单克隆抗体和基因工程抗体的制备优秀课件

三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
杂交瘤细胞形成的初期很不稳定， 鼠的二倍体细胞有40对染色体，杂交后 80对，易丢失，丢失后仍生长，要检测 上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。
1. 淋巴瘤细胞系的选择 1）体外无限制快速生长 2）融合率高 3）不分泌淋巴因子和杀伤功能 4）缺乏某一特异性表面抗原或受体 5）HGPRT 酶缺陷型
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2.特异性T细胞的制备与纯化主要有 可溶性抗原诱导激活的 T 细胞、同种反 应性T 细胞、人的特异性 T 细胞。
3.T 细胞杂交瘤的筛选
通常在含有HAT选择培养基上， 用特异性抗体筛选产生淋巴因子的 杂交瘤细胞，用抗 CD3-TCR 抗体筛 选阳性细胞。
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1. 稳定、易培养
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2. 自身不分泌Ig或CK
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3. 融合率高
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4. 是HGPRT缺陷株
目前常用的BALB/c小鼠B细胞瘤株有P3X63-Ag8.653C （ P3.653 ） 、 Sp2/0 等 。 为 HAT敏感株，易培养, 融合率高，最常选用 聚乙二醇(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容 易融合。
（二）选择培养基的应用
细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可 能出现以下情况:
1）脾细胞与瘤细胞 2）瘤细胞与瘤细胞 3）脾细胞与脾细胞 4）未融合的脾细胞 5）未融合的瘤细胞 6）多聚体形式。 3）、4）、6）在体外易死去，不需筛选。
细胞的 DNA 合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物 合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是 重要辅酶。
所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细 胞及 5) 未融合的瘤细胞不能生长，只有 1） 脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为
HGPRT 阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤 阻断的主要途径。
（三）有限稀释与抗原特异性选择
在免疫动物时，一种抗原往往有多个表 位 ，一个B细胞克隆接受一个表位，故在 免疫动物时是众多 B 细胞克隆的抗体的分 泌，而针对目的抗原的B细胞只占很少部分 ，在细胞融合后，有相当一部分是无关的 细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的 抗体，要进行筛选，分二步稀释。
计数，每个孔只放一个细胞，实际是0 至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞 株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细 胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培 养或动物接种。
• 另外还有其他杂交瘤技术，如人-人 B 淋巴细胞杂交瘤和鼠-人 B 淋巴细胞杂 交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难， 生长不稳定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的γ、κ链。B细胞取外周血淋巴细胞、 脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细 胞。从理论上讲很好，但实际比较困难， 在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获 得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞 不能在小鼠或其他动物体内生长。
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• 小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技 术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率 较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳 定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的 染色体。
二、T 细胞杂交瘤
自 B 细胞杂交瘤技术后，T 淋巴细胞 杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深 入地研究T细胞的各种功能，虽然有一些小 鼠T细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意， 该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性， 一种T细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子， 到目前仍无突破性进展。
一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺 嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRT）和 胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase,TK）的催化作用合成 DNA。
氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶 呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合 的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌 呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤 (aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷 (thymidine,T)，三者取前缀缩写为 HAT 培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒 性培养基选择出来的 HGPRT 阴性细胞株。
• 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原 结合部位完全相同，生物活性专一，特异性 强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大 量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比 较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植 及自身免疫病等。
第一节 杂交瘤技术的基本原理
基本原理是融合的两种细胞保持 自身的特性，产生具有原来两个细 胞基因信息的单个核细胞称为杂交 细胞。包括B细胞、T细胞，前者产 生Ig，后者产生CK。
单克隆抗体和基因工程抗体的 制备优秀课件
目的要求 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理 2. 熟悉单克隆抗体的制备技术 3. 熟悉基因工程抗体技术
概述
大多数抗原分子具有多个抗原决定 簇（表位，epitope）。一个抗原决定 簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗 体称为多克隆抗体（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一个 只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody,McAb)。
一、B 淋巴细胞杂交瘤技术
细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞。B细胞能产生抗体， 但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞 不产生抗体但在体外能长期生长，二者 融合，各保持其本性，既产生抗体又长 期生长。
其原理分为几个步骤
（一）细胞的选择与融合
目的是制备抗原特异的 McAb，所 以融合的细胞必须经抗原免疫的B细胞， 通常取脾，另一是在体外长期生长又 不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发 性骨髓瘤细胞，具备以下特点：
T 淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人， 由于 T 细胞功能的多样化，制备出的 T 细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋 巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因 子，自身反应性等。其基本过程是将激 活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞 融合，可表达特异性 TCR 或其他功能 的杂交瘤T细胞，与 B 细胞相以，但细 胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳 定，简介主要步骤 。