单克隆抗体与基因工程抗体的制备
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
1、单克隆抗体的概念 2、单克隆抗体的特点
பைடு நூலகம்
二、杂交瘤技术的基本原理
1、基本条件：
B淋巴细胞：高浓度抗原免疫小鼠的脾细胞 肿瘤细胞：骨髓瘤细胞 细胞融合剂：PEG 选择培养基：HAT
2、HAT的选择原理
脾-瘤 HAT培养基中生长
B淋巴细胞 PEG + 骨髓瘤细胞
瘤-瘤 HAT培养基中不生长 瘤 脾 5-7天死亡 脾-脾 细胞多聚体 死亡
hathat培养基中生长b淋巴细胞peg细胞多聚体死亡三b淋巴细胞杂交瘤技术流第一课件网网站www1kejiancom四人源性单克隆抗体1建立人人细胞杂交瘤系统困难重重的原因b细胞来源困难缺乏合适的亲本细胞基因工程抗体2小分子抗体第一课件网网站www1kejiancom
单克隆抗体的制备技术
一、单克隆抗体（McAb）
三、B淋巴细胞杂交瘤技术流 程
四、人源性单克隆抗体
1、建立人-人细胞杂交瘤系统困难重重的原因 B细胞来源困难 缺乏合适的亲本细胞
基因工程抗体
1、人-鼠嵌合抗体 2、小分子抗体
红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备的开题报告
红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备的开
题报告
1. 研究背景
血型是人体基因组中的重要表型，血型分类系统多种多样，主要有ABO血型系统和Rh血型系统。
血型抗原是血细胞表面的特定蛋白质和糖类成分，在输血和器官移植等医学实践中具有非常重要的意义。
因此，
对于血型抗原和抗体的研究和制备具有重要的意义。
目前，红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体成为了研究的热点，
这些抗体的制备可通过某些特异性标志物筛选肝炎病毒抗体、瘤细胞表
面分子抗体、药物代谢酶等。
由于这些抗体具有很高的特异性、敏感性
和稳定性，因此已被广泛用于诊断、治疗以及实验室研究等领域。
2. 研究目的
本研究旨在制备红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体，探究不同
制备方法以及对不同固定的红细胞抗原的适用性，为医学实践提供支持。
3. 研究方法
（1）红细胞血型单克隆抗体的制备
提取出兔、鼠或小鼠等动物的淋巴细胞后，与牛红细胞或猪红细胞
等固定红细胞进行融合，制备出单克隆抗体。
（2）基因工程抗体的制备
采用重组DNA技术合成特定的单克隆抗体，通过细胞处理和分离纯化，制备出基因工程抗体。
4. 研究进展和计划
目前，我们已经完成了红细胞血型单克隆抗体的制备，同时对基因
工程抗体的制备进行了初步实验。
下一步，我们将在不断实验和分析的
基础上，优化制备方法和条件，进一步探究两种抗体对不同血型固定红细胞的适用性差异，完善有关的研究成果。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。
具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。
一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。
PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
单克隆抗体和基因工程抗体
疾病诊断和治疗
基因工程抗体可以用于疾病的 诊断和治疗，如肿瘤免疫治疗 、自身免疫性疾病治疗等。
药物研发
基因工程抗体可以作为药物研 发中的靶点筛选、药物设计和 优化等环节的重要工具。
基因工程抗体的优缺点
优点
基因工程抗体具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定抗原进行高灵敏度检测和靶向治疗；同时， 基因工程抗体可以通过基因工程技术进行改造和优化，提高其稳定性和功能。
抗体的分类和发展历程
天然抗体
由免疫系统自然产生的抗体，类型多样，特异性各 异。
单克隆抗体
通过杂交瘤技术制备的单一抗体，具有高度特异性 ，可用于治疗和诊断。
基因工程抗体
利用基因工程技术改造的抗体，如人源化抗体、小 分子抗体等，具有更好的治疗潜力和应用前景。
抗体的分类和发展历程
单克隆抗体技术最初诞生于20世纪70年代，由两位科学家Kohler 和Milstein发明。该技术通过将具有特定抗体的B淋巴细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出能够持续稳定产生单 一抗体的细胞系。单克隆抗体在临床治疗和诊断领域发挥了重要 作用，如治疗癌症、自身免疫性疾病等。
100%
生物治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫病、感 染性疾病等，通过与药物结合或 直接作用于靶点发挥作用。
80%
免疫学研究
用于研究免疫应答机制、细胞信 号转导等。
单克隆抗体的优缺点
优点
高度特异性、易于制备和纯化、 可大量生产、稳定性好等。
缺点
制备过程复杂、成本高、可能引 发免疫反应等。
03
基因工程抗体
挑战
机遇
单克隆抗体和基因工程抗体的研发和生产成 本较高，同时存在免疫原性和副作用等问题， 需要进一步研究和改进。
基因工程抗体研究进展及其临床应用
基因工程抗体研究进展及其临床应用一、引言基因工程抗体是基于人工合成的DNA序列，经过转染到适当的宿主细胞中，通过细胞的代谢和转录过程转化为抗体蛋白。
自20世纪70年代以来，基因工程抗体领域取得了长足的发展。
本文将对基因工程抗体的研究进展及其在临床应用中的应用进行详细介绍。
二、抗体研究进展1、抗体的结构与特性1.1 抗体的基本结构1.2 抗体的免疫学特性1.3 抗体的结构与功能关系2、基因工程抗体的制备方法2.1 体外基因合成法2.2 表达载体构建与转染2.3 细胞培养与抗体表达2.4 抗体纯化与鉴定3、基因工程抗体的改良与优化3.1 抗体亲和力改良3.2 抗体稳定性提高3.3 抗体毒性降低4、基因工程抗体的多样化应用4.1 体外诊断应用4.2 肿瘤治疗应用4.3 感染性疾病治疗应用4.4 自身免疫性疾病治疗应用三、基因工程抗体临床应用研究1、基因工程抗体在肿瘤治疗中的应用1.1 单克隆抗体的临床应用1.2 双特异性抗体的临床应用1.3 抗体药物联合治疗的临床应用2、基因工程抗体在感染性疾病治疗中的应用2.1 抗抗体的临床应用2.2 抗细菌抗体的临床应用3、基因工程抗体在自身免疫性疾病治疗中的应用3.1 抗体与自身免疫性疾病的关系3.2 自身免疫性疾病治疗中的抗体应用四、附件本文涉及的附件包括：- 图表：包括抗体结构示意图、抗体改良实验结果图等。
- 数据表格：包括基因工程抗体的制备方法比较表、抗体在不同疾病治疗中的临床应用表等。
五、法律名词及注释- 法律名词1：注释1- 法律名词2：注释2- 法律名词3：注释3。
抗体制备
二、免疫动物
为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
第十一章 抗体制备
抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：
RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体是由人工合成或修改的基因来产生的抗体，也称为重组抗体。
与传统的抗体不同，基因工程抗体不受限于动物来源，可以通过人工合成的方式来获得。
基因工程抗体的制备过程包括选择目标抗原、构建重组抗体基因、转染宿主细胞、高效表达和纯化等步骤。
因为基因工程抗体可以定制化地设计和制备，具有高度特异性和亲和力，因此在生物医学研究、临床诊断和治疗等方面具有广泛的应用前景。
常见的基因工程抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和重组抗体等。
其中，单克隆抗体是指由单一克隆细胞产生的抗体，具有高度特异性和一致性；人源化抗体是将动物源的抗体人源化，避免了人体免疫系统对异种抗体的攻击；嵌合抗体是将两种或以上不同来源的抗体结合起来产生的新型抗体，具有更广泛的抗原覆盖范围和高亲和力；重组抗体则是根据目标抗原的结构和性质，设计并合成新的抗体基因来产生新型抗体，具有更高的特异性和亲和力。
基因工程抗体的发展将会在生物医学领域带来更多的应用和发展机会，同时也将推动基础研究和药物研发的进步。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术掌握：1.杂交瘤技术的基本原理2.抗体工程的基本技术一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb）（一）概述：克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。
多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。
传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。
因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体−−→单个克隆→B−）淋巴细胞化学性质单一、特异性强的抗体（单克隆抗体细胞群①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。
②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。
单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。
（二）杂交瘤技术的基本原理1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。
2.细胞的选择与融合：(1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
(2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。
其具备以下特点为：①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率②稳定、易培养③自身不分泌Ig或CK④融合率高⑤是HGPRT缺陷株3.融合剂（fusogen）①引起融合的病毒：副粘病毒②化学制剂：聚乙二醇（PEG）③细胞电融合技术：电脉冲（三）选择培养基的应用1.细胞融合是一个随机的物理过程。
融合后可能出现以下情况：①脾细胞与瘤细胞②瘤细胞与瘤细胞③脾细胞与脾细胞④未融合的瘤细胞⑤未融合的脾细胞⑥细胞多聚体形式2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基细胞的DNA合成一般有两条途径：(1)主要途径：糖和氨基酸→核苷酸→DNA(2) 替代途径：1) 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：①次黄嘌呤（hypoxanthine，H）②甲氨蝶呤（aminopoterin，A）③胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）2)三者取前缀缩写为HAT培养基3)原理：叶酸作为重要的辅酶参与DNA主要合成过程，氨基喋呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该主要合成途径。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备共68页文档
