全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建_百替生物

CGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC3’HuJк2FORNot： 5’GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGC ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3’ 1.2.4RTPCR 逆转录反应 （cDNA 第一链的合成） A①按下列组成配制反转录反应液： MgCl2 2μl， 10×RT Buffer 1μl，RNase Free dH2O 2.75μl， dNTP Mixture(10mM each) 1μl，RNase Inhibitor 0.25μl，Oligo dT –Adaptor Primer 0.5μl，RNA 2μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5μl，总量 10μl。 ②按以下条件进行反转录反应：42℃ 20 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 1 个循环。 1.2.5VH 和 VL 基因扩增用确定好的引物对分别在 PCR 仪上扩增 VH 和 VL 基因片段。 PCR 反应 B ①按下列组成配制 PCR 反应液：重链可变区和轻链可变区分别进行：5×PCR Buffer 10μl，灭菌蒸馏 水 27.75μl，Back primer 1μl，Forward primer 1μl，TaKaRa Ex TaqTM HS 0.25μl，总量 40μl。② 把 B①的反应液加入到 A②的反转录反应结束后的 PCR 反应管中，轻轻混匀。③按以下条件进行 PCR 反应：94℃，2 min 1 个循环，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min， 30 个循环。PCR 产物 用琼脂糖凝胶电泳（1.5％）纯化回收 VH 和 VL 基因片段。 1.2.6scFv 基因的组装 VH 和 VL 基因片段延伸连接肽 VHlinker 和 VLlinker: 用上述纯化的 VH 和 VL 基因片段作为它们延伸连接肽的模板，用相对应的人 JHlinker primers 和 human VH back primers 扩增 VHlinker，用相对应的 linkerhuman Vк primers 和 human Jк forward primers 扩增 VLlinker。SOEPCR(剪切重叠延伸 PCR, splicing overlapping extend－PCR)[3]：将上述扩增的 VHlinker 和 VLlinker 的 PCR 产物在无引物情况下用 SOEPCR 连接：首先变性步骤 94℃ 5 min，94℃ 1 min, 60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，5 个循环，然后加入含酶切位点引物，94℃ 30 s, 60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30 个循环，胶纯化回酶 Sfi I 和 Not I 酶切过夜，产物 纯化后，与同样酶切后的噬菌体载体 pCANTAB5E 进行连接反应，连接产物纯化后，电转化大肠 杆菌 TG1,涂 SOBAG 平板，同时用 pUC18 标准质粒测定转化效率，在含 2％葡萄糖和 100μg／ml 的 SOB 培养基上 30℃培养过夜。 1.2.8PCR 法鉴定抗体基因插入率挑取 24 个细菌集落，加入 3 ml 含氨苄青霉素 100 mg／ml 的 LB 培养过夜。按质粒提取试剂盒说明提取质粒，取 2 μl 为模板采用 50μl 体系，进行 PCR 扩增琼脂 糖凝胶电泳检测 scFv 的阳性插入率。
TCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC3’ GGT C
HuVH5aBACK： 5’GAG GTG CAG CTG
TTG CAG TCT GC3’扩增 VLlinker 的引物对：HuJ к2FOR: 5’ACG TTT GAT CTC CAG CTT
CC3’LinkerHuVк236BACK：5’GTTCAGGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGCGGATCGGAWRTTGTGHTGACKCAGTC TCC3’引入酶切位点的引物：HuVH5aBACKSfi： 5’GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGC
全人源食管癌单链抗体 scFv 基因的构建 【摘要】 目的制备全人源化食管癌 细胞的来源，提取总 RNA，用 RTPCVL 基因片段的引物对，以 cDNA 为模板扩增 VH 和 VL 基因片段，再以它们为模板 分别扩增 VHlinker 与 VLlinker，用 SOEPCR 技术将它们拼接成 scFv,再引入酶切位点 Sfi I 和 Not I，胶回收 PCR 产物获得 scFv。将 scFv 基因克隆入噬菌粒载体 pCANTAB5E 后电转入 Ecoli TG1。PCR 法鉴定抗体基因插入率，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果食管癌周围 淋巴结的提取总 RNA 琼脂糖电泳结果中可见清晰的 28S、18S 条带；VH 基因的大小约为 450bp,VL 基因为 350bp,组装后的 scFv 基因约为 850bp。PCR 连接产物的转化效率为 2×107cfu/μg，scFv 的阳 性插入率为 91.7％(22／。 