基因芯片技术研究柽柳NaHCO3胁迫下基因的表达

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用基因芯片技术分析铝胁迫下小麦的基因表达谱

用基因芯片技术分析铝胁迫下小麦的基因表达谱

2 'P a t r i c i a A y o u b i ’
1 .C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s ,G u a n g z h o u Un i v e r s i t y ,Gu a n g z h o u 5 1 0 0 0 6 ,Ch i n a ; 2 .US DA— AR S ,P l a n t S c i e n c e a n d E n t o mo l o g y Re s e a r c h U n i t ,K . a n s a s S l a  ̄ e Un i v e r s i t y ,Ma n h a t t a n ,K a n s a s ,US A; 3 .De p a t r me n t o f B i o c h e mi s t r y a n d Mo l e c u l a r B i o l 。 g y ,Ok l a h o ma S t a t e Un i v e si r t y ,S t i l l w a t e r ,Ok l a h o ma ,US A
[ Ab s t r a c t ]O b j e c t i v e :A l u m i n u m( A l i } i s o n e f o t h e m o s t a b u n d a t n m e t a l s i n he t e a t r h a n d a ma j o r l i m i t i n g f a e [ ( r t o la p n t
文章 编 号 : 1 0 0 9 - 0 0 0 2 ( 2 0 0 7 ) 0 4 - 0 5 8 1 一 - 0 6
研 究报 告

小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析

小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析

㊀山东农业科学㊀2023ꎬ55(8):11~20ShandongAgriculturalSciences㊀DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2023.08.002收稿日期:2022-11-08基金项目:北京市农业科技项目(20170126)ꎻ北京市服务新型生产经营主体科技能力提升项目(20170203)作者简介:杨林林(1980 )ꎬ女ꎬ河南焦作人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事小麦水资源高效利用研究ꎮE-mail:bjyangll@163.com通信作者:杨胜敏(1965 )ꎬ女ꎬ河北石家庄人ꎬ硕士ꎬ教授ꎬ主要从事作物节水理论与技术研究ꎮE-mail:Ysmin227@126.com小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析杨林林1ꎬ韩敏琦1ꎬ高嘉2ꎬ杨胜敏1(1.北京农业职业学院ꎬ北京㊀102442ꎻ2.北京清河水利建设集团有限公司ꎬ北京㊀100192)㊀㊀摘要:超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化系统的关键酶ꎬ在保护植物免受各种生物和非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用ꎮ然而关于小麦(TriticumaestivumL.)SOD基因家族对盐胁迫的表达模式及响应锌(Zn)和钾(K)的功能知之甚少ꎮ本研究以 西农979 为试验材料ꎬ基于全基因组分析ꎬ对小麦SOD家族成员进行鉴定和生物信息学分析ꎬ并分析相关基因在盐胁迫下响应Zn㊁K的表达情况ꎮ结果表明ꎬ在小麦中共鉴定出10个SOD基因(TaSDs)ꎬ包括4个Cu/Zn-SOD基因(TaCSD1~TaCSD4)㊁4个Fe-SOD基因(TaFSD1~TaFSD4)和2个Mn-SOD基因(TaMSD1㊁TaMSD2)ꎮ系统发育分析表明ꎬTaSDs可分为Cu/Zn-SODs㊁Fe/Mn-SODs两大类ꎬ共7个亚组ꎮ基因结构㊁序列基序及启动子分析表明ꎬ所有TaSDs都具有1~7个内含子和2~7个外显子ꎬ不同TaSDs具有不同的氨基酸序列组成和高度保守的活性位点残基ꎬ且每个TaSDs的启动子中存在许多与应激反应和植物激素相关的顺式作用元件ꎮ转录组表达谱分析表明ꎬ不同TaSDs对盐分表现出不同的表达模式ꎬTaCSD3可能是响应盐胁迫的关键基因ꎻ经RT-qPCR分析明确ꎬTaCSD3是响应盐胁迫的靶向SOD基因ꎬ同时受Zn㊁K协同正向调控ꎮ本研究结果可为后续小麦耐盐育种改良提供理论依据ꎮ关键词:小麦ꎻ超氧化物歧化酶ꎻ基因组ꎻ盐胁迫ꎻ锌-钾相互作用中图分类号:Q781㊀㊀文献标识号:A㊀㊀文章编号:1001-4942(2023)08-0011-10IdentificationofWheatSuperoxideDismutaseFamilyGenesandTheirExpressionAnalysisinResponsetoZincandPotassiumunderSaltStressYangLinlin1ꎬHanMinqi1ꎬGaoJia2ꎬYangShengmin1(1.BeijingVocationalCollegeofAgricultureꎬBeijing102442ꎬChinaꎻ2.BeijingQingheWaterConservancyConstructionGroupCo.ꎬLtd.ꎬBeijing100192ꎬChina)Abstract㊀Superoxidedismutase(SOD)isakeyenzymeintheantioxidantsystemthatplaysavitalroleinprotectingplantsfromvariousbioticandabioticstresses.Howeverꎬlittleisknownabouttheexpressionpat ̄ternofSODgenefamilyinwheat(TriticumaestivumL.)undersaltstressanditsfunctioninresponsetozinc(Zn)andpotassium(K).InthisstudyꎬwithXinong979asexperimentalmaterialꎬthemembersofwheatSODfamilywereidentifiedꎬandtheirbioinformaticsanalysiswascarriedoutbasedonthewholegenomeanal ̄ysis.TheexpressionofrelatedgenesinresponsetoZnandKundersaltstresswereanalyzedꎬtoo.Theresultsshowedthatatotalof10SODgenes(TaSDs)wereidentifiedinwheatꎬincluding4Cu/Zn ̄SODgenes(TaCSD1 ̄TaCSD4)ꎬ4Fe ̄SODgenes(TaFSD1 ̄TaFSD4)and2Mn ̄SODgenes(TaMSD1andTaMSD2).PhylogeneticanalysisshowedthatTaSDscouldbedividedintoCu/Zn ̄SODsandFe/Mn ̄SODswith7sub ̄groups.TheanalysesofgenestructureꎬsequencemotifsandpromotersshowedthatallTaSDshad1to7in ̄tronsand2to7exonsꎬanddifferentTaSDshaddifferentaminoacidsequencecompositionandhighlycon ̄servedactivesiteresiduesꎻthereweremanycis ̄actingelementsrelatedtostressresponseandplanthormonesinthepromoterofeachTaSD.TranscriptomeanalysisprofileanalysisshowedthatdifferentTaSDsshoweddif ̄ferentexpressionpatternstosaltstressꎬandTaCSD3mightbeakeygeneinresponsetosaltstress.AccordingtoRT ̄qPCRanalysisꎬTaCSD3wasatargetedSODgeneinresponsetosaltstressandwaspositivelyregulatedbyZnandKsynergistically.Theresultsofthisstudycouldprovideatheoreticalbasisforthesubsequentim ̄provementofwheatsalttolerancebreeding.Keywords㊀WheatꎻSuperoxidedismutaseꎻGenomeꎻSaltstressꎻZinc ̄potassiuminteraction㊀㊀活性氧(ROS)是细胞代谢产生的羟基自由基( OH)㊁超氧阴离子自由基(O2 -)和过氧化氢(H2O2)等一系列副产物[1]ꎮROS是生物体所必需的信号分子ꎬ影响着细胞分化㊁凋亡及胞间物质传导ꎮ正常条件下ꎬ细胞内ROS的产生和清除处于动态平衡状态ꎻ然而ꎬ植物生长过程中经常会受到极端温度㊁水分㊁盐分㊁重金属离子等各种胁迫ꎬ这往往会导致ROS过量累积[2]ꎮROS的过量积累会诱导氧化应激ꎬ破坏膜脂㊁蛋白质㊁核糖核酸和光合色素ꎬ严重时甚至导致细胞死亡[3]ꎮ为了消除ROS毒性并保护细胞免受氧化应激带来的损伤ꎬ植物已经进化出有效的机制来减轻损害[4]ꎬ如一些抗氧化酶ꎬ包括超氧化物歧化酶(SOD)㊁抗坏血酸过氧化物酶(APX)㊁过氧化氢酶(CAT)㊁过氧化物酶(POD)等ꎬ可有效清除植物体内过量的ROSꎬ以维持植物体内正常的生理代谢[5]ꎮSOD是抗氧化防御系统的首位限速酶ꎬ可以通过催化O2 -歧化为H2O2和O2以减少ROS造成的损害[6]ꎮ生物体含有一系列SOD同工酶ꎬ均属于金属蛋白酶ꎮ根据催化位点金属辅因子的不同ꎬSOD可分为四种类型ꎬ即Cu/Zn-SOD(CSD)㊁Mn-SOD(MSD)㊁Fe-SOD(FSD)和Ni-SOD(NSD)[7]ꎮFSD和MSD主要存在于低等植物中ꎬCSD主要存在于高等植物中ꎬNSD存在于链霉菌㊁蓝细菌和海洋生物中[8]ꎮ这些SOD分布在细胞的不同区域ꎬ在应对氧化应激中起关键作用ꎮ前人研究发现ꎬFSD存在于线粒体和叶绿体中ꎬMSD主要存在于线粒体和过氧化物酶体ꎬCSD主要存在于叶绿体和细胞质ꎬ而NSD主要存在于细胞质中[9]ꎮ目前ꎬ已对许多植物的SOD基因家族成员进行了分子解析ꎬ包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)㊁丹参(Salviamiltiorrhiza)㊁玉米(ZeamaysL.)㊁烟草(NicotianatabacumL.)㊁水稻(Ory ̄zasativaL.)等ꎬ结果表明ꎬ不同物种的SOD基因家族组成不同ꎬ同一物种的不同基因型间SOD组成亦存在一定差异ꎻ此外ꎬ同一类型的SOD基因在不同物种中作用也不尽一致[7ꎬ10]ꎮ小麦(TriticumaestivumL.)