单克隆抗体及基因工程抗体制备技术
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
1、单克隆抗体的概念 2、单克隆抗体的特点
பைடு நூலகம்
二、杂交瘤技术的基本原理
1、基本条件：
B淋巴细胞：高浓度抗原免疫小鼠的脾细胞 肿瘤细胞：骨髓瘤细胞 细胞融合剂：PEG 选择培养基：HAT
2、HAT的选择原理
脾-瘤 HAT培养基中生长
B淋巴细胞 PEG + 骨髓瘤细胞
瘤-瘤 HAT培养基中不生长 瘤 脾 5-7天死亡 脾-脾 细胞多聚体 死亡
hathat培养基中生长b淋巴细胞peg细胞多聚体死亡三b淋巴细胞杂交瘤技术流第一课件网网站www1kejiancom四人源性单克隆抗体1建立人人细胞杂交瘤系统困难重重的原因b细胞来源困难缺乏合适的亲本细胞基因工程抗体2小分子抗体第一课件网网站www1kejiancom
单克隆抗体的制备技术
一、单克隆抗体（McAb）
三、B淋巴细胞杂交瘤技术流 程
四、人源性单克隆抗体
1、建立人-人细胞杂交瘤系统困难重重的原因 B细胞来源困难 缺乏合适的亲本细胞
基因工程抗体
1、人-鼠嵌合抗体 2、小分子抗体
抗体基础知识
School of Medicine
教案首页
第 次课
授课时间 年 月 日
课程名称 免疫学检验 年 级
教师
张荣波
专业技术 职务
教案完成时间： 年 月 日
专业、层次
医学检验（本科）
授课方式 （大、小）
大 学时 4
授课题目（章、节）
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特 征。当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有 两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞
基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括 B 淋巴细胞杂 交细胞和 T 淋巴细胞杂交细胞。
3
辅助手段和时间 分配备注
基本内容
第三节 基因工程抗体技术 随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基因 工程抗体改造现有优良的鼠单克隆抗体的基因，尽量减少抗体中的鼠源成 分，保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体．基因工程抗体。 一、人源化抗体 人源化抗体以基因克隆及 DNA 重组技术改造将鼠源性单克隆抗体使其 大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既保留了亲本鼠克隆抗体的亲合力 和特异性，又降低了鼠单克隆抗体的异源性。 (一)人一鼠嵌合抗体 人一鼠嵌合抗体是通过基因工程技术将人 IgC 区与鼠 IgV 区连接，导 入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体。人一鼠嵌合抗体的特异性及亲合 力与亲本鼠单克隆抗体等同，但在人体内的半衰期可明显延长。 (二)抗体的表面修饰 通过改变 Ig 可变区表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性。将 亲本鼠单克隆抗体 Fv 段表面暴露的骨架区中与人不同者改为人源性，使 Fv 的表面人源化，消除其免疫原而不影响 Fv 的整体空间构象。 二、小分子抗体 将抗体分子的抗原结合部位组建成分子量较小，但具有抗原结合功能 的分子片段，称为小分子抗蠢小分子抗体具有以下特点：可在大肠杆菌等 原核细胞表达生产成本降低；易于穿透血管或组织到脚胞部位，有利于疾 病的治疗；不含 Fc 段，副作用小；半衰期短，有利于毒素中和及清除。其 包括： （一）Fab 由一条完整的 L 链和一条约 1/2 的 H 链组成，只有一个抗原结合位点。 （二）Fv 和单链抗体（ScFv） Fv 由 VH 和 VL 构成，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段。 把 VH 和 VL 用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，使之表达为单一的肽链， 称为 ScFv。 （三）单区抗体及最小识别单位 单独重链可变区（VH）仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比 VL 大，称为单区抗体。
基因工程制备抗体方案有哪些
基因工程制备抗体方案有哪些引言抗体是一种可以识别并结合特定抗原的蛋白质，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
传统制备抗体的方法主要是从动物（如小鼠、兔子等）中提取抗体，但该方法存在一些缺点，如周期长、成本高、质量不稳定等。
因此，基因工程技术的发展使得制备抗体的方法得到了革命性的改变，可以通过基因工程技术在体外合成抗体，提高了抗体的质量和稳定性。
本文将介绍基因工程制备抗体的方法和流程，包括抗体的选择和克隆、表达、纯化和鉴定等环节。
通过基因工程方法获得的抗体，可以应用于药物研发、医学诊断、生物学研究等领域，具有广阔的应用前景。
1. 抗体的选择和克隆（1）抗原的选择制备抗体的第一步是选择合适的抗原。
抗原是引发免疫反应的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖、药物等。
根据需要制备的抗体类型，可以选择相应的抗原。
例如，如果需要制备单克隆抗体，可选择单个抗原蛋白作为抗原进行制备。
（2）抗体基因的克隆在选择了合适的抗原后，下一步是将抗体基因克隆到表达载体中。
通常可以利用PCR方法从免疫细胞中扩增出抗体基因，并将其插入表达载体中。
选择合适的表达载体是非常重要的，通常选择在哺乳动物细胞或大肠杆菌中表达。
2. 抗体的表达（1）表达载体的构建在决定抗体表达载体后，接下来是进行表达载体的构建。
通常表达载体包括启动子、终止子、选择标记基因等，通过合成或限制性内切酶切割等方法将抗体基因插入表达载体中。
（2）转染和筛选将构建好的表达载体导入宿主细胞中，可以通过转染等方法实现。
转染后，需要进行筛选，筛选出表达抗体的稳定细胞株。
通常可以利用克隆技术选取高表达的细胞株。
3. 抗体的纯化（1）细胞培养和收获经过筛选的稳定细胞株可以进行大规模培养，收获细胞培养上清液。
（2）亲和层析纯化常用的抗体纯化方法包括亲和层析纯化。
可以利用蛋白A/G或其他具有特异性结合抗体的配体进行纯化。
通过这种方法可以高效地将目标抗体从细胞培养上清液中纯化出来。
4. 抗体的鉴定（1）免疫印迹（Western blot）通过Western blot方法，可以验证纯化得到的抗体是否具有结构完整，是否与目标抗原结合。
生物制药的创新技术
生物制药的创新技术生物制药是利用生物技术生产药物的一种制药方式，其产品主要包括蛋白质药物、抗体药物、疫苗等。
随着生物技术的不断发展，生物制药领域的创新技术也在不断涌现，为药物研发和生产带来了新的机遇和挑战。
本文将重点介绍生物制药领域的创新技术，包括基因工程、单克隆抗体技术、基因编辑技术等。
一、基因工程技术基因工程技术是生物制药领域最重要的创新技术之一。
通过基因工程技术，科学家可以将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目标蛋白，从而实现大规模生产药物的目的。
基因工程技术的应用使得生物制药领域的药物研发周期大大缩短，同时也提高了药物的纯度和效力。
基因工程技术的核心是重组DNA技术，包括DNA的克隆、DNA的测序、DNA的合成等。
通过重组DNA技术，科学家可以构建携带目标基因的载体，并将其导入宿主细胞中，使其表达目标蛋白。
目前，基因工程技术已经成功应用于生产多种重要的生物制药产品，如胰岛素、生长激素、干扰素等。
二、单克隆抗体技术单克隆抗体技术是生物制药领域的又一项重要创新技术。
单克隆抗体是指来源于同一克隆细胞的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
单克隆抗体技术通过对抗体的基因进行克隆和表达，可以大规模生产具有特定功能的单克隆抗体，用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体技术的应用为个性化医疗提供了新的途径。
通过对患者的基因信息和病理特征进行分析，科学家可以设计和生产针对特定靶点的单克隆抗体，实现精准治疗。
目前，单克隆抗体已经成为生物制药领域的主力产品之一，为临床治疗带来了革命性的变革。
三、基因编辑技术基因编辑技术是近年来兴起的一项新兴生物技术，也被广泛应用于生物制药领域。
基因编辑技术通过精准编辑基因组中的特定序列，可以实现基因的插入、修饰、删除等操作，为药物研发和生产提供了全新的思路和方法。
CRISPR-Cas9技术是目前应用最广泛的基因编辑技术之一。
通过设计特定的引物和Cas9蛋白，科学家可以实现对基因组的高效编辑，从而修正遗传病变、增强药物的疗效等。
临床医学检验技师初级(师)临床免疫学及检验(单克隆抗体与基因工程抗体制备技术)-试卷1
临床医学检验技师初级（师）临床免疫学及检验（单克隆抗体与基因工程抗体制备技术）-试卷1(总分：60.00，做题时间：90分钟)一、 A1型题(总题数：17，分数：34.00)1.下列关于杂交瘤细胞特点的错误描述是（分数：2.00）A.具备了双亲细胞的特点B.分泌人源性单克隆抗体√C.分泌鼠源性单克隆抗体D.体外繁殖快速E.能分泌抗体解析：解析：杂交瘤细胞是两个不同特性的细胞融合成一个异型核细胞，这两种细胞分别是小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，分泌鼠源性单克隆抗体。
2.杂交瘤技术中最常用的骨髓瘤细胞株是（分数：2.00）A.NS-1和SP2／0细胞株√B.NS-2株C.SP5株D.HPG-2E.HAILA解析：解析：杂交瘤技术中最常用的骨髓瘤细胞株是NS一1和SP2／0细胞株。
3.HAT培养基中三种关键成分为（分数：2.00）A.次黄嘌岭、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷√B.黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷C.氨基嘌岭、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷D.腺嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷E.鸟嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷解析：解析：HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤 (aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。
4.阳性杂交瘤细胞的克隆化培养方法不包括（分数：2.00）A.有限稀释法B.无限稀释法√C.显微操作法D.荧光激活细胞分选仪E.软琼脂平板法解析：解析：阳性杂交瘤细胞的克隆化(单个细胞培养)方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。