【关键词】 噬菌体抗体库；单链抗体；食管癌；基因工程抗体 1 材料和方法 1.1 材料总 RNA 抽提试剂盒（W6701）购自上海华舜生物工程有限公司、cDNA 合成试剂盒 RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0 购自大连宝生物工程有限公司、DNA100bp Marker 购自上海生工生物工程技 术服务有限公司, DNA 纯化试剂盒 (W5211) 购自上海华舜生物工程有限公司、Sfi I 和 Not I 内切酶、 T4 DNA 连接酶、TaKaRa Ex TaqTM HS 均购于大连宝生物公司；载体 pCANTAB 5E 和大肠杆菌 TG1 均购自 Amersham Biosciences 公司。 1.2 方法 1.2.1 淋巴结总 RNA 的提取食管癌病人（重庆医科大学临床学院胸外科食管癌病人 10 例，手术后 经病理确诊鳞癌 6 例， 腺癌 4 例）手术时取癌肿周围淋巴结，无菌生理盐水漂洗后，剪成约 0.3cm 大小的组织块，立即放入盛有液氮的冰瓶中，取回后立即进行总 RNA 的提取或放入液氮中保存。淋 巴结的裂解及 RNA 的纯化按试剂盒说明操作，将获得的 RNA（鳞癌和腺癌的 RNA 混匀后）贮存于 -70℃。琼脂糖电泳判断 RNA 的完整性，分光光度仪测 A260/A280 判断 RNA 的纯度。 1.2.2 确定扩增 VH 和 VL 基因引物对引物序列中的简并符号采用 IUPAC 命名方式： R=A 或 G; W=A 或 T; K=G 或 T; Y=C 或 T; S=G 或 C; H=A 或 C 或 T; N=A 或 C 或 G 或 T，引物参照文献[1,2] 设计, 引物委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，为 PAGE 纯化产品。引物浓度的计算：PCR 反 应中引物工作浓度为 0.2μM。 1.2.3 网格筛选确定扩增 VH 和 VL 基因片段的引物对 IgG 特异 VH 和 VL 基因片段扩增：用扩增重 链可变区和扩增轻链可变区的每一个后引物和每个前引物交叉配对（网格筛选）做 PCR,然后分别将 PCR 产物电泳， 确定扩增 VH 和 VL 基因片段的引物对。 扩增重链可变区引物对： HuJH3FOR： 5’TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC3’HuVH5aBACK：5’GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC3’扩增轻链可变区引物对：HuJк2FOR：5’ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC3’HuVк5aBACK：5’GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC3’扩增 VHlinker 引物对： HuJH45Linker：5’AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCC service@

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1.2.9 阳性克隆酶切鉴定 PCR 反应阳性的质粒用 Sfi I 和 Not I 双酶切，产物进行 1.5%琼脂糖凝胶 电泳。 2 结果 2.1 淋巴结总 RNA 的提取食管癌患者淋巴结总 RNA 用 1.5%琼脂糖电泳判断 RNA 的完整性， 可见 两条带 18S 与 28S, 而且 28S 条带的亮度是 18S 的两倍。分光光度仪测 A260/A280 判断 RNA 的纯 度>1.8。 2.2VH 和 VL 基因扩增产物的鉴定 VH 和 VL 基因扩增后，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，VH 基因 的大小约为 450 bp, VL 基因为 350 bp，见图 1。 2.3scFv 基因的组装 scFv 基因组装后，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的 scFv 基因约为 850 bp，见图 2。 2.4PCR 连接产物的转化效率的测定 pUC18 标准质粒测定大肠杆菌 TG1 转化效率为 108 cfu/μg， PCR 连接产物的转化效率为 2×107 cfu/μg。 2.5PCR 法鉴定抗体基因插入率 PCR 法检测 24 个菌落，22 个克降扩增出 scFv，目的基因插入率 为 91.7%，见图 3。 2.6 阳性克隆酶切鉴定随机挑取 6 个单克隆质粒以 Sfi I 和 Not I 双酶切，均有目的片段释放，见图 4。M:100bp marker; 1:VL 基因;2：VH 基因 图 1VH 和 VL 基因扩增 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 M:100 bp marker; 1:scFv 基因 图 2scFv 基因的琼脂 糖凝胶电泳鉴定 1：DNA Marker；27: PCR 反应阳性；8：PCR 反应阴性 图 3 随机挑取克隆抽提质粒 PCR 反应 1:DNA Marker, 27：均可见 scFv 的片段(下)和载体(上) 图 4 PCR 反应阳性的质粒用 Sfi I 和 Not I 酶切结果 3 讨论自从首次报道用小鼠 B 细胞杂交瘤技术 制备单克隆抗体（mAb）以来约有 140 种目前进行临床试验，大部分仍是由鼠杂交瘤技术生产。而噬 菌体抗体为抗体的片段，分子小、穿透力强、廓清快、异源性低，而且能在原核系统中表达，易于生 产。利用抗体库技术可简便地制备出针对不同肿瘤患者多种肿瘤的 scFv 片段，这些 scFv 片段与细胞 毒素、破坏细胞的酶和细胞因子等连接后，可形成对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的复合物，称为免疫 毒素或生物导弹。对感染性疾病、器官移植排斥反应的防治及肿瘤的早期诊断、治疗，以及手术及化 疗后晚期肿瘤的辅助治疗均具有广阔的应用前景[4,57]。 噬菌体展示库技术在一定程度上较好地模拟 了体内抗体生成亲和力成熟过程，可快速高效地从大量克隆中筛选展示特异性抗体的噬菌体，为制备 高亲和性的抗体提供了有力工具，其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进 service@