是世界上广泛种植的谷类作物之一ꎬ含有高比例的碳水化合物㊁蛋白质㊁矿质营养及膳食纤维ꎬ是全球85%以上人类和牲畜的主要食物原材料[11]ꎮ然而ꎬ小麦产区往往处于干旱或半干旱环境ꎬ长期灌溉和施肥使得土壤盐渍化加剧ꎬ但现推广的大多数小麦品种对土壤盐的耐受性较低㊁敏感性较强[12]ꎬ这在一定程度上致使小麦产量和品质显著下降ꎮ小麦SOD基因分析可为其抗性遗传改良提供重要信息ꎬ然而到目前为止ꎬ在全基因组水平上检测小麦SOD(TaSDs)基因家族组成的研究较少ꎮ本研究以 西农979 为试材ꎬ对小麦SOD基因家族进行全基因组鉴定ꎬ并综合分析TaSDs的系统发育关系㊁基因组内的分布㊁基序组成㊁不同组织中的表达谱以及盐胁迫下TaSDs响应锌钾的功能作用ꎬ以期为进一步研究小麦抗逆性奠定基础ꎮ1㊀材料与方法1.1㊀供试材料试验于2021年12月在北京农业职业学院技术示范区庞各庄实验站进行ꎮ供试小麦品种为 西农979 ꎬ种子来自中国农业科学院ꎮ供试氯化钠(NaCl)㊁七水硫酸锌(ZnSO4 7H2O)㊁氯化钾(KCl)均购自北京索莱宝化学生物试剂有限公司ꎮ1.2㊀小麦SOD基因家族成员的鉴定和系统发育分析1.2.1㊀小麦SOD基因的鉴定㊀小麦的核苷酸㊁蛋21㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第55卷㊀白质序列和基因注释(GeneralFeatureFormatVer ̄sion3ꎬGFF)信息从IWGSC公共数据库(https://wheat ̄urgi.versailles.inra.fr/Seq ̄Repository/Assem ̄blies)获取ꎬ并从Pfam数据库(pfam.sanger.ac.uk/)下载小麦SOD的DAN-binding结构域信息(PF00199)ꎬ将其结构域信息保存为隐藏马尔可夫格式(HMM)ꎮ使用HMMER3.0搜索工具对HMM进行初步检索与筛选[13]ꎮ使用NCBI保守域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc ̄ture/cdd/)对HMM进行进一步筛选ꎬ借助Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)再次筛选以去除冗余㊁缺失或不正确的序列ꎬ得到最终的SOD蛋白质家族ꎮ按照小麦基因命名指南(http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/98/Intro.htm/)所述的分类方法对小麦SOD蛋白质家族进行命名与分类ꎬ以得到TaSDs基因家族信息ꎮ1.2.2㊀TaSDs理化性质表征分析㊀采用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)和WoLFPSORT在线工具(https://www.genscript.com/wolf ̄psort.html)预测TaSDs的理化特性和亚细胞定位ꎻ根据各TaSDs在基因组注释中的位置ꎬ使用Map ̄Inspect软件检测TaSDs的染色体分布ꎻ根据Sava ̄di等[14]所述方法对TaSDs进行基因重复分析ꎮ1.2.3㊀TaSDs系统发育分析㊀为了进一步阐明TaSDs与其他物种SOD基因家族(SDs)之间的进化关系ꎬ下载并比较分析了拟南芥(Arabidopsisthaliana)㊁玉米(ZeamaysL.)㊁谷子(Setariaitali ̄ca)和水稻(OryzasativaL.)的SOD蛋白序列ꎮ使用MUSCLE进行全长蛋白质比对[15]ꎬ并借助MEGA-X在线软件(https://www.megasoftware.net/)采用邻接法构建系统发育树ꎬBootstrap设置为1000ꎬ其余参数为默认值ꎮ1.2.4㊀TaSDs染色体定位及共线性分析㊀从IWGSC公共数据库下载得到小麦的GFF3基因组注释文件ꎬ借助MapInspect软件将TaSDs一一定位到染色体上ꎬ并获得每条染色体的基因密度谱ꎮ借助TBtools软件将物种内和不同物种之间的染色体定位和基因重复进行可视化分析ꎮ1.2.5㊀TaSDs的保守结构域、基序和启动子序列分析㊀TaSDs蛋白的保守域采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)保守域搜索工具(CDSearch)进行检测ꎬ使用GSDS2.0在线工具(ht ̄tp://gsds.gao ̄lab.org/)检测TaSDs家族成员的内含子-外显子结构ꎬ使用MEME在线软件(ht ̄tps://meme ̄suite.org/meme/)鉴定TaSDs的保守蛋白基序ꎬ使用TBtools软件可视化TaSDs的保守结构域ꎮ为了进一步鉴定TaSDs启动子区域的推定顺式调节元件ꎬ借助TBtools软件获得TaSDs基因的起始密码子上游2000kb序列(2 ̄kb5ᶄ)ꎬ采用PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进一步分析预测TaSDs的顺式调控元件ꎮ1.3㊀TaSDs基因家族响应不同盐胁迫类型的表达分析1.3.1㊀供试小麦培养方法㊀小麦种子采用0.5%NaClO进行表面灭菌10minꎬ用去离子水冲洗数次并浸泡6hꎬ然后放置于铺垫润湿滤纸的培养皿中ꎬ28ħ培养箱暗处理催芽48hꎮ催芽结束后ꎬ先用1/4Hoagland营养液培育4dꎬ然后用1/2Hoagland营养液[16]培育3dꎬ之后用150mmol/LNaCl处理小麦幼苗ꎬ1h后进行相应Zn㊁K处理ꎬ其中ꎬZn㊁K目标离子均为200mmol/Lꎬ对照(CK)则加入无菌水ꎮ培养期间ꎬ光周期为10h/14h(昼/夜)ꎬ温度为26ħꎮ每处理设置3个生物学重复ꎮ将小麦植株根系㊁地上部分开后立即用液氮冷冻ꎬ并储存于-80ħ用于RNA提取ꎮ1.3.2㊀小麦RNA的提取㊀将小麦样品(250mg)在液氮中快速研磨ꎬ按照PlantRNAisoPlus提取试剂盒(Omega)相关说明提取小麦总RNAꎬ采用NanoDrop2000紫外分光光度计(NanoDrop2000ꎬUSA)检测RNA浓度ꎬ采用2%葡萄糖检验RNA质量ꎮ1.3.3㊀小麦RT-qPCR分析㊀将质检合格的RNA用带有gDNAEraser(TaKaRaRR047Qꎬ北京宝日医生物技术有限公司)的PrimeScriptRT试剂盒逆转录为cDNAꎮ将cDNA用无菌水稀释100倍ꎬ作为后续RT-qPCR的模板ꎮ相关引物(表1)采用Premier5.0软件设计ꎬ以Actin(GeneID:AB181991)作为内参基因ꎮRT-qPCR反应体系与反应程序参照刘佳月等[17]所述ꎬ使用Bio ̄Rad(Bio ̄RadLaboratoriesInc.ꎬUSA)的C1000TouchPCR热循环仪和CFXConnect实时检测系统进行RT-qPCR分析ꎬ每个处理进行3个复孔ꎮ用31㊀第8期㊀㊀㊀㊀㊀㊀杨林林ꎬ等:小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量ꎮ使用Origin2020软件绘图ꎮ㊀㊀表1㊀小麦基因的qRT-PCR引物序列信息基因名基因ID正向引物(5ᶄ-3ᶄ)反向引物(5ᶄ-3ᶄ)ActinAB181991ATACACGAAGCGACATACAATTCCACTGAGAACAACATTACCTaCSD3GGCTGAACTGAAACAAATGGCAGCATTTTAGCCAACAGTC2㊀结果与分析2.1㊀小麦SOD基因家族理化性质特征分析经Blast序列比对㊁除冗余和蛋白结构域筛选后ꎬ共挖掘出10个SOD家族成员ꎬ按照基因在染色体上的初步预测位置及命名指南ꎬ将其分别命名为TaCSD1~TaCSD4㊁TaFSD1~TaFSD4㊁TaMSD1~TaMSD2ꎮ由表2可知ꎬ小麦SOD基因家族蛋白质长度152~382aaꎬ分子量在15.17~42.87kDa之间ꎻ等电点为5.33~8.84ꎬ其中仅TaFSD2㊁TaF ̄SD3为碱性蛋白(等电点大于7)ꎬ其余均为酸性蛋白ꎮ亚细胞定位预测显示ꎬTaCSD1㊁TaCSD2蛋白位于细胞质中ꎬTaCSD3㊁TaCSD4㊁TaFSD4则位于叶绿体中ꎬ其余5个TaSDs均位于线粒体中ꎮ㊀㊀表2㊀小麦SOD基因家族理化性质基因名基因组ID蛋白质长度/aa分子量/kDa等电点亚细胞定位TaCSD1Ta001d028232_T00416316.826.23细胞质TaCSD2Ta001d029170_T00315415.175.83细胞质TaCSD3Ta001d031908_T00120620.905.45叶绿体TaCSD4Ta001d002611_T00230832.115.33叶绿体TaFSD1Ta001d014632_T00115217.806.58线粒体TaFSD2Ta001d036135_T00328432.438.84线粒体TaFSD3Ta001d045384_T00320123.027.14线粒体TaFSD4Ta001d045538_T00138242.875.63叶绿体TaMSD1Ta001d037859_T00121322.846.71线粒体TaMSD2Ta001d009990_T00124326.446.65线粒体2.2㊀TaSDs基因系统发育关系和分类为了进一步研究双子叶植物和单子叶植物中SOD蛋白的系统发育关系ꎬ基于37个全长蛋白质序列的比对构建系统发育树ꎬ其中包括小麦的10个序列㊁玉米的3个序列(ZmFSD1㊁ZmCSD1㊁ZmCSD2)㊁谷子的8个序列(SiCSD1㊁SiCSD2㊁SiCSD3㊁SiCSD4㊁SiFSD1㊁SiFSD2㊁SiFSD3和SiMSD)㊁水稻的8个序列(cCuZn-SOD1㊁cCuZn-SOD2㊁CuZn-SOD-L㊁pCuZn-SOD㊁CuZn-SOD-CCh㊁Fe-SOD3㊁Fe-SOD2和Mn-SOD1)㊁拟南芥的8个序列(AtCSD1㊁AtCSD2㊁AtCSD3㊁AtFSD1㊁AtFSD2㊁AtFSD3㊁AtMSD1和AtMSD2)ꎮ根据系统发育树ꎬ这37个SOD蛋白可分为两组ꎬⅠ组为Fe/MnSODsꎬⅡ组为Cu/ZnSODsꎬ与它们所包含的结构域类型一致(图2)ꎮⅠ组包含19种SOD蛋白ꎬ可进一步分为3个亚组ꎻ在Ⅱ组中ꎬ18种SOD蛋白分为4个亚组ꎮ聚集在同一亚组中的大多数SOD蛋白具有较为相同的亚细胞定位(表2)ꎬ例如ꎬ在线粒体的FSDs(TaFSD1㊁TaFSD2㊁TaFSD3)㊁MSDs(TaMSD1㊁TaMSD2)分别聚为a㊁c亚群ꎮ此外ꎬ在每个亚组中ꎬ我们发现TaSDs与玉米㊁谷子及水稻的关系比拟南芥更密切ꎮ2.3㊀TaSDs基因结构及保守结构域分析2.3.1㊀TaSDs基因结构与保守基序分析㊀使用GSDS2.0在线工具分析了35个SOD基因组(图2A)的结构信息ꎬ即所有序列中的外显子-内含子数量和分布ꎮ由图2B可知ꎬ外显子和内含子的数量在单子叶和双子叶植物的基因之间存在较大差异ꎬ外显子的数量为1~9不等ꎮ水稻㊁高粱㊁玉米和小麦的SOD基因有1~8个外显子ꎬ拟南芥和油菜的SOD基因有7~9个外显子ꎬ而所有TaSDs都具有1~7个内含子和2~7个外显子ꎮ为了更好地了解SOD基因家族ꎬ使用NCBI保守域数据库对SOD蛋白的保守域进行分析ꎬ并构建所有SOD蛋白结构的示意图(图2C)ꎬ可见ꎬ所有SOD蛋白均包含一个超氧化物歧化酶核心结构域(PF00199ꎬSuperoxidedismutase)和一个超氧化物歧化酶免疫反应结构域(PF06628ꎬSuper ̄oxidedismutase ̄rel)ꎬ且来自不同物种的SOD基因具有高度的序列和基因结构相似性ꎬ揭示了SOD基因家族成员之间的进化仍具有保守性ꎮ41㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第55卷㊀图1㊀5个物种SOD家族系统发育分析图2㊀TaSDs基因家族编码蛋白的基因结构与保守基序分析2.3.2㊀TaSDs基因保守蛋白质基序分析㊀由图3可知ꎬCSD的所有保守结构域的bits值皆大于1ꎬ表明TaSDs蛋白中的8个氨基酸(甘氨酸㊁亮氨酸㊁组氨酸㊁天冬氨酸㊁丝氨酸㊁苏氨酸㊁天冬酰胺和脯氨酸)基序均为保守结构蛋白质基序ꎮ类似的ꎬFSD包括8个保守氨基酸(缬氨酸㊁脯氨酸㊁酪氨酸㊁丙氨酸㊁亮氨酸㊁谷氨酸㊁丝氨酸和组氨酸)ꎬ而MSD则包括FSD和铁基的保守金属结合51㊀第8期㊀㊀㊀㊀㊀㊀杨林林ꎬ等:小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析结构域DVWEHAYYꎮ以上结果表明ꎬ小麦SOD基因家族中的不同亚家族(CSD㊁FSD㊁MCD)含有其特有的氨基酸序列组成ꎬ且均包括一系列高度保守的活性位点残基ꎬ这些残基可能在催化离子(如Fe2+㊁Zn2+)的序列特异性结合中发挥作用ꎮ横轴上的数字表示氨基酸的位置ꎬ纵轴上的数字表示蛋白质的保守性ꎬ字母的高度表示其在motif中出现的频率ꎮmotif1㊁motif3㊁motif6分别为小麦Cu/Zn-SODs(CSD)㊁Fe-SODs(FSD)㊁Mn-SODs(MSD)的保守基序ꎮ图3㊀TaSDs基因保守蛋白质基序分析2.4㊀TaSDs基因的染色体定位为了确定TaSDs基因在染色体上的位置及相关基因扩增片段区域ꎬ基于小麦基因组数据库IWGSC的最新数据ꎬ以97%的序列映射到染色体以及无法映射到任何染色体的为锚定支架ꎬ结果(图4)显示10个TaSDs基因中ꎬ除TaFSD4外ꎬ其余9个SOD基因均可被定位到小麦染色体上ꎬ且该9个基因不均匀地分布在8个不同染色体臂的远端区域ꎻ其中ꎬTaCSD3和TaMSD1聚集成串联重复事件区域ꎬ但这些串联基因在任何其他亚基因组中都没有同源拷贝ꎮ此外ꎬTaSDs基因家族扩增和重复之间的关系显示ꎬTaFSD2㊁TaFSD3㊁TaFSD1为同源基因ꎻTaCSD2㊁TaCSD1㊁TaCSD4为同源基因ꎬ且与TaFSD2㊁TaFSD3㊁TaFSD1构成不同的同源基因组ꎮ这些结果表明TaSDs家族的进化是由片段复制和基因串联事件驱动的ꎮ图4㊀TaSDs基因的染色体定位61㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第55卷㊀2.5㊀TaSDs基因启动子中的顺式元件分析结果(图5)表明ꎬ除一些光照㊁细胞分化调控等基本核心元件外ꎬTaSDs还含有激素反应元件(ABA㊁GA㊁SA㊁Me-JA)以及缺氧或厌氧诱导元件等ꎬ这些顺式作用元件是非生物应激反应的关键组成部分ꎮ例如ꎬTaCSD1㊁TaCSD4含有与冷胁迫相关的顺式元件ꎬ而TaFSD3㊁TaFSD4㊁TaCSD4㊁TaMSD2含有水杨酸(SA)反应元件ꎻTaFSD2㊁TaCSD2㊁TaCSD3的启动子特异地含有一个与分生组织表达相关的元件ꎬ表明其可能与分生组织的发育有关ꎮ此外ꎬ在大多数启动子区域内发现了一些转录因子结合位点ꎬ如MYB结合位点ꎬ表明TaSDs基因可能受MYB转录因子的调节ꎮ总的来说ꎬ同一类别的TaSDs基因可能具有不同的作用方式ꎬ并且不同类别的基因也可能具有协同作用ꎮ图5㊀TaSDs基因启动子的顺式元件分析2.6㊀TaSDs基因在盐胁迫下的表达模式分析由图6可知ꎬ盐胁迫(NaCl)和无盐胁迫对照(CK)条件下ꎬTaFSD4㊁TaMSD2㊁TaFSD3在小麦地上部(shoot)和根系(root)中均具有较高的表达水平ꎬ而TaFSD1均不表达ꎮTaCSD2仅在盐胁迫0㊁12㊁24h的小麦根系中高表达ꎮTaMSD1㊁TaCSD4㊁TaCSD1均在小麦根系中表达ꎮ特别的ꎬTaCSD3㊁TaFSD2在盐胁迫12㊁24h的根系㊁地上部中高表达ꎬ而在盐胁迫0h及对照的根系㊁地上部不表达或极低表达ꎬ初步表明这两个基因可能参与了盐胁迫的调控ꎬ应在后续研究中予以重视ꎮ2.7㊀TaCSD3基因在盐胁迫下及响应锌钾的表达分析根据TaSDs表达谱分析结果ꎬ选择可能参与盐胁迫调控的TaCSD3ꎬ进一步研究其在盐胁迫下的表达水平及响应Zn㊁K的表达情况ꎮ由图7可知ꎬ无论在无盐胁迫处理(CK)还是无盐胁迫处理下的相关锌钾处理(Zn㊁K㊁Zn+K)中ꎬTaCSD3在小麦根系和地上部中均几乎不表达ꎻ而在150mmol/LNaCl处理下ꎬTaCSD3表达水平较CK显著升高ꎬ增施Zn㊁K后其表达水平进一步显著提高ꎬ在同时增施Zn和K处理下最高ꎬ即无论是在根系还是地上部中各处理表现为NaCl<NaCl+K<NaCl+Zn<NaCl+Zn+Kꎬ且TaCSD3在根系的表达水平明显高于地上部ꎮTaCSD3在不同组织中的表达模式与转录组测序结果基本一致ꎬ进一步证实了上述TaSDs基因表达数据的可靠性ꎬ同时表明TaCSD3是响应盐胁迫的指示性SOD基因ꎬ同时受Zn㊁K正向调控ꎮ71㊀第8期㊀㊀㊀㊀㊀㊀杨林林ꎬ等:小麦超氧化物歧化酶基因家族鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析图6㊀TaSDs基因在盐胁迫和对照小麦不同部位的Heatmap分析柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)ꎮ图7㊀TaCSD3基因在盐胁迫下响应锌钾的表达分析3㊀讨论与结论小麦是世界第二大粮食作物ꎬ对保障人类粮食安全具有重要意义[11]ꎮ然而ꎬ小麦生长发育及产量易受到土壤盐渍带来的不利影响ꎮ在植物防御系统中ꎬSOD在清除细胞内过量的活性氧自由基中发挥着重要作用[6-8ꎬ18]ꎮ已在多种植物物种中进行了SOD家族基因的研究ꎬ鉴定小麦SOD基因并确定其在盐胁迫响应中的功能可为小麦抗盐育种提供优良的基因靶点ꎮ本研究基于pfam搜索和蛋白质Blast对比ꎬ在小麦品种 西农979 中鉴定出10个SOD基因(TaSDs)ꎬ包括4个Cu/Zn-SODs基因(TaCSDs)㊁4个Fe-SODs基因(TaFSDs)和2个Mn-SODs基因(TaMSDs)ꎻ这些蛋白质长度在152~382aaꎬ分子量在15.17~42.87kDaꎬ且多为酸性蛋白ꎬ主要分布于线粒体㊁叶绿体㊁细胞质中ꎮSOD基因的数量因植物而异ꎬ水稻㊁高粱和番茄中往往更少ꎬ这种差异可能81㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第55卷㊀归因于基因重复(串联和节段重复)[7ꎬ19]ꎮ系统发育分析表明ꎬ5个物种的37个SOD蛋白可以分为Fe/Mn-SODs和Cu/Zn-SODs两组ꎬ其中ꎬ前者包含19个SOD蛋白ꎬ可进一步分为3个亚组ꎻ后者包含18个SOD蛋白ꎬ可分为4个亚组ꎮ此外ꎬ来自单子叶植物(小麦㊁玉米㊁谷子和水稻)和双子叶植物(拟南芥)的SOD更倾向于分散分布ꎬ且单子叶植物的SOD更易聚集在Fe/Mn-SODs组中ꎬ表明这些基因可能共享共同的祖先基因ꎮ然而ꎬ一些小麦SOD与其旁系同源蛋白以外的其他物种的直系同源物表现出密切的系统发育关系ꎬ表明其与这些直系同源物可能起源于共同的祖先ꎬ并在早期基因组变异后分化ꎮ基因结构已被确定为基因家族进化的代表性标志之一[20]ꎮ本研究结果表明ꎬTaSDs的外显子和内含子在单子叶植物和双子叶植物之间亦存在差异ꎬ所有TaSDs都具有1~7个内含子和2~7个外显子ꎮ前人研究也表明ꎬ一个SOD基因的祖先拷贝有7个内含子[21]ꎮ可见ꎬTaSDs基因在进化过程中经历了外显子和内含子的变化ꎬ相应的TaSDs含有超氧化物歧化酶结构域ꎮ此外ꎬTaSDs的不同亚家族(CSD㊁FSD㊁MCD)有各自特有的氨基酸序列组成ꎬ包含一系列高度保守的活性位点残基ꎮ以上结果表明这些基因在进化过程中是保守的ꎮ基因串联重复事件经常发生在植物进化过程中ꎬ与片段重复事件共同被认为是增加基因家族多样性的关键机制ꎬ而基因重复在SOD基因的多样化扩展中亦起着至关重要的作用[22]ꎮ本研究中ꎬ除TaFSD4外ꎬ其余9个SOD基因均被定位到8个不同的染色体上ꎻ发现了串联重复的SOD基因对ꎬ即TaCSD3与TaMSD1ꎬ该两基因在任何其他亚基因组中均没有同源拷贝ꎮ一般而言ꎬ单子叶植物基因应在亚基因组中同时具有3个同源拷贝[7]ꎻ然而TaCSD3㊁TaMSD1仅为两个ꎬ这可能是小麦α-型亚基在染色体之间发生易位以及进化过程中基因组多倍化和基因复制的结果[23]ꎮ基因表达受许多参与各种途径的顺式作用元件和反式作用因子的相互作用调节[8]ꎮ前人研究已经证实ꎬ一些SOD基因可被不同的元件途径所诱导ꎬ例如寒冷㊁高温㊁激素[21ꎬ24-25]等ꎮ本研究结果表明ꎬTaSDs基因启动子包含各种应激反应元件ꎬ如冷反应㊁厌氧诱导元件ꎻ一些TaSDs启动子还包括MYB结合位点ꎬ表明这些SOD基因可能受MYB转录因子的调节ꎻ此外ꎬ一些TaSDs基因启动子中还发现了一些响应分生组织表达㊁细胞周期调控以及光㊁激素(ABA㊁SA㊁GA㊁Me-JA㊁IAA)反应的元件ꎬ表明TaSDs基因可能通过调节活性氧代谢网络参与植物生长和细胞分化ꎮ矿质养分在提高植物的盐胁迫耐受性方面起着重要作用ꎮ钾(K)是一种常量营养元素ꎬ在调节植物生理生化中起着重要作用ꎬK+与Na+往往共用同类运输蛋白ꎬ因此增加对K+的摄取可以降低对Na+的吸收ꎬ从而避免盐诱导的氧化应激和相关细胞损伤[26]ꎮ锌(Zn)是重要的微量营养物质ꎬ是Cu/Zn-SODs亚家族编码蛋白特殊位点的重要催化物质之一[27]ꎬ能最大限度地减少盐碱化的有害影响ꎬ降低NADPH氧化酶的活性以减少活性氧的产生ꎬ从而减轻膜脂过氧化[28]ꎮZn㊁K在基因调控㊁蛋白质合成㊁降低氧化损伤和DNA转录中均起着关键作用[26ꎬ29]ꎮ本研究中ꎬ基于RNA转录组的Heatmap分析显示ꎬTaCSD3基因可能参与盐胁迫的调控ꎻ进一步的RT-qPCR分析显示ꎬTaCSD3在无盐胁迫下不表达ꎬ而在盐胁迫下显著上调表达ꎬ且受Zn㊁K的诱导进一步上调表达ꎬ在NaCl+Zn+K处理下表达水平最高ꎮ表明TaCSD3是影响盐胁迫的靶向SOD基因ꎬ同时受Zn㊁K正向调控ꎮ本研究结果为未来研究小麦SOD蛋白在生物过程中的功能奠定了基础ꎬ也为小麦在盐胁迫育种方面的改良提供了理论依据ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[1]㊀祁伟亮ꎬ孙万仓ꎬ马骊.活性氧参与调控植物生长发育和胁迫应激响应机理的研究进展[J].干旱地区农业研究ꎬ2021ꎬ39(3):69-81ꎬ193.[2]㊀MansoorSꎬAliWaniOꎬLoneJKꎬetal.Reactiveoxygenspe 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【免费】过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力

