9基因工程抗体和抗体工程

The diversity of germline information
Figure 24.9 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C gene segment.
④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂
⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂
⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体 诊断试剂
⒊放射免疫用抗体诊断试剂
放射免疫技术是将放射性核素 分析的高度灵敏性与抗原抗体 反应的特异性结合起来建立的 检测技术。
放Байду номын сангаас性核素标记抗体的方法：
①氯胺-T法 ②Iodogen氏法
第五节 抗体工程
抗体研究进展3个阶段： ①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体； ②1975年杂交瘤技术单克隆抗体； ③1994年基因工程抗体；
Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes
C genes code for the constant regions of immunoglobulin protein chains. V gene is sequence coding for the major part of the variable (N-terminal) region of an immunoglobulin chain.
建立预定位技术需解决3个问题： ①抗体在肿瘤组织滞留要7天以上。 ②Ab-DTPA偶联物比较稳定； ③内源性金属离子对DTPA的封闭 作用要小。
Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes
Family
Lambda Kappa Heavy
V Genes
Man Mouse
<300
2
<300 ~1000
~300 >1000
C Genes
Man Mouse
>6
噬菌体表面展示系统(phage surface display system )
1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系 统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3 的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利 用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基 因的筛选工作带来了革命性的变革。
⒊妊娠诊断试剂 ⒋抗ABO血型系统血清
二、免疫标记技术用的抗体 类试剂
⒈荧光抗体诊断试剂 ⑴荧光抗体的制备 ⑵免疫荧光测定方法
⒉免疫酶抗体诊断试剂 ⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂 ⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂 ①HBsAg酶标诊断试剂 ②HBeAg酶标诊断试剂
③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶标诊断试剂
③小分子抗体易到达肿瘤部位， 可显著提高N/NT值。
④抗体在肿瘤部位可保留6～9日 ⑤能观擦抗体在血中的半衰期和
可能出现的不良反应。
放射免疫显像定位技术
将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基 三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成 Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体 内组织相结合。由于抗体分子量大， 需3天完成。3天后注入放射性核素In113M（半衰期100m），因DTPA是重 金属离子络合剂，所以In-113M可以结 合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。 这一过程在2小时内可完成。
Figure 15.9 Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between them.
一、噬菌体抗体库技术的 基本方法
⒈获取目的基因 ⒉抗体库技术的载体 ⒊淘筛 ⒋表达与鉴定
噬菌体抗体库技术
它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。 其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌 体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助 噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体 分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端 或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗PCR扩增抗体全套基白的基因 g3或 g8 的先导系列的紧靠下游
外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、 方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗 体噬菌体库。
筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，
使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体 片段，经过纯化即可获得目的抗体。
该项技术的优点:
将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如 激素、酶、药物、随机多肽等的生产。
第六节 抗体诊断试剂
一、血清学鉴定用的抗体类试剂 ⒈鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴常用诊断血清的品种和用途
①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清
⑵诊断血清的制备步骤 ①制备细菌抗原 ②免疫动物和制备抗体血清
⑶诊断血清诊断方法
⒉乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂
Figure 24.12 Consensus sequences are present in inverted orientation at each pair of recombining sites. One member of each pair has a spacing of 12 bp between its components; the other has 23 bp spacing.
Figure 24.6 The kappa C gene segment is preceded by multiple J
segments in the germ line. V-J
joining may recognize any
one of the J segments, which is then spliced to
Immunoglobulin genes are
assembled from their parts in lymphocytes
Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.
reactions. First a D segment is joined to a J segment; then a V gene segment is joined to the D segment.
The diversity of germline information
Figure 24.8 The lambda family consists of V gene segments linked to a small number of J-C gene segments.
③HAV抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂
④AFP放射性核素标记抗体 诊断试剂
⑤CEA放射性核素标记抗体 诊断试剂
三、导向诊断药物
放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点： ①在体内确切肿瘤定位作用，准确性 达90%，灵敏度达100%。 ②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并 可检出肺脑的转移灶。
The diversity of germline information
Figure 24.10 A single gene cluster in man contains all the information for heavy-chain gene assembly.
Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements
噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简 单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及 免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一 增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际 应用上具有很大意义。
二、噬菌体抗体库技术的 特点
⒈模拟天然全套抗体库 ⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊可获得高亲和力的人源化抗体
宿主细胞: 筛选范围 : 时间: 操作: 免疫: 人源抗体: 费用: 生产量: 基因获取:
应用前景:
单克隆抗体 杂交瘤技术
杂交瘤 ~103 几个月 繁杂 必须
高 有限 再克隆
有限
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简单 可避免
+ 低 无限 直接
不可估
三、基因工程抗体表达
⒈原核细胞表达 ⒉真核细胞表达 ⒊转基因植物表达 ⒋转基因动物表达
抗原的测定有： ①夹心法 ②间接法 ③竟争法
1.夹心法
E
E
底物
固相
标本
2.间接法
酶标抗体
酶标二抗
底物
终止液 显色
标本 固相
3.竞争法
Ag ※ + Ab
Ag(标本) (定量)
显色
Ag※Ab AgAb
常用标记抗体试剂有：
①HBsAg放射性核素标记抗体 诊断试剂
②HBeAg放射性核素标记抗体 诊断试剂
the C gene segment during RNA processing.
Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes
Figure 24.7 Heavy genes
are assembled by
sequential joining
Immunoglobulin genes are
assembled from their parts in lymphocytes
Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.
Figure 24.5 The lambda C gene segment is preceded by a J segment, so that V-J recombination generates a functional lambda light-chain gene.
Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes
Recombination between V and C gene segments
generates deletions and rearrangements
Figure 24.13 Breakage and reunion at consensus sequences generates immunoglobulin genes.
Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements
Figure 15.8 Reciprocal recombination between direct repeats excises the material between them; each product of recombination has one copy of the direct repeat.
4
1
1
9
8
Table 24.1 Each immunoglobulin family consists of a cluster of V genes linked to its C gene(s).
Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes