实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
RT-qPCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
非特异性产物
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化:
1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测
2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
• • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
起始模板的测定
基因型的分析
应用范围
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
QPCR原理及应用
实时荧光定量PCR的原理和应用，1971年qq阵列实时荧光定量PCR（PCR）的原理，Khorana提出可以在DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA引物延伸后克隆tRNA基因。
聚合酶，并重复此过程。
1985年，Mullis等人。
PE Cetus公司在美国发明了聚合酶链反应（PCR）。
PCR的基本原理是在体外模拟DNA在细胞中的复制，最初使用的是大肠杆菌。
由于该酶不耐热，因此该过程耗时，费力且容易出错。
耐热DNA聚合酶的应用使PCR效率更高。
随后，PE Cetus公司于1989年推出了第一台自动PCR热循环仪，即聚合酶链反应（PCR），被美国科学杂志评为十多项重大科学发明中的第一部，1989年是PCR 爆发的一年。
Mullis于1993年获得了诺贝尔化学奖。
Pcratcggatagcgatcgacctagc5'3'tagcgtatcgatcgacgctggatcg3'5'DNA展开链结合引物亚链延长pcratgcgatgcgtagctgacctagc5'3'tagcgtccgcccctggatcg3g3'5链延伸ggaucg5'aucgcg5'taggctatcgcacgct3'atacggtagctgacctagc3'DNA聚合酶522557294时间（min）温度（℃）合适的温度延伸3高温变性1低温退火2重复1〜3步25〜30轮靶DNA片段扩增超过1百万次DNA双螺旋DNA单链和引物复性DNA变性形式2单链延伸DNA双模板DNA第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增第四轮扩增第五轮扩增PCR中的实时定量PCR通过荧光si实时性别积累。
最后，用标准曲线对未知模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR：对PCR扩增反应终产物进行定量和定性分析。
不可能准确地定量初始模板并实时检测扩增反应。
实时荧光定量PCR：利用实时荧光定量PCR 检测荧光信号在PCR扩增反应各循环中产量的变化，并通过CT值和标准曲线。
rtqpcr原理
rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它基于PCR技术，通过测量PCR反应过程中的荧光信号来实时监测DNA或RNA的扩增过程，从而能够准确、快速地定量分析样品中目标基因的表达水平或拷贝数。
本文将详细介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。
RT-qPCR的原理主要包括RNA反转录、PCR扩增和荧光信号检测三个步骤。
首先，RNA反转录将RNA转录为cDNA，即反转录过程。
然后，PCR扩增通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使得目标DNA序列在体系中不断复制，从而形成指数级增长。
最后，荧光信号检测通过荧光染料实时监测PCR过程中的DNA合成量，从而得到实时的扩增曲线。
这三个步骤共同构成了RT-qPCR的原理。
RT-qPCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在科研领域，RT-qPCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
在基因表达分析中，科研人员可以通过RT-qPCR技术准确地测定目标基因在不同组织或不同处理条件下的表达水平，从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
在病原微生物检测中，RT-qPCR可以快速、灵敏地检测样品中的微生物DNA或RNA，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
在临床领域，RT-qPCR常被用于病毒载量检测、癌症早期诊断、药物代谢鉴定等方面。
例如，临床医生可以利用RT-qPCR技术监测病毒患者血液中病毒载量的动态变化，指导临床治疗方案的调整。
总之，RT-qPCR作为一种准确、快速、灵敏的分子生物学技术，已经成为科研和临床实验室中不可或缺的工具。
它的原理简单清晰，应用广泛多样，为生命科学领域的研究和临床诊断带来了许多便利和突破。
相信随着技术的不断进步和完善，RT-qPCR在未来会有更加广阔的发展前景。
实时荧光定量PCR的应用和进展
实时荧光定量PCR的应用和进展实时荧光定量PCR是一种先进的生物技术，广泛应用于各个研究领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR的应用领域、技术原理、实验流程以及应用前景。
实时荧光定量PCR在许多领域都有广泛的应用，如基因表达研究、病毒检测、基因突变分析、基因克隆和定量分析等。
基因表达研究：实时荧光定量PCR可以用于检测特定基因在不同组织或处理条件下的表达情况，有助于了解基因的功能和调控机制。
病毒检测：实时荧光定量PCR是一种非常灵敏的病毒检测方法，可快速、准确地检测出病毒的复制和含量，对于疫情防控和治疗具有重要意义。
基因突变分析：实时荧光定量PCR结合特异性探针技术，可以用于检测基因突变，对于遗传学研究和疾病诊断具有重要价值。
基因克隆和定量分析：实时荧光定量PCR可以用于基因克隆和定量分析，帮助研究人员了解基因的序列和功能，为基因治疗和药物研发提供支持。
实时荧光定量PCR的技术原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号进行检测和分析。
在PCR扩增过程中，特异性荧光探针与目标DNA序列结合，探针上的荧光基团在特定光源的照射下发出荧光，通过检测荧光信号的强度可以确定目标DNA的含量。
同时，通过对起始模板的定量，可以计算出目标DNA的起始拷贝数。
由于荧光信号的特异性，该技术具有高灵敏度、高准确性和高特异性。
实时荧光定量PCR的实验流程包括以下几个步骤：设计特异性引物和荧光探针：根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针，以确保引物和探针能够与目标DNA准确结合。
样品处理：将待测样品进行处理，提取出其中的DNA。
配置PCR反应液：将PCR反应液进行配置，包括dNTPs、Taq酶、特异性引物、荧光探针和DNA模板等。
PCR扩增：在PCR仪中进行扩增，记录每个循环中的荧光信号强度。
数据分析和解释：通过对荧光信号强度的分析和解释，可以得到目标DNA的起始拷贝数和相对表达量。
在设计引物和探针时，要确保其与目标DNA序列的特异性结合，避免非特异性结合造成的误差。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR一、两个概念RT-PCR:国际上约定俗成的是指Reverse transcription PCR（反转录PCR）。
反转录PCR不一定非要与荧光定量相关，从mRNA中反转录得到cDNA，然后PCR扩增出目的基因，这也是反转录PCR。
qPCR：Real-time PCR一般简写为qPCR（quantitative real-time PCR），qPCR除了可以用cDNA 作为模板，也可以用基因组DNA等作为模板。
综上，那RT-qPCR（也有人写成qRT-PCR）就很好理解了，就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从RNA反转录得到cDNA（RT），然后用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。
二、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. 荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。
接近一条直线，这样的直线即是基线。
荧光域值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold = 10*SD cycle 6-15，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1）。
研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。
反之亦然。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。
纵坐标代表CT值。
因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图1. Ct值的确定扩增曲线：PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：①曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
rt—qpcr实验原理及步骤
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。
其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。
1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。
逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。
2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。
在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。
3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。
这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。
样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。
逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。
3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。
PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。
4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。
实时荧光定量PCR的方法学建立
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。
一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。
2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。
于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。
用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。
3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。
于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。
4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。
5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR的原理。
荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA分子的技术，它结合了PCR扩增和荧光信号检测的方法，可以实现对目标分子数量的准确测量。
在本文中，我们将详细介绍荧光定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
首先，让我们来了解一下PCR的基本原理。
PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，它通过反复进行三步循环，即变性、退火和延伸，使目标DNA片段在体外得以扩增。
在PCR的过程中，引物（primers）与目标DNA序列特异性结合，DNA聚合酶（DNA polymerase）在引物的引导下合成新的DNA链，最终形成两倍于原始DNA的目标序列。
荧光定量PCR在PCR基础上增加了荧光信号的检测，通过监测荧光信号的强度来实现对PCR产物的定量分析。
在荧光定量PCR中，通常会使用DNA结合染料或探针来标记PCR产物，当PCR进行到一定程度时，荧光信号的强度与起始模板DNA的数量成正比。
通过测量荧光信号的强度，可以准确地定量PCR产物的数量，从而实现对起始模板DNA的定量分析。
在荧光定量PCR中，常用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。
SYBR Green是一种DNA结合染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号，因此可以用来实现对PCR产物的定量分析。
而TaqMan探针则是一种特殊的探针，它包含一个荧光素和一个荧光猝灭剂，当TaqMan探针与PCR产物结合时，荧光信号会被释放出来，从而实现对PCR产物的定量分析。
荧光定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用，例如在基因表达分析、病原体检测、遗传疾病诊断等领域都有着重要的作用。
通过荧光定量PCR，我们可以快速、准确地检测和定量目标DNA或RNA分子，为科研和临床诊断提供了有力的工具。
总之，荧光定量PCR是一种重要的分子生物学技术，它结合了PCR扩增和荧光信号检测的方法，可以实现对DNA或RNA分子的定量分析。
rtqpcr原理
rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术，它结合了传统PCR技术和实时荧光技术，能够快速、准确地测量目标DNA或RNA的数量。
本文将介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。
RT-qPCR的原理主要包括RNA的逆转录、PCR扩增和实时荧光检测三个步骤。
首先，RNA经过逆转录酶的作用被逆转录成cDNA，然后通过PCR扩增使得目标序列数量呈指数增长，最后通过特定荧光探针实时监测PCR反应过程中目标序列的数量变化。
实时荧光信号与PCR产物的数量成正比，通过标准曲线可以定量计算出初始RNA模板的数量。
RT-qPCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，可以在短时间内对少量RNA进行快速准确的定量分析。
它在基因表达分析、病毒载量检测、微生物定量和体液标志物检测等领域有着广泛的应用。
在基因表达分析中，RT-qPCR可以快速准确地检测特定基因的表达水平，帮助科研人员了解基因调控网络和信号转导通路。
在病毒载量检测中，RT-qPCR可以对病毒RNA进行快速准确的定量，为临床诊断和治疗提供重要依据。
在微生物定量方面，RT-qPCR可以对微生物数量进行快速准确的检测，有助于环境监测和食品安全检测。
在体液标志物检测中，RT-qPCR可以对血清或尿液中的特定RNA进行定量分析，为疾病诊断和预后评估提供重要信息。
总之，RT-qPCR作为一种快速、准确的定量分析技术，在科研和临床中有着广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，相信RT-qPCR技术将在生物医学领域发挥越来越重要的作用，为人类健康和生命科学研究做出更大的贡献。
实时荧光定量PCR技术
模板含有抑制物；···
火/延伸时间；提高引物浓
度；添加K+；改用三步法扩
增；添加增强剂；换酶；重
新设计引物；···
特异性差 探针，引物设计不合理，二级 提高退火/延伸温度；适当降
结构过多；探针，引物浓度 低探针，引物浓度；调整
过高；退火/延伸温度偏低； Mg2+的量；重新设计探针，
···
引物；换酶···