5.实验室最常用的阳性杂交瘤细胞的克隆化方法是（分数：2.00）A.无限稀释法B.有限稀释法√C.荧光激活细胞分选仪D.软琼脂平板法E.显微操作法解析：解析：阳性杂交瘤细胞的克隆化(单个细胞培养)方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。
具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。
一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。
PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
单克隆抗体和基因工程抗体
疾病诊断和治疗
基因工程抗体可以用于疾病的 诊断和治疗，如肿瘤免疫治疗 、自身免疫性疾病治疗等。
药物研发
基因工程抗体可以作为药物研 发中的靶点筛选、药物设计和 优化等环节的重要工具。
基因工程抗体的优缺点
优点
基因工程抗体具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定抗原进行高灵敏度检测和靶向治疗；同时， 基因工程抗体可以通过基因工程技术进行改造和优化，提高其稳定性和功能。
抗体的分类和发展历程
天然抗体
由免疫系统自然产生的抗体，类型多样，特异性各 异。
单克隆抗体
通过杂交瘤技术制备的单一抗体，具有高度特异性 ，可用于治疗和诊断。
基因工程抗体
利用基因工程技术改造的抗体，如人源化抗体、小 分子抗体等，具有更好的治疗潜力和应用前景。
抗体的分类和发展历程
单克隆抗体技术最初诞生于20世纪70年代，由两位科学家Kohler 和Milstein发明。该技术通过将具有特定抗体的B淋巴细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出能够持续稳定产生单 一抗体的细胞系。单克隆抗体在临床治疗和诊断领域发挥了重要 作用，如治疗癌症、自身免疫性疾病等。
100%
生物治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫病、感 染性疾病等，通过与药物结合或 直接作用于靶点发挥作用。
80%
免疫学研究
用于研究免疫应答机制、细胞信 号转导等。
单克隆抗体的优缺点
优点
高度特异性、易于制备和纯化、 可大量生产、稳定性好等。
缺点
制备过程复杂、成本高、可能引 发免疫反应等。
03
基因工程抗体
挑战
机遇
单克隆抗体和基因工程抗体的研发和生产成 本较高，同时存在免疫原性和副作用等问题， 需要进一步研究和改进。
单克隆抗体与基因工程抗体制备
ATGA
酶切位
点
上游引物：HF1>5’ CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3’>
下游引物：HF2>5’ GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3’>
限制性内切酶
限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末 端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应。
基因工程的操 作技术
1、体外基因重组
目的基因的制备
载体的构建：质粒或
噬菌体
目的基因与载体重组
2、重组体DNA的转 化增殖和表达 转化 筛选 增殖和基因表达
Foreign DNA to be inserted
+
Plansmid vector Joining
Recombinant DNA molecule
酸，通常为A。因此，Taq DNA聚
合酶扩增的产物可与 T-载体进行 粘端互补连接，达到高效克隆的 目的。因为TA克隆法操作最简单， 快速和高效的原因，成为Taq聚合 酶PCR产物的最佳克隆方法。
试剂与器材
1、材料：纯化的PCR产物 2、试剂 （1）LB液体培养基 （2）1.5%琼脂LB固体培养基 （3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL) （4）异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL) （7）pEASY-Blint载体系统 3、仪器
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
抗体制备
二、免疫动物
为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
第十一章 抗体制备
抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：
RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
抗体的制备
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C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子 进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、 中、小三种。属区带分离法。
D、离子交换层析：利用带离子基团的纤维 或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
.
