鲜乳及乳粉中L_羟脯氨酸的柱前衍生高效液相色谱测定法

0． 1 ml 0． 2 mol / L 异硫氰酸苯酯，混匀，室温反应 1 h，
加0． 4 ml正己烷，盖紧盖子后剧烈振摇 5 ～ 10 s，静置
分层，取下层溶液 0． 2 ml 加 0． 8 ml 水混合，经 0． 22
μm 针式过滤器过滤后，供 HPLC 测定。样品水解液同
法衍生后测定。
北京市宣武区疾病预防控制中心理化检验科，100053
摘要: 目的 建立柱前衍生反相高效液相色谱测定鲜乳及乳粉中 L-羟脯氨酸方法。方法 样品经酸水解，采用异硫氰酸
苯酯( PITC) 与水解液中的 L-羟脯氨酸衍生，以 C
18
柱分离，紫外检测器254 nm 波长下检测。结果 在2 ～10 mg/L 范围内，
的非法添加物，通过检测乳或乳制品中羟脯氨酸的含
量可推断是否添加了动物水解蛋白。目前，我国尚未
发布乳制品中 L-羟脯氨酸的检测方法，对乳及乳制品
中 L-羟脯氨酸进行测定的研究报道主要有分光光度
法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪法等
［1-4］
。在柱前
衍生 － 反相色谱法分离中，2，4-二硝基氟苯( DNFB) 及
关键词: 柱前衍生; 高效液相色谱法; L-羟脯氨酸; 鲜乳; 乳粉
中国图书资料分类号: R115 文献标识码: B 文章编号:1004 －1257( 2012) 16 －1991 －03
Determination of L-hydroxyproline in milk and milk powder by pre-column derivatization HPLC
系良好，回归方程为 Y = 14 943 C + 2 473，相关系数
r =0． 999 7。本方法下，以 3 倍信噪比S / N =3，计算出检出
限为0．07 mg/L。根据取样量计算方法检出限分别为液
体乳2．0 mg/kg，乳粉14 mg/kg。
2． 3 方法的精密度 分别配制高 ( 9． 0 mg / L) 、中
·实验·监测与检验·
鲜乳及乳粉中 L-羟脯氨酸的柱前衍生
高效液相色谱测定法
Determination of L-hydroxyproline in milk and milk powder by pre-column derivatization HPLC
王玮，张乔娜
WANG Wei，ZHANG Qiao-na
管; 2 ml 样品瓶; 1． 5 ml 塑料离心管; 0． 22 μm 针式过
滤器( 有机系) 。
1． 4 方法
1． 4． 1 标准溶液配制 准确称取 0． 100 0 g L-羟脯氨
酸，用 0． 1 mol/L 盐酸溶液溶解定容至 100 ml，制成浓
度为 1 000 mg/L 的储备液。将储备液用 0． 1 mol/L 盐
ar relationship between the peak and the concentration of the L-hydroxyproline in the range of 2-10 mg / L，The recoveries were
95. 0-100． 3% ，and the RSD was 0． 4% -4． 0% ． the detection limit of milk was 2． 0 mg / kg，the detection limit of milk powder was
L-羟脯氨酸质量浓度与峰面积具有良好的线性关系，样品加标平均回收率为 95． 0% ～ 100． 3% ，方法精密度为
0． 4% ～ 4． 0% 。鲜乳的检出限为 2． 0 mg / kg，乳粉的检出限为 14 mg / kg。结论 该方法易于操作、稳定、准确，适用于鲜乳及
乳粉中 L-羟脯氨酸检测。
1 材料与方法
1． 1 仪器 美国 Waters 2695 高效液相色谱仪，二极
管阵列检测器，分析天平( 感量 0． 1 mg) ，电热干燥箱，
电热恒温水浴箱。
1． 2 试剂 L-羟脯氨酸 ( 美国 Sigma 公司，纯度 ≥
99． 0% ) ; 甲醇、乙腈为 HPLC 级; 苯酚( 重蒸) ; 1 mol / L
RSD 为 4． 0% ; 高浓度组平均回收率为 95． 0% ( n = 6) ，
RSD 为 3． 8% 。结果见表 1、图 2、图 3。
表 1 方法回收率
加标量
( mg/L)
回收率( %)
1 2 3 4 5 6
平均回
收率( %)
RSD
( %)
2． 0 104． 6 101． 5 99． 8 101． 7 98． 6 95． 8 100． 3 3． 0
三乙胺; 0． 1 mol/L 盐酸; 0． 2 mol/L 异硫氰酸苯酯;