体系稳定性差 原料储存不当；体系配制时间 探针应避光；体系在冰上配制
过长；模板浓度低；模板不 ；使用合格的试剂盒制备模
纯，降解；
板，避免反复冻融；
···
谢谢
–反应体系监控：蒸发、操作
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称
作用
10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等）
引物mix 探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul）
缓冲液-提供反应环境
PCR反应的出发点 发出信号，指示扩增 聚合酶-催化合成反应
• 二，Ct值为扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数，即Ct值与荧光 阈值有关。
实时荧光定量PCR技术的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 此外，还其它非荧光类淬灭基团如BHQ1，BHQ2等。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用RealtimeQuantitativePCR
实时荧光定量PCR原理 绝对定量
确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
Sample
25
讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
Color 2 - VIC detection for GAPDH
No Image
TaqMan法举例 实验结果 单双通道相互验证
A.Multiplex Reactions
Healthy RNA 28.48 28.68 28.78 28.65± 0.15
B.Singleplex reactions
讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用
实时荧光定量PCR法
标准样品
绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA
相对定量中的内标 • 内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因
• 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小
SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
SYBR Green 法
优点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
使用方便 -----不必设计复杂探针
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数
RTqPCR实时荧光定量PCR
延伸过程中发出荧光）
• 特异性荧光标记：
• 1、TaqMan 水解型杂交探针。5′端标记有报告
基团R，3′端标记有荧光淬灭基团 Q。探针完整
，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针R
与Q分开，发出荧光。
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
易检测
2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
3. MgCl2（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产
物
4. 反应Buffer体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
优 点
对DNA模板没有选择性
----适用于任何DNA
Q
R
Q
1
RT-qPCR 原理----定量原理
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）
纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的
收集
荧光信号阈值 （threshold ）：
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴
性对照的荧光值。荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏
差的10倍。
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经
过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。
Logo
1
RT-qPCR 原理----定量原理
1.绝对定量
理想的PCR反应：
X=X0*2n
非理想的PCR反应：
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以在实验室中快速准确测量DNA的技术，它使用荧光来检测和计算特定DNA序列的定量，在生物学和医学研究中极其重要。
本文旨在深入讨论荧光定量PCR的原理，以及它是如何在分子生物学研究中发挥作用。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（qPCR）是一种检测DNA的技术，它使用荧光探针和背景抑制剂来检测DNA片段的存在。
qPCR使用DNA复制的反应来放大特定的DNA序列，并使用荧光探针来检测这些序列。
荧光定量PCR的过程包括三个主要阶段：反应制备、反应启动和反应完成。
在反应制备阶段，实验室工作人员将模板DNA、反转录酶（RT）、DNA聚合酶（Taq）、荧光探针和背景抑制剂放入PCR反应管中。
在反应启动阶段，Taq DNA聚合酶将反应温度升至95摄氏度以上，以启动DNA复制。
在复制过程中，荧光探针捕获复制产物，并发出荧光信号，使其可以被检测到。
在反应完成阶段，实验室工作人员将反应温度降至60摄氏度以上，以终止DNA复制。
在这个阶段，实验室工作人员可以使用特定设备（如实时PCR仪或qPCR仪）测量DNA复制产物的定量，以确定模板DNA的定量。
二、荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在分子生物学研究中发挥着重要作用，它可以用来精确测量模板DNA的定量，以及从细胞或组织样本中快速鉴定出特定的基因。
它还可以用来研究不同细胞和组织中特定基因的表达水平，以及研究基因突变、转录因子的活性等问题。
荧光定量PCR在病毒感染的检测中也发挥着重要作用，它可以快速确定病毒的存在，以及病毒在体内的活跃度。
例如，可以使用qPCR快速检测COVID-19病毒，从而帮助诊断和控制疾病的传播。
此外，荧光定量PCR还可以用于在肿瘤组织中鉴定具有致癌潜能的基因突变，并帮助确定患者是否需要接受放疗或化疗治疗。
qPCR技术也可以用于检测细菌和真菌感染，以及检测抗药性菌株，帮助确定最佳治疗方案。
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在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
RT-PCห้องสมุดไป่ตู้技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。 • 动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸 膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。 • 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业 阪崎肠杆菌等检测。 • 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 • 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫 局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
电泳 PCR
普 通
PCR
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
RT-PCR技术的数据分析
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定