25
E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的 专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。
+ 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） + 分子的质量—电泳、质谱
+ 蛋白的纯度—电泳等
+ 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
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(二)半抗原免疫原的制备：利用某些功能
团将半抗原连接到载体上。
1、载体的选择： A、蛋白质：人/牛/兔白蛋白、牛甲状腺球蛋
白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。
B、多肽聚合物：多为人工合成(多聚赖氨酸)。
B、明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生 氢氧化铝胶体。制备方法是：Ag+NS， 搅拌下缓慢滴入10%的硫酸铝钾溶液， 以NaOH校正pH至6.5，离心、NS洗 涤。
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C、福氏佐剂：分为不完全佐剂(石蜡油+ 羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊毛脂+卡 介苗)。1:1与抗原混合研磨均匀即可。 但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉 芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
E、表面活性剂处理：在一定的条件下，表 面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡， 使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。 提取核酸时常用此法。
F、自溶法：利用组织和微生物的自身酶系， 在一定条件下使细胞溶解。
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(2)蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定 要求纯化，可获得不同成分的抗原。
new单克隆抗体与基因工程抗体-han
三.功能区（domain）
轻链:VL，CL 重链:VH，CH1，CH2，CH3(IgG、IgA 和IgD) 多一个CH4（IgM和IgE）
功能区的主要功能：
VH和VL --- 抗原结合部位；
CH1～3和CL --- Ig遗传标志所在；
CH2(IgG)、CH3(IgM)---C1q结合部位；
CH2～CH3(IgG) --- 结合并通过胎盘； CH3(IgG)/CH4(IgE)--- FcR结合部位.
单价小分子抗体
• Fab抗体 • 单链抗体 • 单域抗体
单价小分子抗体
一、Fab抗体
Fab 段由重链 V 区及 CH1 功 能区与整个轻链以二硫键形式连 接而成，主要发挥抗体的抗原结 合功能。Fab抗体只有完整IgG的 1/3。
二、单链抗体(ScFv) 单链抗体 (ScFv) 是由 VH 和 VL 通 过连接肽（接头）重组并表达而成的
同分为可变区（V）和恒 定区（C）： 可变区（V区）：氨基酸 排列顺序随抗体特异性不 同变化较大 恒定区（C区）：氨基酸 数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定
V区的结构
• 超变区 • 决定簇互补区（CDR）：
– 三个高变区共同组成 – Ig的抗原结合部位， – 该部位也称为CDR Ig的独特型决定簇 骨架区(framework region,FR)
在嵌合抗体的基础上将鼠McAb V区中 FR替换成人的FR，保留与抗原结合的CDR 部位 (即CDR移植)
嵌合抗体图示
1-鼠MAb的可变区
+人抗体的恒定区
2-FR(framework region) 替换成人的FR
Fab抗体 单链抗体 单域抗体
种类
原理
嵌合抗体评价
生物制药新技术
生物制药新技术随着生物技术的不断发展，生物制药领域也迎来了一系列新技术的突破和应用。
这些新技术的出现不仅提升了生物制药的效率和质量，也为医药领域的发展带来了巨大的希望和潜力。
本文将就几个目前较为热门的生物制药新技术进行介绍和探讨。
一、基因工程技术基因工程技术作为生物制药领域中一项最为重要的技术之一，已经在许多传统药物的研发中取得了巨大的成功。
它通过改变目标生物的基因组，使其表达出特定的蛋白质，从而实现对药物的高效生产。
其中，重组DNA技术和基因编辑技术是基因工程技术中的两个重要组成部分。
通过重组DNA技术，科学家可以将目标基因导入到细胞中并进行表达，这种方法为生物制药提供了大量可靠的合成生物材料。
而基因编辑技术则可以对目标基因进行修饰和修改，从而进一步优化药物的特性和性能。
二、单克隆抗体技术单克隆抗体技术是一种能够高度特异性地识别和结合目标分子的技术。
它通过人工合成单一种类的抗体来取代传统的混合抗体制备方法，从而使得制备的抗体更加纯正和有效。
这种技术有广泛的应用领域，包括临床诊断、药物研发等。
在生物制药领域中，单克隆抗体技术可以用于生产和制备单克隆抗体药物，为治疗癌症、自身免疫性疾病等提供了新的治疗方案。
三、干细胞技术干细胞技术是一种能够在体外培养中无限分化并产生各种功能细胞的技术。
它具有广泛的应用前景，尤其在生物制药领域中的药物筛选和体外毒性测试方面发挥了重要作用。
通过将药物作用于干细胞上，科学家可以更好地了解药物对细胞的影响，并预测药物在人体内的作用和疗效。