【免费】过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力

ISSN 1007-7626CN 11-3870/Q中国生物化学与分子生物学报http ://cjbmb.bjmu.edu.cnChinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2015年4月31(4):414 421DOI :10.13865/j.cnki.cjbmb.2015.04.12收稿日期:2014-10-20;接受日期:2015-01-07江苏省农业科技自主创新资金项目(No.CX (14)2098)*联系人Tel :0513-********;E-mail :yjnkyy@163.com#共同第一作者Received :October 20,2014;Accepted :January 7,2015Supported by Fund for Independent Innovation of Agricultural Sciences and Technology in Jiangsu Province (No.CX (14)2098)*Corresponding author Tel :0513-********;E-mail :yjnkyy@163.com#These authors contributed equally to this study过量表达柳树两个SVP 1s 基因提高拟南芥抗盐胁迫能力余春梅1)#,李敏2)#,何新雨1),李玉娟2),王莹2),谈峰2),张健2)*(1)南通大学生命科学学院,江苏南通226019;2)江苏沿江地区农业科学研究所,江苏如皋226541)摘要在拟南芥、水稻等草本植物中,人们对位于液泡膜上质子泵焦磷酸酶(VPase )进行了较为深入的研究,其通过水解焦磷酸释放的能量将H +从细胞质泵入液泡中,从而驱动Na +、K +等的运输,避免了细胞质中因过量的Na +、K +造成的伤害,保护了细胞的正常功能.但是木本植物如柳树中的VP 1基因(SVP 1)的功能尚未见报道.本研究检测了两个SVP 1s 同源基因在柳树L0911不同的组织(器官)中以及昼夜条件(以叶片为代表组织)下的表达模式,同时,分析了过量表达SVP 1s 拟南芥T3转基因株系的耐盐特性.结果表明:SVP 1.1在韧皮部中表达最高,而SVP 1.2在韧皮部和新生枝条是其在根部的4 5倍;叶片中两个SVP 1s 在白天稳定表达,18ʒ00后逐渐下降,在黑暗条件下,随着暗处理时间的延长SVP 1.2增幅较大;在盐胁迫条件下,SVP 1s 转基因拟南芥T3株系种子萌发率,叶片中与活性氧清除相关的酶,如SOD 、POD 和CAT 等活性的诱导强度高于野生型对照;SVP 1.1转基因株系叶片膜质氧化程度(MDA )低于野生型和35S :SVP 1.2株系.通过本研究显示,在拟南芥中过量表达柳树SVP 1.1s 提高了拟南芥的耐盐能力,揭示了木本植物中VP 1基因同样具备保护细胞,使细胞耐受高盐胁迫的功能,同时也为选育优良耐盐树木品种提供了理论依据.关键词柳树L0911(Salix “Hailiu 1”);SVP 1s 基因;拟南芥;耐盐性中图分类号S688Over-expression of Two Vacuolar H +-translocating Pyrophosphatase(SVP 1s )Genes of Willow Enhances Arabidopsis Salt ToleranceYU Chun-Mei 1)#,LI Min 2)#,HE Xin-Yu 1),LI Yu-Juan 2),WANG Ying 2),TAN Feng 2),ZHANG Jian 2)*(1)College of Life Sciences ,Nantong University ,Nantong 226019,Jiangsu ,China ;2)Institute of Agricultural Science in Regions along Yangtze River of Jiangsu ,Rugao 226541,Jiangsu ,China )Abstract In herb plant such as arabidopsis and rice ,membrane-bound vacuolar H +-translocatingpyrophosphatases (VPase )have been investigated deeply.It pumps protons (H +)from the cytoplasm to vacuoles using the energy from the hydrolyzation of inorganic pyrophosphate ,and then H +gradients promote ions such as Na +and K +entering into vacuoles through transporters and channels ,which can protect cell against the poison of extreme ion accumulating.But the functions of VP 1in wooden plant such as willow remain unclear.In this study ,we first analyzed organs (or tissues )transcriptional level ,and the day and night expression patterns in leaves of two SVP 1s from willow L0911.Then we introduced two SVP 1genes to Arabidopsis (Ecotype Col-0)by agrobacterium mediated transformation.Last ,we第4期余春梅等:过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力detected the germination rate,the enzyme activities such as SOD,POD and CAT in the T3lines over-expressing(OE)the SVP1.1s.The malonyldialdehyde(MDA)contents which reflected the peroxidation of the membranes lipid were also detected.Our results showed that SVP1.1expresses highest in the phloem,while SVP1.2exhibits highest expression in both phloem and new shoots.Both SVP1.1s’expression was very steady during6ʒ00to16ʒ00,after that it decline gradually,but SVP1.2increased quicker than SVP1.1as the time of dark extending.Germination rate of T3OE lines of two SVP1s were both higher than controls under100mmol/L NaCl treatment.In most cases,the activity of SOD,POD and CAT in OE lines(especially SVP1.1OE lines)were all higher than those of WT under same condition.SVP1.1OE lines had10% 25%lower MAD content in leaves than WT under stress conditions.Collectively,the OE lines showed more salt tolerance than WT.This research showed that VP1genes in wooden plant have the same function as its homologous gene in herb plant.The result and resources obtained in this research may be useful for further breeding of salt-tolerance willow varieties.Key words willow L0911(Salix“Hailiu1”);SVP1s;Arabidopsis;salt tolerance土壤盐碱化是一个世界性的问题,沿海滩涂是面积最大的盐碱地,也是潜力巨大的国土资源.因沿海盐碱地理化性状差,绝大都数植物在盐碱地上生长不良甚至不能成活,难于建立植被,制约了农林生产,影响生态环境[1].柳树为杨柳科柳属(Salix)落叶乔木,在我国有较广的分布,部分品种能在含盐量4.0‰左右、pH值10.4的土壤中正常生长,是我国极具潜力的沿海滩涂造林和生物质能源树种[2].挖掘柳树中的耐盐相关基因将具有积极的生产和生态意义.植物液泡膜上质子泵焦磷酸酶(vacuolar H+-translocating inorganic pyrophosphatase,VPase,VP,EC3.6.1.1)是植物中特有通过水解焦磷酸(PPi)驱动的质子泵,它与另一个质子泵H+-ATPase (EC3.6.1.3)(以ATP为动力)一起,在液泡膜的内外形成的质子梯度,促进了Na+、K+等离子进入液泡[3].在盐胁迫条件下,非盐生植物将过量Na+区隔化入液泡中,避免高浓度的盐对细胞的伤害[4,5].植物中的VP基因一般有多个成员,分为对K+敏感的I型和对K+不敏感的Ⅱ型,其中Ⅰ型VP基因在植物中发挥主要的功能[6-10].对水稻6个I型VP基因的研究表明,OVP1受冷处理诱导[11];在能够耐受洪水浸泡的品种中,OVP3受到缺氧(anoxia)的诱导[12].小麦中至少有3个基因编码I型VP,其中TaVP3只在发育的种子中检测到表达,TaVP2主要在茎器官中,叶片中该基因在脱水条件下的表达受到抑制,但在盐处理条件下,根中的TaVP2表达受到诱导;TaVP1在小麦器官中的表达比较丰富,但在根中的表达最高,且受到盐的诱导[13].葡萄中两个I型VP基因均在葡萄果实发育的后期表达,且受到冷害的诱导[10].可见,I型VP基因家族成员在植物中的表达存在组织器官和环境因子诱导的特异性,亦表明不同的I型VP成员在体内可能发挥不同的功能.植物在盐胁迫条件下,造成细胞内积累过量的超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(.OH)和单线态1O2等活性氧(ROS),引起胞内和细胞膜上的脂肪酸过氧化,降低胞内大分子物质如蛋白质、核酸的合成以及蛋白质的功能[14].植物在进化过程中,产生了多种能够清除体内活性氧的酶,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1),利用细胞中的H+,将O2-转化为过氧化氢(H2O2)和O2.过氧化氢(H2O2)进一步被POD (peroxidases,EC1.11.1.7)和CAT(catalase,EC 1.11.1.6)等酶清除[15,16].多个研究表明,耐盐植物中一般具有或能诱导产生较高活性氧清除酶活,如Jin等[17]研究表明,在耐盐的大麦中,可诱导产生新的SOD和POD的同工酶;Wang等[18]研究表明,耐盐水稻中SOD和POD的活性均高于不耐盐的品种.我们前期的研究结果表明,柳树(Salix)中至少有两个I型VP成员:SVP1.1和SVP1.2[19].盐胁迫条件下,这两个成员在不同的柳树种中具有不同的表达特性,但这两个成员的功能尚需进一步验证.本研究对两个SVP1同源基因在L0911柳树中器官(组织)表达模式以及昼夜表达模式进行了研究.将这两个成员在拟南芥中进行异源表达,通过分析阳性转基因株系在盐胁迫条件下种子的萌发、活性氧清除相关酶的活性以及细胞膜膜质的氧化(MDA)等,对两个SVP1s的功能进行了研究.1材料与方法1.1材料柳树L0911(Salix“Hailiu1”)为江苏沿江地514中国生物化学与分子生物学报第31卷区农业科学研究所选育,本实验用2 3年生枝条,15 16cm 长,在1/2Hoglangd 培养液水培40 50d.拟南芥(Columbia 生态型,WT ),转基因株系,均采用1/2MS (Murashige 和Skoog )含1%蔗糖固体培养基中进行播种后,在泥炭土:蛭石1ʒ1进行土培.所有植物生长于温室,温度为24/18ħ(白天/黑夜),光照14h ,光照强度为600 1000μmol ·m -2·s -1.WT 拟南芥抽薹后大约7d 用于转化.5 6片莲座叶拟南芥用于分子鉴定.柳树SVP 1.1和SVP 1.2TA 克隆质粒[19],pWM101载体,大肠杆菌DH5α,农杆菌GV3101菌种等由南通大学生命科学学院生物学系实验室保存.所用的化学试剂购自上海生工生物技术有限公司和AMRESCO (美国).质粒提取试剂盒购自碧云天生物技术公司(江苏海门).内切酶、dNTP 、ExTaq 、定量表达用SYBRPremix ExTaq TM等分子生物学相关试剂购自宝生物公司(辽宁大连).引物合成为上海生工生物技术有限公司.1.2RNA 提取与cDNA 的合成用TRIzol Plus RNA 试剂(Life technologies ,上海)提取RNA ,具体方法按说明书方法进行.cDNA合成为PrimeScript TMDouble Strand cDNA Synthesis Kit (大连宝生物),具体方法参照说明书进行.1.3柳树中SVP 1s 基因定量表达分析在ABI7500定量PCR仪中进行定量PCR分析(soft V2.0.4),具体方法参见[19].柳树L0911根、木质部、树皮(主要为韧皮部)、叶片以及新生枝条(叶片未完全展开,长度为2 3cm )中合成的cDNA 用于器官表达模式.L0911的叶片从6ʒ00 24ʒ00每隔2h 取样,用于叶片中SVP 1s 昼夜表达模式的定量分析.UBQ (Ubiqutin Q )基因用于本实验cDNA 模板内参(Table 1)1.4植物表达载体构建将SVP 1.1和VP 1.2分别克隆到植物表达载体pWM101,形成pWM-SVP 1.1和pWM-SVP 1.2载体(Fig.1),所用引物如Table 1.具体方法参考分子克隆实验手册.质粒提取与酶切等按照试剂盒说明书进行.Table 1Primers used in this studyPrimer Sequence (from 5'to 3')UsageSVP-KpnI-F1atGGTACCATGGTTTCGGTGATTTTGCCAGSVP-PstI RagCTGCAGTCAGAATATCTTGAAGAGCAGG Construct pWM-SVP 1.1plant expressional vector SVP-KpnI-F2atGGTACCATGGGGATGTTGAGTGAA SVP-BamHI-RctGGATCCTCAGAAATATTTGAACAGC Construct pWM-SVP 1.2plant expressional vector HPT Foward ACACAGCCATCGGTCCAGAC 35S promoter RTCTCAGAAGAACAAAGGGC Identify the Arabidopsis transgenic plants VP1.1F2ATGGTCGAGGAAGTTCGCAG VP1.1R2GAGGGGTGTGAGCATGACAA Pair to detect expression of SVP 1.1in willow [19]VP1.2F2AATGCTCCCATACTGGTTCTC VP1.2R2GGCGATAAGTGGTGTAAGC Pair to detect expression of SVP 1.2in willow [19]UBQL TGAGGCTTGGGGAGGAACT UBQRGATCTTGGCCTTCACGTTGT Internal control gene using in the qPCR[19]OE VP1F2CTGGAGGTGCATGGGACAAT OE VP1R2ATCTTGAAGAGCAGGCCACC Detect SVP 1.1expression in Arabidopsis OE VP1F3AACTGTCGACGTCTTGACCC OE VP1R3GGATCTCCGATCGTGTCACC Detect SVP 1.2expression in Arabidopsis AtVP1F1TCATGGGTTGGCTTACCGAC AtVP1R1AGTTCTTTCACGGATGCGGTDetect endogenous AtVP 1gene expressionRestricted enzyme sites wereunderlinedFig.1Diagram of pWM-SVP 1vector TBL (R):T Border Left (Right );35S P :35S promoter ;35S En :35SEnhancer ;HPT :hygromycin B phosphotrasferase resistance gene ,VP 1.1and VP 1.2are two Salix VP 1genes614第4期余春梅等:过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力1.5农杆菌的转化农杆菌GV3101用CaCl2制备感受态,用冻融法将测序正确的pWM-SVP1.1和SVP1.2质粒转化农杆菌,并通过菌落PCR鉴定为阳性的单克隆,用于后续转化.1.6拟南芥侵染侵染方法采用浸花法[20].将转化pWM-SVP1.1和SVP1.2农杆菌在LB溶液中培养至A600=1,离心收集后,悬浮在等体积的1/2MS液体(含5%蔗糖,0.1% 0.3%Silwet)溶液中,用滴管滴加在WT花序的顶部,暗培养24h后,恢复正常培养.1.7拟南芥转基因阳性植株筛选和分子检测收获侵染过的拟南芥T1代种子经20%bleach 溶液消毒10min,蒸馏水洗涤5 6次,将种子点播于潮霉素(HPT+,15mg/L)1/2MS筛选培养基上筛选约14d后,表现抗性转基因长出真叶,盆栽培养.待在土培苗长出5 6片真叶后,取适量叶片提取基因组DNA(天根植物基因组提取试剂盒,DP320,具体方法参照试剂盒说明书),选用相应引物(Table 1,35S HPT Forward和35S PromoterR)进行PCR鉴定.T1植株进一步用于提取RNA,合成cDNA,并进行单株中两个外源SVP1s和拟南芥内源的AVP1(At1G15690)表达检测.对基因组、转录水平检测均为阳性的植株,繁殖至T3,T3表现无抗性分离的株系用于功能验证.1.8转基因拟南芥耐盐性检测1.8.1萌发率统计T3转基因拟南芥种子和及WT种子经消毒后点播于含100mmol/L NaCl的1/ 2MS+1%蔗糖培养基中,每皿种子各100粒,重复3次,培养7d后统计发芽种子数.1.8.2盐胁迫下抗氧化酶活性采用与1.7中相同的T3株系材料,土培至5 6片莲座叶,分别进行0,100,200mmol/L NaCl溶液处理7d后,检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等的活性,具体方法参照文献[21,22].1.8.3细胞膜损伤程度测定取0.500g样品,加5%三氯乙酸5mL,研磨后所得匀浆在3000r/min 下离心10min.取上清液2mL,加0.67%硫代巴比妥酸2mL,混匀后在100ħ水浴30min,冷却后3000r/min离心10min.取上清液测定在450nm、532nm和600nm处吸光度值.按文献[21,22]方法计算MDA浓度.上述方法对所有株系的测定均设3次生物样品重复和3次技术重复,每个参数测定取其平均值.1.9统计方法利用SPSS13.0软件进行显著性差异分析(Student’s t-test)2结果2.1两个SVP1s基因在柳树L0911中的器官表达模式通过器官表达模式的分析表明,SVP1.1韧皮部中表达相对较高,是其在根中的4 5倍,在木质部中表达相对较低,大约为根中的0.4 0.5倍.而SVP1.2在韧皮部和新生枝条中表达相对较高(Fig.2).两个基因不同的表达模式,可能表明两者在不同的组织或不同发育阶段发挥功能.Fig.2Transcriptional pattern analysis of two SVP1 genes in different organs of L0911All samples were collected from at least three individual cuttings and pooled together for isolating totalRNA.TheRNA was converted to cDNA.QuantitativeRT-PCRwas performed,in which the willow UBQ gene was used as the internal control.The transcriptional profiles in all samples were compared to that in roots.Data are meanʃS.E.M.(n≥3),*P<0.05,**P <0.01,***P<0.001,Student’s t-test2.2两个SVP1s基因在柳树L0911叶片中的昼夜表达模式在柳树L0911中,两个SVP1基因的表达在6ʒ00 16ʒ00间没有明显变化.但18ʒ00后两个基因的表达均呈现下降,到22ʒ00为最低值,大约为对照样品(6ʒ00)的0.5倍(Fig.3).随后,随着暗处理时间的延长,VP1.2的增加明显快于VP1.1,说明两个基因可能对暗处理的响应不相同.2.3pWM-SVP1s植物表达载体的构建以及重组农杆菌的获得通过Table1中引物分别以SVP1.1和VP1.2TA714中国生物化学与分子生物学报第31卷Fig.3Daily course of the accumulation of two SVP 1transcripts in L0911leavesLeaves were collected fromthree different cuttings and pooled together for isolating RNA.cDNA synthesis and RT q-PCRexperiments were conducted.The Ubiquitin Q gene was used as an internal control.All samples in transcriptional analysis were compared at the 6:00AM.The light was turn on at 6:00AM ,and off at 20:00PM.Data are mean ʃS.E.M.(n ≥3),*P <0.05,Student ’s t -test质粒为模板进行扩增后,通过相应的酶切处理载体和PCR产物后,经过连接,转化至大肠杆菌后,对获得单克隆进行鉴定.