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
单克隆社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
抗体制备
一、多克隆抗体
用抗原免疫动物后获得的免疫血清（ 抗血清），由不同克隆的B细胞针对不 同抗原决定簇所产生得多种免疫球蛋 白。
二、 单克隆抗体
• 概念： 一个B细胞针对一个抗原决定簇所产生 的一种特异性抗体 • 特点： 高特异性、高均一性 • 应用广泛
单克隆和多克隆抗体的比较和用途
特异性 敏感性 均一性 PcAb 低 差 无 McAb 高 强 有
1、用于免疫学检测，辅助临 床诊断
2、McAb用于亲和层析，分 离微量可溶性抗原
3、标记的McAb用于基础研 究，了解细胞分化等 4、制备生物导弹用于肿瘤、 移植等的临床治疗。
三、基因工程抗体
• 解决抗体的鼠源性问题 • 制备部分或完全人源化抗体 1. 将部分或完全人源化抗体的编码基因克 隆到真核或原核表达系统，体外表达人 －鼠嵌合或人源化抗体。 2. 转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠 体内，主动免疫诱生人源抗体。
简述单克隆抗体制备原理。
简述单克隆抗体制备原理。
单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。
单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。
2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。
3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。
4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。
随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。
5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。
单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。
随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。
单克隆抗体与基因工程抗体制备
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
2019/12/26
McAb 纯化及鉴定
单克隆抗体特性
• 优点： 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种 抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于 实验标准化和大量制备
2019/12/26
融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 （寿命短，5-7天死亡） 杂交瘤细胞 （分泌抗体和永生性） 未融合的瘤细胞
2019/12/26
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT
2.主要途径：
氨基 酸
鸟嘌呤核苷酸
谷 氨 酰 胺 （A-）
尿核苷单磷酸
2019/12/26
阳性杂交瘤细胞的筛选
• 杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数 是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培 养孔生长多个细胞群落，必须筛选。
• 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。
• 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
胸腺嘧啶核苷酸
TK
3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
2019/12/26
HAT选择培养基的原理
• HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
2019/12/26
抗原免疫的脾细胞
小鼠骨髓瘤细胞
单克隆抗体与基因工程抗体制备
2019/12/26
单克隆抗体和基因工程抗体的制备 ppt课件
课件
11
(二) 杂交瘤细胞的选择性培养
杂交瘤细胞的筛选： 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后， 可融合 成不同类型的融合体， 正常的脾细胞在培养基中存活 仅5~7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易 死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出真正的杂交瘤细胞， 必须进行选择 性培养。目前，常用HAT培养基。 HAT培养基：
课件 13
细胞DNA生物合成途径示意图
糖+氨基酸
正常途径
氨基喋呤(A)
次黄嘌呤(H) HMP
HGPRT
核苷酸Βιβλιοθήκη 核苷酸前体DNA应急途径
TK
胸腺嘧啶(T) 课件
TMP
14
用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择 出来的缺乏 HGPRT 的细胞株，所以在 HAT选择培养基中不能生长。只有杂交 瘤细胞具有亲代双方的遗传特性，即既 有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力 又有 B细胞经辅助途径合成 DNA 的能力， 故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。
