水产微生物实验— 微生物的分离、纯培养与菌种保藏

实验四微生物的分离、纯培养与菌种保藏一、基础知识（一）微生物的分离自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。

人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态，也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。

使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。

稀释涂布平板法、稀释浇注平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。

后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。

微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。

该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。

由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有：平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理包括两方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度，温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过解释涂面平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在乎板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

（二）微生物的纯培养不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。

了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。

厌氧微生物的分离和培养有其特殊性，主要是采取各种方法使它们处于没有氧的环境或氧化还原电位低的条件下进行培养。

随着对厌氧微生物培养方法的改进，发现它们在自然环境中存在的种类和数量都得到大幅度地增加，它们的作用也显得愈来愈重要。

微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。

不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体。

半固体和液体培养基来进行检测。

固体培养基又分平板与斜面两种形式。

在乎板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等状况；它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、疏展状、树枝状或假根状；生长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成苗膜，上层清晰而底部显沉淀状；穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生长；也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚至不生长。

微生物培养特征还包括菌苔的颜色，表面光滑程度、基质是否产生水溶性色素等。

培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。

检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。

琼脂平板上的生长表现细菌在固体培养基表面生长繁殖，可形成肉眼可见的菌落。

各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上进行鉴别。

例如，葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的下同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平、干燥、边缘不单齐的波纹状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。

菌落的观察方法除肉眼外，可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。

观察的主要内容有：大小菌落的大小，规定用毫米(mn)表示，一般不足lmm者为露滴状菌落，1-2mm者为小菌落；2-4mm者为中等大菌落；4-6mm或更大看称为大菌落、巨大菌落。

形状菌落的外形有圆形、不正形、根足形、葡萄叶形。

边缘菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。

表面性状观察其表面平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。

隆起度表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。

颜色及透明度菌落有五色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否光泽、透明、半透明及不透明。

硬度黏液状、膜状、干燥或湿润等。

溶血若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血，溶血情况怎样。

（2）琼脂斜面上生长表现将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上(自底部向上划一直线)，培养后观察其生长表现，如下图所示各种生长方式。

（3）琼脂柱穿刺培养中的生长表现将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现，如下图所示各种生长方式。

2．细菌在明胶穿刺培养中的生长表现：取大肠杆菌、枯草杆菌和其他多种细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况。

细菌对明胶柱的液化作用，其形式如上图所示。

3．细菌在液体培养基中的生长表现肉汤中生长表现将马链球菌马亚种、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，注意其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。

细菌在肉汤中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、黏稠沉淀、絮状沉淀、小块状沉淀。

另外还有不生成沉淀的菌种。

细菌在熟肉培养基中生长表现取各种厌氧梭菌分别接种于熟肉培养基中，培养后观察其生长表现，注意其混浊度、沉淀、碎肉的颜色和碎肉块被消化的情况。

（三）菌种保藏从事微生物学的理论研究和实际生产应用均要求所用的菌种长期存活不被污染，且主要特性保持稳定，这就需要用适宜的方法将菌种进行长期保藏，以便随时使用。

因此，菌种保藏是微生物学工作者的基础工作。

菌种的基本原则是使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态，保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面考虑。

现有菌种保藏方法大体分为以下几种：1．传代培养法此法使用最早，它是将要保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基(用于厌氧细菌)培养好后，置4℃存放，定期进行传代培养、再存放。

后来发展在斜面培养物上面覆盖一层无菌的液体石蜡，一方面防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面石蜡层可将微生物与空气隔离，减弱细胞的代谢作用。

不过，这种方法保藏菌种的时间不长，且传代过多使菌种的主要特性往往减退，甚至丢失。

因此它只能作为短期存放菌种用。

2．载体法该法是使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。

这种载体来源很广，如土壤、砂土，硅胶、明胶、麸皮、滋珠和滤纸片等。

该法操作通常比较简单，普通实验室均可进行。

特别是以滤纸片(条)作载体，细胞干燥后，可将含细菌的滤纸片(或条)装人无菌的小袋封闭后放在信封中邮寄很方便。

3．真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L-干燥法，前者是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥，后者则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10-20℃范围内进行真空干燥。

4．冷冻法这是一种使样品始终存放在低温环境下的保藏方法。

它包括低温法(-70 ~ -80℃)和液氮法(-196℃)。

水是生物细胞的主要组分，约占活体细胞总量的90％，在0℃或0℃以下时会结冰。

样品降温速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液的浓度提高，胞内的水分便大量向外渗透，导致细胞剧烈收缩，造成细胞损伤，此为溶液损伤。

另一方面，若冷却速度过快，胞内的水分来不及通过细胞膜渗出，胞内的溶液因过冷而结冰，细胞的体积膨大，最后导致细胞破裂，此为胞内冰损伤。

因此，控制降温速率是冷冻微生物细胞十分重要的步骤。

现在可以通过以下两个途径来克服细胞的冷冻损伤。

（1）保护剂也称分散剂。

在需冷冻保藏的微生物样品中加人适当的保护剂可以使细胞经低温冷冻时减少冰晶的形成，如甘油、二甲亚砜、谷氨酸钠、糖类、可溶性淀粉，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、血清、脱脂奶等均是保护剂。

二甲亚砚对微生物细胞有一定的毒害，一般不采用。

甘油适宜低温保藏，脱脂奶和海藻糖是较好的保护剂，尤其是在冷冻真空干燥中普通使用。

（2）玻璃化固体在自然界中有两种形式，即晶体和玻璃化。

物质的质点（分子、原子和离子等）呈有序排列或具有格子构造排列的称为晶态，即晶体。

反之，质点作不规则排列的是为玻璃态，即玻璃化。

玻璃化不会使生物细胞内外的水在低温下形成晶体，细胞不受损伤。

实现玻璃化可以通过降温速率（106-107℃/s）和提高溶液浓度两种形式达到。

二、实验目的1．掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的生长表现。

3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。

4．进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

5．学习和掌握菌种保藏的基本原理，比较几种不同的保藏方法。

三、实验器材1．菌种（1）米曲雷（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白地霉、蕈状芽孢杆菌、粘质沙霉氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、灰色链霉菌、酿酒酵终、产黄霉菌。

（2）葡萄球菌、炭疽杆菌、巴氏杆菌、猪丹毒杆菌的普通平板或鲜血（血清）平板、斜面、琼脂穿刺及明胶穿刺培养物。

（3）马链球菌马亚种（录脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌的肉肠培养物、厌氧梭菌的熟肉培养基培养物）（4）大肠杆菌、葡萄球菌的半固体穿刺培养物2．培养基淀粉琼脂培养基（高氏I号培养基）、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基、查氏琼脂培养基、肉汤培养基、马铃薯培养基、麦芽汁酵母膏培养基。

3．溶液或试剂：10%酚盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角大查瓶，4%水琼脂，液体石蜡、甘油、五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%惭醇，10%盐酸，无水氯山钙，食盐，干汗。

4．仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，无菌滴管，冻干管，安瓿管，40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0.5×1.2cm），干燥器，真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温水箱（-30℃），超低温冰箱和液氧罐等。

四、实验操作（一）微生物的分离1．稀释涂布平板法（1）倒平板将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%的酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液（母浓度为30m/ml），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：左手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞，将试管塞或瓶塞轻轻地拔出（如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)，试管或瓶口保持对着火焰，然后用右手拇指和食指接过试管或三角瓶。