此外，干细胞技术还可以用于器官移植和再生医学领域，为人类的健康提供更多可能性。
四、基因测序技术基因测序技术是指对目标生物体的基因组进行全面和系统的测序分析。
它可以帮助科学家更好地了解生物体的遗传信息，从而为生物制药的研发提供有效的参考。
基因测序技术的发展不仅有助于药物靶点的发现和筛选，也可用于研究药物代谢途径和药物安全性评估。
此外，基因测序技术还可用于个体化药物治疗的实施，通过对患者基因组的测序分析，可以为医生提供更加精准的用药方案。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术掌握：1.杂交瘤技术的基本原理2.抗体工程的基本技术一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb）（一）概述：克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。
多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。
传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。
因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体−−→单个克隆→B−）淋巴细胞化学性质单一、特异性强的抗体（单克隆抗体细胞群①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。
②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。
单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。
（二）杂交瘤技术的基本原理1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。
2.细胞的选择与融合：(1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
(2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。
其具备以下特点为：①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率②稳定、易培养③自身不分泌Ig或CK④融合率高⑤是HGPRT缺陷株3.融合剂（fusogen）①引起融合的病毒：副粘病毒②化学制剂：聚乙二醇（PEG）③细胞电融合技术：电脉冲（三）选择培养基的应用1.细胞融合是一个随机的物理过程。
融合后可能出现以下情况：①脾细胞与瘤细胞②瘤细胞与瘤细胞③脾细胞与脾细胞④未融合的瘤细胞⑤未融合的脾细胞⑥细胞多聚体形式2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基细胞的DNA合成一般有两条途径：(1)主要途径：糖和氨基酸→核苷酸→DNA(2) 替代途径：1) 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：①次黄嘌呤（hypoxanthine，H）②甲氨蝶呤（aminopoterin，A）③胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）2)三者取前缀缩写为HAT培养基3)原理：叶酸作为重要的辅酶参与DNA主要合成过程，氨基喋呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该主要合成途径。
简述单克隆抗体制备原理。
简述单克隆抗体制备原理。
单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。
单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。
2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。
3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。
4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。
随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。
5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。
单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。
随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。
临床医学检验技术(中级)-单克隆抗体及基因工程抗体的制备(精选试题)