课件
7
2．小鼠骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。
课件
8
用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞 应符合的条件
①本身不分泌免疫球蛋白； ②为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase ， HGPRT ） 或 胸 腺 嘧 啶 激 酶 （ thymidinekinase，TK）缺陷的细胞株； ③瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞； ④与B细胞融合率高。
课件
3
第一节 杂交瘤技术的基本原理
克隆抗体与基因工程抗体的制备
基因工程抗体的制备流程
抗体基因的克隆和表达载体构建
从免疫动物或细胞中分离出抗体基因，并将其插 入到表达载体中，以便在宿主细胞中表达。
抗体分子的分离和纯化
从表达抗体分子的细胞中提取、分离和纯化抗体 分子，确保其质量和特异性。
ABCD
宿主细胞的转化和筛选
将构建好的表达载体导入宿主细胞，通过筛选获 得能够表达目标抗体的细胞株。
生物药物
单克隆抗体可以作为药物载体，用于 导向治疗和放射免疫显像技术等领域。
02
基因工程抗体的制备
基因工程抗体的概念
基因工程抗体是指利用基因工程技术 ，通过人工设计和合成抗体分子，以 实现对特定抗原的特异识别和结合。
基因工程抗体可以克服传统抗体制备 方法的限制，实现大规模、高效、定 向的抗体生产，为生物医学研究和治 疗提供更多可能性。
克隆抗体与基因工程 抗体的制备
目录
• 克隆抗体的制备 • 基因工程抗体的制备 • 克隆抗体与基因工程抗体的比较 • 未来展望
01
克隆抗体的制备
克隆抗体的概念
抗体克隆
指将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤 细胞融合，形成杂交瘤细胞，并筛选 出能产生所需抗体的细胞系的过程。
单克隆抗体
杂交瘤细胞
融合后的杂交瘤细胞既具有瘤细胞无 限增殖的能力，又具有B淋巴细胞产 生抗体的功能。
03
克隆抗体与基因工程抗体 的比较
制备方法的比较细胞中提取出B淋巴细胞，经融合后形成 杂交瘤细胞，再筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞株，进行培养制备。
基因工程抗体
利用基因工程技术，将抗体的基因在细胞或微生物中进行表达，通过基因重组 技术构建抗体库，筛选出所需抗体。
抗体偶联技术
发展新型的抗体偶联技术， 将抗体与其他药物或放射 性标记物偶联，实现精准 治疗和诊断。
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抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性
CATATG
GTATAC
NdeI
TC TAGA
AGATC T
XbaI
CA TATG GTAT AC
T CTAGA AGATC T
PCR扩增
通过扩增获取足够的联结片段
实验步骤
1、按下列体系配制反应混合液，混匀，
Template cDNA
5.0 μL
10×buffer
2.5 μL
MgCl2（25mmol/L）
由一个B 淋巴细 胞增殖 而成的 细胞集
团
杂交瘤技术的理论基础
➢淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克 隆只产生一种抗体 ➢细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方 亲代细胞的特性 ➢利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克 隆化，制备McAb ➢当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一 起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核 体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细 胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。
一、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/ 只
体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除
腹腔注射法
二、McAb的纯 化
盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析
三、 单克隆抗体的性质鉴定
Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体 40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot
基因工程的操 作技术
1、体外基因重组
• 目的基因的制备
• 载体的构建：质粒或
噬菌体
•
目的基因与载体重组
2、重组体DNA的转 化增殖和表达 • 转化 • 筛选 • 增殖和基因表达
Foreign DNA to be inserted
+
Plansmid vector Joining
Recombinant DNA molecule
基因工程抗体制备 一、基因工程抗体种类 二、原理 三、重组抗原制备过程
基本概念 是指抗原分子中
针对多种抗原决 定簇的混合抗体
决定抗原特异性 的特殊化学基团，
又称表位
➢抗原决定簇（抗原表位） (epitope).
