单克隆抗体与基因工程抗体制备技术

第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术本章考点1.概念2.杂交瘤技术基本原理3.杂交瘤抗体的制备技术4.基因工程抗体由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。

传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。

由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。

因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。

第一节杂交瘤技术基本原理单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。

杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。

被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。

在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

一、B细胞杂交瘤技术1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。

融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。

2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。

3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。

将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。

图13 杂交瘤技术操作主要流程示意图二、T细胞杂交瘤T细胞杂交瘤可分为小鼠细胞杂交瘤和人T细胞杂交瘤。

其基本过程是将激活的细胞与酶缺陷型淋巴瘤细胞融合，通过有限克隆稀释，获得特异性表达细胞受体（TCR）或其他功能的杂交瘤细胞。

其主要步骤为：1.淋巴瘤细胞系的选择要求有以下特征：（1）体外能无限、快速生长。

（2）融合率高。

（3）不分泌淋巴因子和杀伤功能。

（4）缺乏某一特异性的细胞表面抗原或受体。

（5）HGPRT酶缺陷型。

2.特异性细胞的制备与活化：主要有可溶性抗原诱导激活的细胞、同种反应性细胞、人的特异性细胞等。

3.T细胞杂交瘤的筛选。

三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞形成后的初期很不稳定，为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长影响，必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经2～3次检测均为阳性的杂交瘤单个细胞，才能进行克隆化培养。

克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保存在-196℃液氮中。

第二节单克隆抗体的制备技术利用杂交瘤技术制备McAb基本原理是根据三个原则：（1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说；（2）杂交瘤细胞保持双方亲代细胞特性化；（3）然后大量培养增殖，制备所需的McAb。

一、单克隆抗体的产生1. 动物体内诱生方法：目前McAb治疗用或体外诊断用的多数尚采用这一方法制备。

先在小鼠腹腔注射液体石蜡或福氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，l～2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。

2.体外培养法：这是实验室制备的方法。

将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。

另一种是杂交瘤细胞高密度培养法。

二、单克隆抗体的纯化及鉴定目前常用的纯化方法有盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法。

单克隆抗体性质鉴定方法如放免测定、补体介导溶血试验、ELISA、免疫酶、玫瑰花结形成试验等，最常用的为ELISA方法，一般先作定性试验，如阳性，进一步作定量检测。

第三节单克隆抗体医学中的应用单克隆抗体目前全世界已研制成数以万计，在生物及医学界有着广泛用途，在医学中已经用于：1.作为诊断试剂，用于诊断各类病原体，目前这是McAb应用最多的领域之一。

2.肿瘤特异性抗原和相关抗原的检测：用于肿瘤的诊断、分型及定位。

3.检测淋巴细胞表面标志物，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。

4.抗原微量成分的检测及对酶类、激素、维生素、药物等的检测。

5.在防治工作中如恶性肿瘤的治疗，“生物导弹”的研制等都有广泛前景。

6.研究工作中用作“探针”，确定大分子生物物质在细胞中的分布及位置。

7.用于抗原物质的提取及纯化。

第四节基因工程抗体技术由于杂交瘤单克隆抗体为异源性蛋白，应用于人时易产生抗小鼠抗体，基因工程抗体通过基因工程技术改造现有优良的鼠单克隆抗体基因。

尽量减少抗体中鼠源成分，保留原有抗体特异性，从而创造出一种新型抗体。

一、人源化抗体人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。

1.人-鼠嵌合抗体此抗体为通过基因工程技术，将人IgG C区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。

2.抗体的表面修饰，使Fv表面人源化。

二、小分子抗体此为分子量小，具有抗原结合功能的分子片段，包括Fab，Fv，单链抗体，单区抗体等。

此种抗体分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗。

三、抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到多样性生物功能的融合蛋白，如：1.含Fv段的抗体融合蛋白：将Fv与某些毒素、酶、细胞因子基因拼连，通过这些抗体的引导，可将其生物活性物质导向靶细胞特定部位，所谓“生物导弹”。

2.嵌合受体：将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表达于细胞表面，称为嵌合受体，由于其介导的杀伤效应不受MHC限制，在过继性免疫治疗中有潜在应用价值。

3.含Fc的抗体融合蛋白：CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后由真核细胞表达。

此融合蛋白能竞争结合HIV，阻断HIV对敏感细胞的感染；还可介导ADCC及CDC，可通过胎盘。

四、双特异性抗体双特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可得到双特异性抗体。

双特异性抗体能同时结合两种抗原，因而可介导标记物与靶抗原结合或某些效应因子定位于靶细胞，在免疫学检测中可简化操作步骤，提高检验质量；应用双特异性抗体介导的药物杀伤效应可用于肿瘤等的治疗。

五、抗体库技术抗体库技术是指基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因，现有组合抗体库技术及菌体抗体库技术。

习题26 制备单克隆抗体常选用小鼠的哪类细胞作为饲养细胞A.中性粒细胞B.K细胞C.肥大细胞D.成纤维细胞E.腹腔细胞[答疑编号500734040101]『正确答案』E习题27 目前实验室常用的克隆化方法是A.显微镜操作法B.有限稀释法C.软琼脂平板法D.流式细胞仪筛选法E.免疫法[答疑编号500734040102]『正确答案』B『答案解析』将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化。

习题28 能在HAT培养基生长繁殖的细胞是A.小鼠脾细胞B.小鼠骨髓瘤细胞C.饲养细胞D.杂交瘤细胞E.免疫活性细胞[答疑编号500734040103]『正确答案』D『答案解析』细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。

只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT培养基上长期存活与繁殖，而骨髓瘤细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，不能生长。

第五章凝集反应本章考点1.概述2.直接凝集反应3.间接凝集反应第一节概述细菌、红细胞等颗粒抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称凝集反应。

凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。

凝集反应的特点：凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阴性或阳性；也可以进行半定量检测，即将抗体作一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。

由于凝集反应灵敏度高、方法简便，因而在临床检验中被广泛应用。

第二节直接凝集反应直接凝集反应：其原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称直接凝集反应。

参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体则称为凝集素。

从方法上来讲，有玻片法和试管法两类。

玻片法凝集主要用于抗原的定性分析，短时间便能观察结果，一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类AB0血型的测定。

试管凝集反应是用定量抗原悬液与一系列递度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，以判断待检血清中有无相应抗体及其效价，可以用来协助临床诊断或流行病原调查研究。

例如Widal反应、Well-Felix反应、输血时也常用于受体和供体两者间的交叉配血试验。

第三节间接凝集反应间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应。

根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式，间接凝集反应分为4类：①正向间接凝集反应；②反向间接凝集反应；③间接凝集抑制反应；④协同凝集反应。

图14 （正向）间接凝集反应（查抗体）图15 （反向）间接凝集反应（查抗原）图16 间接凝集抑制试验（查抗原）（上图为标本中含有待测抗原，下图为标本中无待测抗原，注意凝集说明标本中没有待测抗原）间接凝集反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测。

以载体来分，常用的为红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒等。