单克隆抗体和基因工程抗体
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第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体
Βιβλιοθήκη Baidu
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。
1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ） 球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白 组分。
CDR
Epitope
Representation of the disassociation of an antibody (top) and antigen (botton) molecule.
重链的基因结构：(a) 鼠 (b) 人
二、细胞工程抗体和基因工程抗体
抗体技术的发展经历了三个阶段
第一代：多克隆抗血清
80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少
了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-
30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体
产生较强的抗独特型反应。
嵌合抗体技术
人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代 替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特 异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减 少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人 源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为 Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产 生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗 体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。
1975年Kö hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。 1994年基因工程抗体。
1、多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)
白蛋白
a1 a2
球蛋白
b
（a）
（b）
（c）
对健康人用疫苗进行主动 免疫，免疫前（a）和免 疫后10天 （b）分别采血 并对血清蛋白进行凝胶电 泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫 之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。
PcAb的制备
多价抗原
单克隆 （致敏的B细胞）
单克隆抗体
实际意义：
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 --- 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。
2、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）
CTL
CD3
(2) 抗体融合蛋白
抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能
Fc的作用：检测、纯化、
thrombin
SPA
protein
Fc
Fc的作用：延长血清中半寿期
DNA ligation G-CSF Fc
应用 疾病的被动免疫治疗
疾病诊断、特异性抗原或蛋白的 检测和鉴定、疾病的被动免疫治 疗和生物导向药物制备
缺点 特异性不高、易发生交叉反应， 人体应用后可导致人鼠抗体反应 不易大量制备
3、基因工程抗体 （genetic engineering antibody） 通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
三 基因工程方法研制新的单抗
抗体库技术
u 抗体库——在原核系统功能性表 达多样性抗体基因(repertoire)
u 通过多种选择手段筛选出特定性 能的抗体基因
抗体库技术产生的三 项技术基础
RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区 基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性 表达 噬菌体展示技术（phage display)
VH CH1
VL CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
II Fv antibody molecule
(1) ds-Fv
Pr VH Pr VL
分别构建载体
L链表达载体
H链表达载体
共转染细胞
Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备
抗体分泌细胞
接头DNA
VH 基因III或 基因VIII VL
外壳蛋白
VH
VL
噬菌体表面呈现的小分子抗体
噬菌体抗体图示
抗 体 库 的 构 建
抗体库的富集筛选
抗体库技术的应用
● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体
四 抗 体 药 物 的 临 床 应 用
抗血清
破伤风抗血清
一、抗体分子的结构
二、细胞工程抗体和基因工程抗体 三、治疗性单抗研制进展
一 抗体分子结构
免疫球蛋白分的基本结构
免疫球蛋白的水解片段
免疫球蛋白的功能区
complimentarity determining region, CDR
hypervarible region (HVR) (complimentarity determining region, CDR) : formation of the Ag binding site
噬菌体抗体库技术
将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成 cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用 限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状 噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白Ⅲ基因连 接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后， 携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有 抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法 即可筛选出特异性抗体。
VH
-S-S-
VL
disulfide-stabilized Fv, ds-Fv
Fv小分子抗体的制备
III Diabody structure
双特异性抗体
Fab
VH VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
抗原A Fv
VH VL VH
抗原B
VL
抗原A
VH
抗原B
VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
TUMOR CELL
antibody
antigen
antigen-antibody complex:
epitope
purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.
基因工程抗体
抗肿瘤 , 自身免疫病
I 抗血清
人工被动免疫
人工注射人的球蛋白（gamma-globulins）或免疫动物的球蛋白。
破伤风抗毒素 (马血清)
同源Homologous
异源 Heterologous
急性感染 (diphtheria, tetanus, measles, rabies, etc.), 中毒 (insects, reptiles, botulism), 预防措施 (hypogammaglobulinemia).
嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而 仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中 骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中 与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置 换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为 人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植 抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人 体内免疫性大为降低
工程抗体
Engineering antibody
Emil von Behring, 1901, antitoxins
Paul Ehrlich , 1908, production of antibody
Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody
Malignant B-cells are destroyed after docking of MabThera
人改型抗体（CDR移植）
鼠单克隆抗体V区的人源化 人源化抗体（humanized antibody） 又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）
改型抗体技术
Human Antibodies Produced in Cloned Calves
Cloning technique to produce four calves expressing a human chromosome fragment coding for a range of human antibodies.
单克隆抗体
抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 )
The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, By utilizing the body's own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel.
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基 蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
单抗制备的流程图
Production of unlimited quantities of human polyclonal antibodies against any disease agent
used to prevent and/or treat a wide variety of diseases,
Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody
Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene
Nobel Prize winners
免疫球蛋白的功能
抗体介导的调理作用
NK细胞介导的ADCC作用
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体 来源 动物免疫血清、恢复期病人血 清或免疫接种人群 特点 来源广泛、制备容易 组成 针对不同抗原表位的抗体的混 合物 单克隆抗体 多为鼠源性 纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应、制备成本低 针对单一表位，结构和组成高度 均一，抗原特异性及同种型一致
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
Pr 鼠VH
启动子
人 CH
Pr
鼠VL
人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
MabThera
for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
be changed,
30
基 因 工 程 改 造 的 抗 体
1 小分子抗体
2
3 鼠单抗人源化
(1) 小分子抗体
2 1
3
I Fab antibody molecule
Pr VH CH1 Pr VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
expression
Fusion Protein
(3) 鼠单抗人源化
●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体
●可变区人源化——人改型抗体
●用抗体库技术进行人源化
鼠单抗人源化
人-鼠嵌合抗体
嵌合抗体（chimeric antibody）:
在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的
Ig恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有70-
Generating human antibodies which could never be obtained from the blood stream.
By random or designed mutations, affinity
or specificity of the antigen binding can
Βιβλιοθήκη Baidu
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。
1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ） 球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白 组分。
CDR
Epitope
Representation of the disassociation of an antibody (top) and antigen (botton) molecule.
重链的基因结构：(a) 鼠 (b) 人
二、细胞工程抗体和基因工程抗体
抗体技术的发展经历了三个阶段
第一代：多克隆抗血清
80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少
了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-
30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体
产生较强的抗独特型反应。
嵌合抗体技术
人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代 替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特 异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减 少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人 源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为 Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产 生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗 体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。
1975年Kö hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。 1994年基因工程抗体。
1、多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)
白蛋白
a1 a2
球蛋白
b
（a）
（b）
（c）
对健康人用疫苗进行主动 免疫，免疫前（a）和免 疫后10天 （b）分别采血 并对血清蛋白进行凝胶电 泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫 之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。
PcAb的制备
多价抗原
单克隆 （致敏的B细胞）
单克隆抗体
实际意义：
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 --- 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。
2、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）
CTL
CD3
(2) 抗体融合蛋白
抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能
Fc的作用：检测、纯化、
thrombin
SPA
protein
Fc
Fc的作用：延长血清中半寿期
DNA ligation G-CSF Fc
应用 疾病的被动免疫治疗
疾病诊断、特异性抗原或蛋白的 检测和鉴定、疾病的被动免疫治 疗和生物导向药物制备
缺点 特异性不高、易发生交叉反应， 人体应用后可导致人鼠抗体反应 不易大量制备
3、基因工程抗体 （genetic engineering antibody） 通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
三 基因工程方法研制新的单抗
抗体库技术
u 抗体库——在原核系统功能性表 达多样性抗体基因(repertoire)
u 通过多种选择手段筛选出特定性 能的抗体基因
抗体库技术产生的三 项技术基础
RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区 基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性 表达 噬菌体展示技术（phage display)
VH CH1
VL CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
II Fv antibody molecule
(1) ds-Fv
Pr VH Pr VL
分别构建载体
L链表达载体
H链表达载体
共转染细胞
Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备
抗体分泌细胞
接头DNA
VH 基因III或 基因VIII VL
外壳蛋白
VH
VL
噬菌体表面呈现的小分子抗体
噬菌体抗体图示
抗 体 库 的 构 建
抗体库的富集筛选
抗体库技术的应用
● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体
四 抗 体 药 物 的 临 床 应 用
抗血清
破伤风抗血清
一、抗体分子的结构
二、细胞工程抗体和基因工程抗体 三、治疗性单抗研制进展
一 抗体分子结构
免疫球蛋白分的基本结构
免疫球蛋白的水解片段
免疫球蛋白的功能区
complimentarity determining region, CDR
hypervarible region (HVR) (complimentarity determining region, CDR) : formation of the Ag binding site
噬菌体抗体库技术
将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成 cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用 限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状 噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白Ⅲ基因连 接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后， 携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有 抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法 即可筛选出特异性抗体。
VH
-S-S-
VL
disulfide-stabilized Fv, ds-Fv
Fv小分子抗体的制备
III Diabody structure
双特异性抗体
Fab
VH VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
抗原A Fv
VH VL VH
抗原B
VL
抗原A
VH
抗原B
VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
TUMOR CELL
antibody
antigen
antigen-antibody complex:
epitope
purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.
基因工程抗体
抗肿瘤 , 自身免疫病
I 抗血清
人工被动免疫
人工注射人的球蛋白（gamma-globulins）或免疫动物的球蛋白。
破伤风抗毒素 (马血清)
同源Homologous
异源 Heterologous
急性感染 (diphtheria, tetanus, measles, rabies, etc.), 中毒 (insects, reptiles, botulism), 预防措施 (hypogammaglobulinemia).
嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而 仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中 骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中 与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置 换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为 人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植 抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人 体内免疫性大为降低
工程抗体
Engineering antibody
Emil von Behring, 1901, antitoxins
Paul Ehrlich , 1908, production of antibody
Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody
Malignant B-cells are destroyed after docking of MabThera
人改型抗体（CDR移植）
鼠单克隆抗体V区的人源化 人源化抗体（humanized antibody） 又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）
改型抗体技术
Human Antibodies Produced in Cloned Calves
Cloning technique to produce four calves expressing a human chromosome fragment coding for a range of human antibodies.
单克隆抗体
抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 )
The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, By utilizing the body's own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel.
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基 蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
单抗制备的流程图
Production of unlimited quantities of human polyclonal antibodies against any disease agent
used to prevent and/or treat a wide variety of diseases,
Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody
Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene
Nobel Prize winners
免疫球蛋白的功能
抗体介导的调理作用
NK细胞介导的ADCC作用
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体 来源 动物免疫血清、恢复期病人血 清或免疫接种人群 特点 来源广泛、制备容易 组成 针对不同抗原表位的抗体的混 合物 单克隆抗体 多为鼠源性 纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应、制备成本低 针对单一表位，结构和组成高度 均一，抗原特异性及同种型一致
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
Pr 鼠VH
启动子
人 CH
Pr
鼠VL
人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
MabThera
for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
be changed,
30
基 因 工 程 改 造 的 抗 体
1 小分子抗体
2
3 鼠单抗人源化
(1) 小分子抗体
2 1
3
I Fab antibody molecule
Pr VH CH1 Pr VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
expression
Fusion Protein
(3) 鼠单抗人源化
●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体
●可变区人源化——人改型抗体
●用抗体库技术进行人源化
鼠单抗人源化
人-鼠嵌合抗体
嵌合抗体（chimeric antibody）:
在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的
Ig恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有70-
Generating human antibodies which could never be obtained from the blood stream.
By random or designed mutations, affinity
or specificity of the antigen binding can