➢细胞克隆
➢多克隆抗体 ➢单克隆抗体
由单个B细胞克 隆产生的针对单 一抗原决定簇的
同源抗体
阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法 特点：
不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细 胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
酸，通常为A。因此，Taq DNA聚
合酶扩增的产物可与 T-载体进行 粘端互补连接，达到高效克隆的 目的。因为TA克隆法操作最简单， 快速和高效的原因，成为Taq聚合 酶PCR产物的最佳克隆方法。
试剂与器材
1、材料：纯化的PCR产物 2、试剂 （1）LB液体培养基 （2）1.5%琼脂LB固体培养基 （3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL) （4）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL) （7）pEASY-Blint载体系统 3、仪器
基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在
基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。 主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。
一、人源化抗体
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小 鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大 量完全人源化抗体
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成 的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡； HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻
杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK与提供淋巴细胞的动物品系相同
（二）免疫脾细胞
动 物：
BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重
免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
Cloning
PCR(聚合酶链式反应)
AACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATG
GAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACC
ACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTC
ACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGC
全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、 超净工 作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统
实验步骤
TA质粒的构建
⑴连接反应一般在灭菌的0.5mL离心管中进行。
⑵10μL体积反应体系中：
pEasy载体
1μL
纯化的PCR产物
3μL
⑶轻轻混匀，室温下放置反应10min。
PCR产物 T载体
连接缓冲液 连接酶
1.0μL
Primer1 (10μmol/L) 0.5 μL
Primer2 (10μmol/L) 0.5 μL
dNTP（2 mmol/L）
2.0 μL
Taq酶（5U/μL）
0.25μL 混匀
加ddH2O至
50 μL
2、PCR 反应循环条件设置
94℃变性反应1min；55℃退火反应45s；
72℃延伸反应1min。进行25个循环后， 最后一个循环72℃延长至10min。迅速 冷却4℃。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
杂交瘤技术
流 程
（一）小鼠骨髓瘤细胞
室温10min
转化大肠杆菌
铺平板 37℃过夜
转化 （1）取一装有的100μL感受态细胞的EP管，加入上一步联结 产物，冰浴上放置30min。 （2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，热激45s，快速 转移到冰浴中放置2 min。 （3）向每个EP管加入500μL的 LB培养基，转移至37℃恒温 摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。 （4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB 平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40μL和20mg/mL的 IPTG 40μL），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂 平板表面。 （5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃ 过夜培养。
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)
50% PEG 1min内加完; 10ml培养液终止反应
去离子水 缓冲液 dNTP 引物 模板
DNA聚合酶
实验结果
12
1.PCR产物 2.Marker
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR片段的TA克隆
实验原理
T载体的特点是将普通的克隆 载体切成线状，并使之在3' 末端 含有一个凸出碱基T；Taq DNA聚 合酶具有末端转移酶的活性，可 在DNA片段的3'末端添加一个核苷
二、小分子抗体
Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体
三、抗体融合蛋白 其它生物活性蛋白融合
四、双特异性抗体
许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分 子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤 抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体 连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别， 取得杀伤肿瘤细胞的作用。