临床医学检验技术（中级)-单克隆抗体及基因工程抗体的制备1、将鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，其大部分氨基酸序列为人源序列所取代A.人源化抗体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.抗体库技术2、特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可得到A.人源化抗体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.抗体库技术3、将抗体分子片段与其他蛋白融合得到的是A.人源化抗体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.抗体库技术4、分子量小，具有抗原结合功能的分子片段是A.人源化抗体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.抗体库技术5、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶是A.次黄嘌呤B.胸腺嘧啶核苷C.HGPRTD.甲氨蝶呤E.叶酸6、叶酸的拮抗剂是A.次黄嘌呤B.胸腺嘧啶核苷C.HGPRTD.甲氨蝶呤E.叶酸7、即有抗体分泌功能又有细胞永生性的是A.淋巴细胞B.小鼠脾细胞C.小鼠骨髓细胞D.小鼠骨髓瘤细胞E.杂交细胞8、可介导标记物与靶抗原结合或效应因子定位于靶细胞的是A.抗体融合蛋白B.双特异性抗体C.人源化抗体D.小分子抗体E.抗体库技术9、可将生物活性物质导向靶细胞特定部位的是A.抗体融合蛋白B.双特异性抗体C.人源化抗体D.小分子抗体E.抗体库技术10、降低异源性，有利于人体应用的是A.抗体融合蛋白B.双特异性抗体C.人源化抗体D.小分子抗体E.抗体库技术11、可在原核细胞中表达，在人体内穿透力强的是A.抗体融合蛋白B.双特异性抗体C.人源化抗体D.小分子抗体E.抗体库技术12、杂交瘤细胞的冻存均采用液氮保存的温度是A.-20℃B.-30℃C.-50℃D.-100℃E.-196℃13、聚乙二醇(PEG1000～2000)是目前最常用的细胞融合剂，使用浓度(W/V)一般为A.20%B.30%C.40%D.50%E.60%14、能在HAT培养基生长繁殖的细胞是A.小鼠脾细胞B.小鼠骨髓瘤细胞C.饲养细胞D.杂交瘤细胞E.免疫活性细胞15、以下有关单克隆抗体特点的叙述中不正确的是A.特异性强B.灵敏度高C.高度的均一性D.对pH、温度及盐类浓度耐受性强E.可重复性16、小鼠骨髓瘤细胞与以下哪种细胞融合，得到杂交瘤细胞，经培养可产生单克隆抗体A.经过免疫的B淋巴细胞B.经过免疫的T淋巴细胞C.未经过免疫的B淋巴细胞D.未经过免疫的T淋巴细胞E.以上均不对17、B细胞杂交瘤技术中细胞融合的选择培养基是A.HAT培养基B.次黄嘌呤培养基C.甲氨蝶呤培养基D.嘧啶核苷培养基E.胸腺嘧啶核苷培养基18、杂交瘤细胞保存最好在A.室温B.-4℃C.-20℃D.-70℃E.-196℃19、阳性杂交瘤细胞克隆化培养时，多少细胞数才能进行克隆化培养A.单个B.多个C.双个D.混合E.没有数目限制20、多发性骨髓瘤细胞是B淋巴细胞杂交瘤细胞的理想细胞，其原因不包括以下哪项A.稳定和易培养B.自身无分泌功能C.改变细胞恶性变化D.融合度高E.HGPRT缺陷21、用于制备单克隆抗体的骨髓瘤细胞不具有以下哪一特点A.稳定易培养B.自身可分泌免疫球蛋白C.融合率高D.HCPRT缺陷株E.是肿瘤细胞22、单克隆抗体的纯化一般不采用以下哪一种方法A.盐析法B.凝胶过滤法C.离子交换层析法D.辛酸提取法E.放射免疫法23、关于单克隆抗体特点的不正确叙述A.理化性状高度均一B.生物活性单一C.来源容易D.特异性强E.针对多种抗原决定簇24、保留抗原结合部位的最小功能片段是A.FabB.FvC.ScFvD.VHE.Fc25、将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起则得到是A.嵌合抗体B.小分子抗体C.双特异性抗体D.单克隆抗体E.多克隆抗体26、杂交瘤细胞含有A.两亲本细胞各一半染色体B.两亲本细胞全部染色体C.两个染色体D.融合特有基因信息E.亲代某些特性基因27、以下关于噬菌体抗体库的说法不正确的是A.模拟单一的特异性抗体B.可以不使用人工免疫技术和细胞融合技术C.可获得人源化的抗体D.获得的抗体具有高亲和力E.抗体VH和VL基因重组增加了抗体的多样性28、目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于A.病原微生物抗原抗体的检测B.肿瘤抗原的检测C.免疫细胞及其亚群的检测D.激素及细胞因子的测定E.以上都是29、去除杂抗体的吸附剂应选用A.不含特异性抗原的抗原液B.含特异性抗原的抗原液C.含杂抗原的溶液D.含杂抗体的溶液E.牛血清白蛋白30、关于单克隆抗体的描述，不正确的是A.生物活性专一性B.纯度高C.特异性高D.可同时识别多个表位E.可用于诊断和治疗。
单克隆抗体
1.历史：1.1免疫学起源于中国。
远在唐代开元年间（公元713~741年），中国古代医师便发明了用人痘苗预防天花。
1.2发展1.2.1第一代抗体——多克隆抗体制备技术1890年德国学者贝苓（Behring）和日本学者北里在Koch研究所首先从抗原被动免疫后获得的免疫血清中发现，即多克隆抗体。
1891年，贝苓用动物抗血清成功地治疗了一个白喉患者，这是世界上第一次用人工被动免疫方法治疗病人的事例。
为此，他在1901年获得了诺贝尔奖。
1.2.2第二代抗体——单克隆抗体制备技术50年代末，Burnet创立了“细胞系选择学说”。
该学说认为，每个B淋巴细胞有独特的受体，只能接受某种抗原决定簇的刺激。
这一理论的确立为随后建立的第二代抗体制备技术奠定了理论基础。
两大技术的基础：一是1958年Nossal和Littleflel创建的“细胞融合技术”，一是1962年Potter和Boyce 建立的“人工诱导浆细胞瘤技术”。
于是，1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体技术。
1.2.3第三代抗体——基因工程抗体制备技术：1973年DNA重组技术或称基因工程技术的建立，被认为是20世纪生物学的一项最伟大的成就，这一技术被很快渗透到生命科学的各个领域。
进入80年代，日本学者Tonegawa利用基因工程技术首先成功地克隆了免疫球蛋白的V区和C区基因，并证明了B淋巴细胞发育中的基因重排现象，为基因工程抗体的制备奠定了基础，因而于1987年获得了诺贝尔奖。
1984年，美国学者Morrison等制备和表达成功第一个基因工程抗体——人鼠嵌合抗体，开创了制备基因工程抗体的先河。
