单克隆抗体与基因工程抗体的制备

ATGA
酶切位
点ห้องสมุดไป่ตู้
上游引物：HF1>5’ CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3’>
下游引物：HF2>5’ GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3’>
限制性内切酶
限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末 端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应。
二、小分子抗体
Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体
三、抗体融合蛋白 其它生物活性蛋白融合
四、双特异性抗体
许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分 子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤 抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体 连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别， 取得杀伤肿瘤细胞的作用。
融合细胞的早期培养
7～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆
杂交瘤细胞的选择性培养
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA
全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、 超净工 作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统
实验步骤
TA质粒的构建
⑴连接反应一般在灭菌的0.5mL离心管中进行。
⑵10μL体积反应体系中：
pEasy载体
1μL
纯化的PCR产物
3μL
⑶轻轻混匀，室温下放置反应10min。
PCR产物 T载体
连接缓冲液 连接酶
不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK与提供淋巴细胞的动物品系相同
（二）免疫脾细胞
动 物：
BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重
免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性
四、单克隆抗体的特性
（一）单克隆抗体的特性
高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性
单克隆抗体的优点与局限性
优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗 体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
AACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATG
GAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACC
ACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTC
ACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGC
基因工程抗体制备 一、基因工程抗体种类 二、原理 三、重组抗原制备过程
基本概念 是指抗原分子中
针对多种抗原决 定簇的混合抗体
决定抗原特异性 的特殊化学基团，
又称表位
➢抗原决定簇（抗原表位） (epitope).
➢细胞克隆
➢多克隆抗体 ➢单克隆抗体
由单个B细胞克 隆产生的针对单 一抗原决定簇的
同源抗体
五、噬菌体抗体库技术
定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体， 转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特 异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全 人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治 疗方面有其独特的优越性
原理与操作技术
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的 方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源 DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重 组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因 DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖 （cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得 基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。
室温10min
转化大肠杆菌
铺平板 37℃过夜
转化 （1）取一装有的100μL感受态细胞的EP管，加入上一步联结 产物，冰浴上放置30min。 （2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，热激45s，快速 转移到冰浴中放置2 min。 （3）向每个EP管加入500μL的 LB培养基，转移至37℃恒温 摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。 （4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB 平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40μL和20mg/mL的 IPTG 40μL），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂 平板表面。 （5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃ 过夜培养。
局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
McAb与PcAb的比较
抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本
McAb 可以不纯 高 高 低 无 高
PcAb 纯度高
低 低 高 有 低
McAb and PcAb
基因工程抗体制备
基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在
基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。 主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。
一、人源化抗体
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小 鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大 量完全人源化抗体
CATATG
GTATAC
NdeI
TC TAGA
AGATC T
XbaI
CA TATG GTAT AC
T CTAGA AGATC T
PCR扩增
通过扩增获取足够的联结片段
实验步骤
1、按下列体系配制反应混合液，混匀，
Template cDNA
5.0 μL
10×buffer
2.5 μL
MgCl2（25mmol/L）
PCR技术原理示意图
循环1 Tag酶
循环2
靶序列 变性和引 物复姓
链延伸
变性和引 物复姓
循环3
链延伸
抗原的原核表达
以脂肪酸结合蛋白（FABP）为例： 首先要合成或购买表达FABP的基因序列并设计合 成引物
基因序列
ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAA
细胞融合
SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置 45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG 作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每 孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT 培养液
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成 的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡； HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻
杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
由一个B 淋巴细 胞增殖 而成的 细胞集
团
杂交瘤技术的理论基础
➢淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克 隆只产生一种抗体 ➢细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方 亲代细胞的特性 ➢利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克 隆化，制备McAb ➢当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一 起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核 体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细 胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
杂交瘤技术
流 程
（一）小鼠骨髓瘤细胞
1.0μL
Primer1 (10μmol/L) 0.5 μL
Primer2 (10μmol/L) 0.5 μL
dNTP（2 mmol/L）
2.0 μL
Taq酶（5U/μL）
0.25μL 混匀
加ddH2O至
50 μL
2、PCR 反应循环条件设置
94℃变性反应1min；55℃退火反应45s；
72℃延伸反应1min。进行25个循环后， 最后一个循环72℃延长至10min。迅速 冷却4℃。
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)
50% PEG 1min内加完; 10ml培养液终止反应
阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法 特点：
不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细 胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
去离子水 缓冲液 dNTP 引物 模板
DNA聚合酶
实验结果
12
1.PCR产物 2.Marker
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR片段的TA克隆
实验原理
T载体的特点是将普通的克隆 载体切成线状，并使之在3' 末端 含有一个凸出碱基T；Taq DNA聚 合酶具有末端转移酶的活性，可 在DNA片段的3'末端添加一个核苷
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
Cloning
PCR(聚合酶链式反应)
基因工程的操 作技术
1、体外基因重组
• 目的基因的制备
• 载体的构建：质粒或
噬菌体
•
目的基因与载体重组
2、重组体DNA的转 化增殖和表达 • 转化 • 筛选 • 增殖和基因表达
Foreign DNA to be inserted
+
Plansmid vector Joining
Recombinant DNA molecule
GAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTAC
CAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAA
AGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAG
AACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGAC
一、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/ 只
体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除
腹腔注射法
二、McAb的纯 化
盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析
三、 单克隆抗体的性质鉴定
Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体 40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot
酸，通常为A。因此，Taq DNA聚
合酶扩增的产物可与 T-载体进行 粘端互补连接，达到高效克隆的 目的。因为TA克隆法操作最简单， 快速和高效的原因，成为Taq聚合 酶PCR产物的最佳克隆方法。
试剂与器材
1、材料：纯化的PCR产物 2、试剂 （1）LB液体培养基 （2）1.5%琼脂LB固体培养基 （3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL) （4）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL) （7）pEASY-Blint载体系统 3、仪器