称 (1) 识别位点的 DNA 序列呈二重旋转对称 （ 即具 有迥文结构） 有迥文结构）； 切割DNA均产生含5 -磷酸和3 -羟基的末端； DNA均产生含 (2)切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端； 错位切割产生具有5 (3) 错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端； -突出的粘性末端； 而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端， DNA产生平头末端 而沿对称轴切割双链 DNA 产生平头末端 ， 也称 钝性末端。 钝性末端。 (4)少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点 少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点， (4)少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点， 这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A 。 这些酶称为同切酶， Ⅰ和
限制性核酸内切酶 restriction endonuclease
• 一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序 一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序 DNA分子中 DNA水解酶 水解酶。 列的DNA水解酶。
识别特异核苷酸序列 ：大多为 4-6 bp 的 回文对称（ sequence） 回文对称（palindrome sequence）
第一节
概述
• 一、基因工程 ( genetic engineering)的概念： engineering)的概念 的概念： • 基因工程又称为基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、 克隆、 基因工程又称为基因克隆、DNA重组、 DNA克隆 重组 分子克隆,即应用酶学的方法， 分子克隆,即应用酶学的方法，在体外将目的基 因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分 因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分 复制子、重组体）， ），继而通过转化或转染宿 子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿 主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞， 主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再 进行扩增，提取获得大量同一DNA DNA分子拷贝或其 进行扩增，提取获得大量同一DNA分子拷贝或其 表达产物的过程。 表达产物的过程。 • 克隆（clone） 无性繁殖 克隆（clone）
第二节 基因工程工具酶
• 基因的分离、重组、构建是由一系列酶 基因的分离、重组、 促反应所完成的。在基因工程技术中， 促反应所完成的。在基因工程技术中， 要利用各种不同的工具酶来对基因进行 相应的加工处理。 相应的加工处理。常用的工具酶 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ 聚合酶 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 切割DNA 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 生成3′- 5′磷酸二酯键 3′ 探针标记、补平3′末端 3′末端 探针标记、补平3′ cDNA合成 cDNA合成 5′磷酸化、 5′磷酸化、探针标记 磷酸化 3′末端多聚尾 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
•
四、基因工程技术的意义
• 基因工程技术的意义是：鉴于重组基因工程具 基因工程技术的意义是： 有外源性的核酸分子在另一种不同宿主生物细 胞内所进行的繁殖和特定的DNA DNA片段在新宿主内 胞内所进行的繁殖和特定的DNA片段在新宿主内 进行扩增的两大特点， 进行扩增的两大特点，所以达到种属内外重组 遗传信息的交换转移）， ），从而使得很多从自 （遗传信息的交换转移），从而使得很多从自 然界难以获得或不能获得的蛋白质得到大量的 制备， 制备，人类能以更快速度或更准确目标进行生 物品种改良，甚至创造新物种。 物品种改良，甚至创造新物种。它为人类改造 生命和创造新生命起到难以估量的作用。 生命和创造新生命起到难以估量的作用。
一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme， 限制性核酸内切酶 ， RE)
• 1、限制性核酸内切酶概念： 限制性核酸内切酶概念： • 限制性核酸内切酶（Restriction 限制性核酸内切酶（ endonucleases，RE）亦称为限制性内切核酸酶， endonucleases，RE）亦称为限制性内切核酸酶， 简称限制酶或内切酶， 简称限制酶或内切酶，是一类能识别和切割双 DNA分子中特定核苷酸序列且能产生具有二重 链DNA分子中特定核苷酸序列且能产生具有二重 对称特异序列（回文序列， 对称特异序列（回文序列，pelindromic sequence）结构的DNA水解酶， DNA水解酶 sequence）结构的DNA水解酶，也是原核生物所 特有的酶。 特有的酶。
五、基因工程大事记
• 1973 Cohen完成第一例细菌基因克隆实验。 Cohen完成第一例细菌基因克隆实验 完成第一例细菌基因克隆实验。 Genentech公司 公司首次在大肠杆菌中产生由 • 1978 Genentech公司首次在大肠杆菌中产生由 人工合成基因表达的人胰岛素 人胰岛素。 人工合成基因表达的人胰岛素。世界上第一种 基因工程蛋白药物 ； • 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、 --重组人胰岛素在英 美获准使用； 美获准使用； • 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中 第一批转基因家畜（ 猪和羊）， ），中 转基因鱼。 国 转基因鱼。
第六章 分子生物学研究方法（上） 分子生物学研究方法（ ——基因工程 基因工程
• 基因工程（gengtic engineering）是分子生物 基因工程（ engineering） 技术中最主要的研究内容之一，又称为DNA DNA重组 技术中最主要的研究内容之一，又称为DNA重组 技术（ 技术 （ recombinant DNA technique ） 或分子 克隆。它涉及到特地基因（ 克隆 。它涉及到特地基因 （被称为目的基因或 外源DNA片段）的制备、分离、鉴定、 DNA片段 外源DNA片段）的制备、分离、鉴定、改造及其 在不同生物间的转移等多项技术。 在不同生物间的转移等多项技术。
• 基因克隆示意图
载载DNA (限细抗细外反外限) 限
＋
目目目目
＋
宿宿细细
重重 载
已 反 杂 目 宿宿 细 细
繁繁 阳 抗 阳 阳阳
表表
三、基因工程技术的目的
基因工程技术的目的主要有两个方面： 基因工程技术的目的主要有两个方面： 一是获得足够的DNA DNA片段以分析基因的结 一是获得足够的DNA片段以分析基因的结 构； • 二是将获得的基因用于发展农业、林业、 二是将获得的基因用于发展农业、林业、 畜牧业和医学。 畜牧业和医学。
二、基因工程技术的基本原理和步骤
一个完整的体外DNA重组技术主要包括以下步骤 一个完整的体外 DNA重组技术主要包括以下步骤： DNA 重组技术主要包括以下步骤： 获取目的基因； 1 获取目的基因； 将目的基因进行必要的改造； 2、将目的基因进行必要的改造； 选择和修饰克隆载体； 3、选择和修饰克隆载体； 4 、 将目的基因与载体连接获得含有目的基因的 重组载体； 重组载体； • 5、重组载体导入相应细胞（称为宿主细胞）； 重组载体导入相应细胞（称为宿主细胞） • 6、筛选出含重组DNA的细胞等等； 筛选出含重组DNA的细胞等等； DNA的细胞等等 • • • • •
• 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为 基因克隆（ cloning）或分子克隆, 重组ＤＮＡ 技术， 是应用酶学方法， ＤＮＡ技术 重组 ＤＮＡ 技术 ， 是应用酶学方法 ， 在体外将 不同来源的DNA分子通过酶切、 DNA分子通过酶切 不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新 组装成杂合分子， 组装成杂合分子 ， 并使之在适当的宿主细胞中 进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 DNA分子的过程 进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 • 克隆（clone）:指含有单一的DNA重组体的无性 克隆（clone） 指含有单一的DNA DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA DNA重组体引入宿主细胞建立无 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无 性繁殖系的过程(cloning) (cloning)。 性繁殖系的过程(cloning)。
–5’GAATTC 3’ 5’GAATTC 3’CTTAAG 5’ 5’GGATCC 3’ 3’CCTAGG 5’
（二）限制性核酸内切酶分布： 限制性核酸内切酶分布：
• 限制性核酸内切酶的分布很广， 限制性核酸内切酶的分布很广， 多数来自细菌， 多数来自细菌，有的来自蓝藻和 链酶菌， 链酶菌，极少数存在于支原体等 微生物在中。 微生物在中。