2.单克隆抗体2.1定义：是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。
2.2一般过程：通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
生物制药的前沿技术
生物制药的前沿技术生物制药是一门结合生物学和制药学的新兴领域，利用生物技术生产有药用价值的物质，如蛋白质、多肽、基因工程产品等。
随着科技的不断发展，生物制药领域也在不断创新与进步。
本文将介绍几种生物制药的前沿技术。
一、单克隆抗体技术单克隆抗体是由单一细胞系分泌的抗体，具有高度特异性和高效力，可用于治疗肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等。
近年来，在单克隆抗体技术方面取得了突破性进展。
通过将人类抗体基因导入小鼠或细菌的基因组中，成功制备出高亲和力和高效力的单克隆抗体。
此外，还发展了新一代的基于DNA合成的单克隆抗体技术，大大提高了单克隆抗体的制备速度和效率。
二、基因编辑技术基因编辑技术是指通过人为干预基因组，实现对基因的精确修改。
在生物制药领域，基因编辑技术被广泛应用于制药细胞的基因改造。
例如，利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对细胞中特定基因的删除、插入或替换，从而使细胞产生具有更好药物表达性能的特殊基因型。
三、细胞工程技术细胞工程技术主要是指利用细胞培养技术和基因工程技术，对细胞进行改造和利用。
通过优化细胞培养条件、调节细胞代谢路径和基因表达，可以获得高产量和高质量的药物。
此外，还可以通过细胞工程技术实现细胞的定向分化，从而获得具有特定功能的细胞，如干细胞、神经细胞等，用于组织工程和再生医学领域。
四、多肽药物合成技术多肽药物是指由若干氨基酸残基组成的生物活性分子，具有广泛的临床应用前景。
传统的多肽药物合成方法繁琐且产率低，难以大规模生产。
近年来，通过引入多肽合成机器人、固相合成技术等，成功提高了多肽药物的合成效率和纯度。
此外，还发展了多肽药物的非天然氨基酸合成技术，进一步扩展了多肽药物的结构和功能。
综上所述，生物制药的前沿技术正在不断推动制药领域的发展和创新。
单克隆抗体技术、基因编辑技术、细胞工程技术和多肽药物合成技术等技术的应用，为生物制药的研究和生产提供了更多的可能性。
随着这些前沿技术的不断突破和完善，相信生物制药领域将迎来更加广阔的发展前景。
单克隆抗体和基因工程抗体的制备 ppt课件
课件
11
(二) 杂交瘤细胞的选择性培养
杂交瘤细胞的筛选： 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后， 可融合 成不同类型的融合体， 正常的脾细胞在培养基中存活 仅5~7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易 死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出真正的杂交瘤细胞， 必须进行选择 性培养。目前，常用HAT培养基。 HAT培养基：
课件 13
细胞DNA生物合成途径示意图
糖+氨基酸
正常途径
氨基喋呤(A)
次黄嘌呤(H) HMP
HGPRT
核苷酸Βιβλιοθήκη 核苷酸前体DNA应急途径
TK
胸腺嘧啶(T) 课件
TMP
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用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择 出来的缺乏 HGPRT 的细胞株，所以在 HAT选择培养基中不能生长。只有杂交 瘤细胞具有亲代双方的遗传特性，即既 有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力 又有 B细胞经辅助途径合成 DNA 的能力， 故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。
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7
2．小鼠骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。
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用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞 应符合的条件
①本身不分泌免疫球蛋白； ②为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase ， HGPRT ） 或 胸 腺 嘧 啶 激 酶 （ thymidinekinase，TK）缺陷的细胞株； ③瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞； ④与B细胞融合率高。
课件
3
第一节 杂交瘤技术的基本原理
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子量1000D、1500D、4000DPEG作为细胞融合剂，浓 度在30%~50%之间。基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细 胞按1：2~1:10比例混合，加入PEG，诱导俩种细胞融 合，时间控制在2分钟以内，在加入培养液缓慢稀释 PEG融合液至失去融合作用，融合细胞形成具有2个 或多个核的异核体，最终产生杂交细胞
antibody, MAb)
单克隆抗体优点：
• 高度纯一 • 高度专一
• 效价高
• 无交叉反应
应用：