0． 05 mol / L乙酸钠; 实验用水为 18． 2 MΩ。
职业与健康 2012 年8 月第28 卷第16 期 Occup and Health，Aug． 2012，Vol．28，No．16·1991·1． 3 材料 30 ml 蛋白水解管; 20 ml 玻璃具塞刻度试
WANG Wei，ZHANG Qiao-na
Physical and Chemical Test Department，Xuanwu District Center for Disease Control and Prevention，Beijing，100053，China
Abstract: ［Objective］To establish a method to determine L-hydroxyproline in milk and milk powder by pre-column derivatization
( 或鲜乳 0． 680 0 g) 于蛋白水解管中，加 10 ml 含有
0． 1% 苯酚的 6 mol / L 盐酸溶液，旋紧盖子，振荡混匀，
110 ℃ 下反应 24 h。反应完毕，趁热将水解产物用滤
纸过滤至蒸发皿中，用 10 ml 0． 1 mol/L 盐酸溶液分 3
次洗涤水解管及滤纸，合并滤液至蒸发皿中，在 75 ℃
( 8． 0 mg/L) 、中( 5． 0 mg/L) 和低( 2． 0 mg/L) 3 个浓度
的标准溶液，按 1． 4． 2 及 1． 4． 3 所述方法进行处理，上
机测定。低浓度组平均回收率为 100． 3% ( n = 6) ，
RSD 为 3． 0% ; 中浓度组平均回收率为 96． 8% ( n = 6) ，
异硫氰酸苯酯( PITC) 均可与一级胺、二级胺反应，是
理想的柱前衍生剂，但 2，4-二硝基氯苯为剧毒品，不便
使用。我们采用异硫氰酸苯酯与样品水解液中 L-羟脯
氨酸进行柱前衍生，经 C
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柱分离，反向液相色谱定量
测定。该方法易于操作、准确，适用于乳与乳制品中动
物水解蛋白 L-羟脯氨酸的鉴定。
1． 4． 4 色谱条件 色谱柱: SunFire
TM
C
18
，250 mm ×
4． 6 mm( 5 μm) ; 流动相 A: 乙酸钠 0． 05 mol / L ( pH
6． 5) ; B: 乙腈( 60) ∶ 甲醇( 20) ∶ 水( 20) 。采用梯度洗
脱程序，流动相 B 洗脱程序为 0 ～ 15 min，7% ～ 45%;
例升至 7%比较合适，以后逐渐增加流动相 B 的比例，
得到较好的分离效果。见图 1。
图 1 L-羟脯氨酸标准溶液色谱图
2． 2 方法的线性范围检出限 以 L-羟脯氨酸浓度 C
( mg/L) 为横坐标，以峰面积均值 Y 为纵坐标，绘制标准曲
线。结果表明，L-羟脯氨酸在2 ～10 mg/L 范围内，线性关
以下水浴中至近干，用约 12 ml 0． 1 mol/L 盐酸溶液分
3 次溶解残渣，并转移到 20 ml 具塞玻璃试管中，再用
纯水定容至 20 ml，待衍生。
1． 4． 3 衍生 取各浓度标准溶液 0． 2 ml，分别置于
1． 5 ml塑料离心管中，加入 0． 1 ml 1 mol / L 三乙胺和
2 结 果
2． 1 梯度洗脱条件的确定 以乙腈( 60) : 甲醇( 20) :
水( 20) 为流动相 B，乙酸钠 0． 05 mol/L( pH 6． 5) 为
流动相 A，采用梯度洗脱程序，比较流动相配比对分离
效果的影响。试验结果表明，当初始流动相 B 为 5%
时，峰型对称性差，出峰时间长。将初始流动相 B 的比
酸溶液稀释至浓度为 100 mg/L 标准使用液。分别取
0、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8 和 1． 0 ml L-羟脯氨酸使用液于 10
ml 容量瓶中，用 0． 1 mol / L 盐酸溶液定容至刻度，浓度
分别为 0、2、4、6、8 和 10 mg/L。
1． 4． 2 样品处理 称取混匀后乳粉样品 0． 100 0 g
14 mg / kg．［Conclusion］The method is simple，steady and accurate，and it is suitable for determination of L-hydroxyproline in the
milk and milk powder．
5． 0 90． 6 97． 0 97． 9 95． 1 97． 6 102． 4 96． 8 4． 0
8． 0 93． 8 99． 8 93． 3 99． 2 91． 3 92． 5 95． 0 3． 8