实时荧光定量PCR介绍
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△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续
△ 3’ 末端避免GC rich或AT rich △ 3’ 末端碱基最好为G 或C △ 3’ 末端碱基尽量避免为T
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证
siRNA效果确认 mRNA表达量分析
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 4
Real Time PCR的原理
Real Time PCR
使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。
发
射激
光发 光
Ct值
实时荧光定量PCR介绍
One-SPtreop bReT-法PCR 特异性高
价格便宜
多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
4/8/2020 • 12
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 3
Real Time PCR的用途
Real Time PCR用途
定性分析
病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型
定量分析
绝对定量
病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测
4/8/2020 • 8
SYBR Green I 法作用机理示意图
热变性
Primer
F
F
F
F F
退火
Primer
Pol. F
F
F
F
F
延伸
Primer Pol.
F
实时荧光定量PCR介绍
F
F
F
F
4/8/2020 • 9
TaqMan法作用机理
TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’ 端标记一个报告基团（Reporter）， 3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。
=> 对引物设计要求严格
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 16
Real Time PCR引物设计原则
扩增片段大小 Primer长度 GC含量 Tm值
序列
3’ 末端序列
互补性 特异性
RT-PCR用引物
★ ★ ★ ★★★
★
★
★★★ ★★★ ★★★
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) 17-25 base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
出。
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 15
Real Time PCR引物设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
实时荧光定量 PCR介绍
宝生物工程（大连）有限公司
April 8, 2020
主要内容
1 Real Time PCR基础知识 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 2
Real Time PCR基础知识
4/8/2020 • 5
Real Time PCR基础知识
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 6
Real Time PCR的检测方法
SYBR Green I
荧光染料嵌合法 荧光探针法
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 14
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 13
RT Primer的选择
Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 17
Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值
序列
5’ 末端序列 互补性
特异性
★★ ★★★
TaqMan Probe
实时荧光定量PCR介绍
Cycling Probe
Molecular
Beacon
etc.
4/8/2020 • 7
荧光染料嵌合法（SYBR Green I）
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
实时荧光定量PCR介绍
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
5’
目的片段
AAA··· 3’ 1.5 kbp 以内适用，RT效率
F
R
较高。
Gene Specific Primer
One Step RT-PCR 只能使
5’
目的片段
F
R
3’ 用Gene Specific Primer， 但不适用于复数基因的检
★
★ ★★★ ★★★
20-24 bp
R
Q
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 10
TaqMan Probe法原理示意图
热变性
Primer
R
Q
退火
Primer
Pol.
R
Q
延伸
PLeabharlann Baiduimer Pol.
实时荧光定量PCR介绍
R
Q
4/8/2020 • 11
SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行
△ 3’ 末端避免GC rich或AT rich △ 3’ 末端碱基最好为G 或C △ 3’ 末端碱基尽量避免为T
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证
siRNA效果确认 mRNA表达量分析
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4/8/2020 • 4
Real Time PCR的原理
Real Time PCR
使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。
发
射激
光发 光
Ct值
实时荧光定量PCR介绍
One-SPtreop bReT-法PCR 特异性高
价格便宜
多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
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常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
4/8/2020 • 12
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
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4/8/2020 • 3
Real Time PCR的用途
Real Time PCR用途
定性分析
病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型
定量分析
绝对定量
病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测
4/8/2020 • 8
SYBR Green I 法作用机理示意图
热变性
Primer
F
F
F
F F
退火
Primer
Pol. F
F
F
F
F
延伸
Primer Pol.
F
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F
F
F
F
4/8/2020 • 9
TaqMan法作用机理
TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’ 端标记一个报告基团（Reporter）， 3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。
=> 对引物设计要求严格
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Real Time PCR引物设计原则
扩增片段大小 Primer长度 GC含量 Tm值
序列
3’ 末端序列
互补性 特异性
RT-PCR用引物
★ ★ ★ ★★★
★
★
★★★ ★★★ ★★★
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) 17-25 base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
出。
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Real Time PCR引物设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
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April 8, 2020
主要内容
1 Real Time PCR基础知识 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例
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4/8/2020 • 2
Real Time PCR基础知识
4/8/2020 • 5
Real Time PCR基础知识
1 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 6
Real Time PCR的检测方法
SYBR Green I
荧光染料嵌合法 荧光探针法
PCR F-Primer PCR R-Primer
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4/8/2020 • 14
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 13
RT Primer的选择
Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 17
Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值
序列
5’ 末端序列 互补性
特异性
★★ ★★★
TaqMan Probe
实时荧光定量PCR介绍
Cycling Probe
Molecular
Beacon
etc.
4/8/2020 • 7
荧光染料嵌合法（SYBR Green I）
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
实时荧光定量PCR介绍
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
5’
目的片段
AAA··· 3’ 1.5 kbp 以内适用，RT效率
F
R
较高。
Gene Specific Primer
One Step RT-PCR 只能使
5’
目的片段
F
R
3’ 用Gene Specific Primer， 但不适用于复数基因的检
★
★ ★★★ ★★★
20-24 bp
R
Q
实时荧光定量PCR介绍
4/8/2020 • 10
TaqMan Probe法原理示意图
热变性
Primer
R
Q
退火
Primer
Pol.
R
Q
延伸
PLeabharlann Baiduimer Pol.
实时荧光定量PCR介绍
R
Q
4/8/2020 • 11
SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行