• 成本低能大
量制备
疾病的论断和治疗(生物导弹)
生物大分子的鉴定、定位和分离纯化
细胞器的鉴定、定位和分离
特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离
动物免疫 BALB/c
X抗原
B淋巴细胞 瘤的突变株
培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
细胞融合：
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
4. 杂交瘤细胞的选择性培养：源自 肿瘤细胞合成DNA通常有俩 条途径：一条为生物合成的主要 途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶 呤）阻断；另一条为替代途径， 叶酸代谢受阻时，细胞 通过 HGPRT和TK，利用核苷酸前体 物合成核苷酸，进而合成DNA 。HAT培养液含三种成分：次 黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶核 苷。
存活 死亡
HAT培养液筛选后，只有具 有俩个亲本的双重特性的杂交瘤 细胞能长期生存并产生抗体，成 为制造单克隆抗体的细胞源。
细胞类型 正常培养
基
正常培养 细胞
+
HAT培养 基
+
TK缺陷细 胞
+
-
HGPRT缺 陷细胞
+
-
杂交瘤细 胞
+
-
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
分泌X抗体 B淋巴细胞
培养数天后细胞死亡
骨髓瘤细胞 无限生长细胞
细胞融合 混合细胞的HAT筛选)
单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
只有杂交瘤细胞可长期存活下来 分泌 X抗体
规模化培养 获得大量单克隆抗体
杂交瘤技术操作流程图解
一、杂交瘤技术产生的4个技术关键
1. 免疫脾细胞特性：
生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体
外无限增殖的特点，因此可以不断地从细胞
培养上清液中获得单克隆抗体。单克隆抗体
的问世被誉为免疫学中的一次革命，它对生 物学、医学各领域产生了巨大的影响
单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb)
由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对
于 一 个 抗 原 决 定 簇 —— 单 克 隆 抗 体 (monoclonal
单克隆抗体及基因工程 抗体制备技术
案例
中国卫生部部长陈竺指出，虽然化学合成药物在今后很长一段时间内 任然是疾病治疗的主导产品，但是随着生命科学 技术的迅速发展，基 因工程药物和抗体药物等必定成为未来10年国际生物医药领域开发的热 点。
目前，除了人源化抗体 、单价小分子抗体 （Fab、 单链抗体、 单域 抗体、 超变区多肽等）、 多价小分子抗体（双链抗体 、三链抗体、 微 型抗体）、 某些特殊类型抗体（双特异抗体、 抗原化抗体、 细胞内抗 体 、 催化抗体、 免疫脂质)及抗体融合蛋白（免疫毒素、 免疫粘连素 ）等 新型基因工程抗体不断出现。
Q1：
什么是单克隆抗体？杂交瘤技术制备单 克隆抗体的基本原理是什么？
第一节
杂交瘤技术的基本原理
两个人和一中特殊抗体的故事
1975年Koehlert和Milstein利用杂交瘤技术， 使以绵羊红细胞（SRBC）免疫后小鼠的B淋 巴 合细 ，胞 建与立小了鼠能骨定髓向瘤产细生胞SR（BCSP单2/克0或隆N抗S-1体）的融杂 交细胞株，这一杂交细胞株具有B淋巴细胞产
H
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
T
外源性途径(旁路途径)
胸腺嘧啶激酶 ( TK )
(Thymidine kinase)
DNA
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
3. 细胞融合：
是指两个或两个以上细胞合并形成 一个细胞的现象。它可使两个不同来源 的细胞核在同细胞中表达功能，这样的 细胞称异核体。若异核体出现有分裂时 ，则可使两个不同来源的细胞核的染色 体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样 的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（ hybrid cell）。
细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分
免疫脾细胞： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异
性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB\c小鼠；
免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原 微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性 抗原不需要佐剂；可溶性抗原需加完全福氏佐剂。
2、骨髓瘤细胞 (myeloma cells):
根据有关数据显示，到目前为止，美国FDA已经批准了18个抗体治疗 药物，其中超过三分之二均为基因工程抗体。尤其最近几年发展起来的 用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术以及核糖体展示抗体库技术将抗 体工程的研究推向了一个新的高潮。这些技术更易于筛选高亲和力抗体 和采用体外进化的方法对抗体性质进行改造，代表了抗体的未来发展趋 势。