重组质粒经过酶切和测序验证后(Fig.4),用于后续的农杆菌转化.对农杆菌进行PCR鉴定后(结果未显示),用于后续拟南芥的转化.Fig.4Identification of the pWM-SVP 1s recombinantvectorRestriction enzymes digested products wereseparated by 1%agarose gel electrophoresis.1.pWM-VP 1.1recombinant plasmid.2.pWM-VP 1.2recombinant plasmid.3.pWM-VP 1recombinant plasmid without RE treatment.The upper and lower bands were the open circle and super coiled molecular of the recombinant plasmid ,respectively.4.pWM101vector.M.DNA molecular size standards2.4阳性转基因拟南芥的筛选与分子鉴定进行T1种子的潮霉素抗性筛选和T1植株的分子鉴定.如Fig.5A 所示,转基因阳性植株能正常生长呈现绿色,而阴性植株会逐渐黄化死亡.对表现抗性的植株通过T1植株进一步通过Table 1中的引物HPT foward 和35S promoter R进行验证.Fig.5B 显示了部分材料的鉴定结果,表明这些材料中具有pWM 101载体上35S 启动子和潮霉素基因序列,但目标基因是否能正常表达,尚需进一步验证.Fig.5Identification of positive Arabidopsis transgenic plants(A )T1seeds germinated on HPT (15mg /L )selective 1/2MS medium.Positive transgenic individual plants could grow true leaves ,while other plants died on the selective medium.The arrows showed the positive ones.(B )PCRproducts of primers HPT forward and 35S promoter Rwere separated by 1%agarose gel electrophoresis.The brightest bands were the DNA fragments spanning the 35S promoter and HPT gene on pWM 101vector.M :DNA molecular size standards.1:WT plants.2-8:T1individual plants which were screened by the HPT selective medium (only showed part of plant T1identified )2.5SVP 1s 基因的表达检测过量表达SVP 1.1和SVP 1.2成员的植株中同时含有内源AVP 1基因的表达.本研究设计了这3个基因特异引物(Table 1),检测T1单株VP 1s 转录水平.统计检测的材料,发现80%以上T1单株(总数为46株,结果未显示)能够表达外源基因;部分材料虽然在基因组水平检测到载体序列的存在,但目标SVP 1s 基因不表达(如Fig.5B ,Lane 2).2.6转基因植株耐盐性检测2.6.1盐胁迫条件下转基因拟南芥萌发率高于野814第4期余春梅等:过量表达柳树两个SVP 1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力Fig.6SVP 1expression in Arabidopsis T1transgenic plantsLeaves of T1individual plants (positive plantsscreened by HPT )were collected for isolating RNA.cDNA synthesis and RT-PCRwere conducted.The PCRproducts were separated by 1%agarose gel electrophoresis.1:WT ;2-4:SVP 1.1T1individual transgenic plants ;5-7:SVP 1.2T1transgenic plants.Arabidopsis AVP 1(At 1G 15690)as internal control生型对照在含有100mmol /L NaCl 的1/2MS培养Fig.7ROS scavenging related enzyme activities and MDA contents in leaves under salt stress (A )SOD enzymeactivities.(B )POD enzyme activities.(C )CAT enzyme activities.(D )MDA contents.WT ,Col-0ecotype ;SVP1.1OE2and OE7,SVP1.2OE3and OE6are T3lines come from T1which can express SVP 1s gene.OE lines and WT seedling with 5-6leaves were treated under 0,100and 200mmol /L NaCl for 7days and the leaves were collected for enzyme activities (orMDA contents )test.Data are mean ʃS.E.M.(n ≥3),*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001,Student ’s t -test基上,转SVP 1.1基因拟南芥萌发率为85%ʃ4.7%,其根和子叶均能正常生长;而转SVP 1.2基因拟南芥萌发率为45%ʃ5.2%,主根和子叶生长速度慢;野生型拟南芥萌发率为31.5%ʃ2.3%,幼根短小、子叶展开困难.所有材料在未处理的1/2MS 培养基萌发率为95.3%ʃ2.5%.2.6.2盐胁迫下转基因拟南芥具有更高的活性氧清除酶活从Fig.7A 可知,SOD 酶活性,在WT 中,随着NaCl 浓度的增大,呈先升后降趋势.尽管转SVP 1.1s 株系间的SOD 酶活差别较大,但随着NaCl 浓度的增大,有较大的诱导;比较两个同源基因SVP 1.1和SVP 1.2株系,SVP 1.1转基因株系随着盐浓度的增大,酶活上升;SVP 1.2株系在高盐浓度下稍有下降.胁迫条件下,转基因株系的最高酶活是其自身对照的6 7倍,是野生型对照的4 5倍.随着NaCl 浓度的增大,转S VP 1.1s 拟南芥中的POD 酶活性(Fig.7B )高于对照WT ,且转SVP 1.1株系的酶活在两种盐胁迫条件下均高于转SVP 1.2914中国生物化学与分子生物学报第31卷植株.随着NaCl浓度的增大,所有植株中CAT活性均呈上升趋势,但VP1.1OE植株的CAT的活性比WT和VP1.2OE植株的活性的增长量大(Fig.7C).总体来说,OE植株中抗氧化酶活上升幅度一般高于野生型,说明两个SVP1都能提高盐胁迫条件下拟南芥的抗氧化能力.比较两个同源SVP1基因,SVP1.1转基因植株维持了更高的胞内SOD、POD和CAT活性,因此,可以更有效的清除氧自由基.2.6.3盐胁迫下转SVP1.1基因的拟南芥的膜质氧化程度相对较轻所有检测的材料均显示,随着NaCl浓度的增大,MDA含量呈不断上升趋势.在高盐胁迫下,WT和转SVP1.2OE植株叶中的MDA含量比SVP1.1OE植株高(Fig.7D),说明转SVP1.1 OE植株膜质的过氧化程度较低.3讨论本研究通过对两个SVP1基因在不同组织中表达模式的分析表明,它们在所有检测的器官中均有表达,但在树皮(主要为韧皮部)中的表达最高(Fig.2),可能与木本植物需要较为强大的动力将叶片光合作用的产物运输到根部有关[9].Gaxiola 等[9]综合植物中对VP1的研究结果,对位于不同部位的VP1酶的功能提出了如下假设:在叶肉细胞中,位于液泡膜中的VP1主要水解代谢副产物PPi (焦磷酸),促进光合作用;在筛管细胞中,其主要功能是PPi合成酶,促进蔗糖运输到根部.关于VP1作为PPi合成酶尚需要进一步的实验验证,我们的工作为揭示VP1在微管组织中发挥的功能奠定了基础,我们将会从细胞学、生理学的角度进一步揭示其在柳树中发挥的功能.同一基因家族的不同成员在植物中可能有功能冗余、或不同的成员的生物学功能、生化功能发生变化是在植物中较为普遍的现象[11-12,23-24].在本研究中,通过转录水平以及两个基因的拟南芥OE植株揭示以下2种可能:1).SVP1.2在体内发挥的功能可能与营养有关,在需能、需要营养物质较多的组织中,SVP1.2发挥更主要的功能.Fig.2显示,SVP1.2在新生枝条和韧皮部组织中的表达更高;2)SVP1s 编码的蛋白质可能活性不尽相同.本研究发现:SVP1.1OE株系的耐盐表现高于SVP1.2OE株系,其可能的原因是两个基因的OE株系表达水平不尽相同外(Fig.6),也可能存在生化活性的差异.SVP1.1和SVP1.2的一级氨基酸序列的相似性高达81.21%,在焦磷酸(PPi)和两个酸性化基序(acidic motif)(DX3DX3D)完全一致.在5个参与形成氢键的氨基酸残基中,SVP1.1发生了较为保守的R(精氨酸残基)到K(赖氨酸残基)变化外,其余4个残基完全一致.从其三维结构看,主要是N端的无规卷曲不能重合[19].拟南芥AVP1中,E229D (谷氨酸到天冬氨酸)的突变提高了AVP1水解焦磷酸和质子转移功能[23],两个SVP1s是否存在生化活性的差异尚需进一步的验证.比较已经测序的植物基因组的VP1基因,发现多种植物中的VP1存在多个成员(www.phytozome.net),如杨树中具有4个VP1基因,禾本科植物玉米(Zea mays)中至少有8个成员、水稻(Oryza sativa)中有6个成员[12].同一物种中,不同的VP1同源蛋白(同工酶)生化活性的分化,尚未见相关的研究报道,我们后续的研究将进一步揭示柳树(或其它植物)中,VP1基因成员的功能分化.通过本研究表明,将柳树中两个SVP1s基因转入拟南芥中,提高了拟南芥在盐胁迫条件下的萌发率,能够更好诱导活性氧清除相关的酶活,提高植物的抗氧化能力,在一定程度上降低了胁迫条件下植物的膜脂氧化程度.到目前为止,针对草本植物VP1的研究相对较多,如在苜蓿(alfalfa)、大麦[24,25]中表达拟南芥中的AVP1能显著提高植物耐盐和干旱胁迫的能力.木本多年生植物中VP1基因的报道相对较少,结合我们以及Dong等[26]的研究结果,木本多年生植物中的VP1基因与其在草本植物中的同源基因具有类似的功能,本研究丰富了对木本植物中有关VP1基因功能的认识,为研究VP1基因在微管组织较为丰富的植物中发挥的功能奠定了基础,同时为提高植物的耐盐性提供了基因资源.参考文献(References)[1]涂忠虞主编.柳树育种与栽培[M].南京:江苏科学技术出版社(Tu Zhong-Yu ed.Breeding and Cultivation of Willow[M].Nanjing:Jiangsu Science and 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盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展

盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展

盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展一、本文概述盐胁迫,作为一种常见的非生物胁迫,对植物的生长和发育具有显著影响。

在盐碱地等极端环境中,植物常常面临高盐浓度的挑战,这对其生理代谢和生存策略提出了严峻的要求。

为了适应这种环境压力,植物发展出了一系列的盐适应性机制。

本文旨在综述盐胁迫对植物的影响,包括生长抑制、光合作用降低、离子平衡失调等方面,并深入探讨植物在盐胁迫下的适应性研究进展,包括离子转运、渗透调节、抗氧化防御等多个方面。

通过对这些适应性机制的研究,我们不仅可以更好地理解植物如何应对盐胁迫,而且可以为植物耐盐性的遗传改良和盐碱地的生态恢复提供理论支持和技术指导。

二、盐胁迫对植物生理生态的影响盐胁迫是指土壤中含盐量过高,对植物的生长和发育造成不良影响的环境压力。

盐胁迫对植物的影响表现在多个层面,涉及生理、生态、形态和分子等多个方面。

在生理层面,盐胁迫首先影响植物的水分平衡。

由于土壤中的高盐浓度,植物吸水变得困难,导致细胞内外的渗透压失衡,进而引发细胞脱水和生理功能紊乱。

盐胁迫还会破坏植物的光合作用系统,降低叶绿素的含量和光合效率,从而影响植物的光能利用和有机物的合成。

在生态层面,盐胁迫导致植物群落的结构和组成发生变化。

盐胁迫下,一些耐盐性强的植物种类或品种可能获得竞争优势,而一些对盐敏感的植物则可能因无法适应而死亡或生长受阻。

这种植物群落的演替过程可能导致生物多样性的降低,影响生态系统的稳定性和功能。

在形态层面,盐胁迫会导致植物出现一系列适应性的形态变化。

例如,耐盐植物往往具有较厚的叶片和茎秆,以减少水分蒸发和盐分积累;根系也更加发达,以增加对水分和养分的吸收面积。

一些植物还会通过减少地上部分的生物量分配,增加地下部分的生物量分配来适应盐胁迫环境。

在分子层面,盐胁迫会引发植物体内一系列的生理生化反应和基因表达变化。

例如,植物会通过调节渗透调节物质的合成和积累来维持细胞内外渗透压的平衡;一些与盐胁迫相关的基因也会被诱导表达,编码耐盐相关的蛋白质或酶类,以增强植物的耐盐能力。

基因芯片技术在植物中的应用研究进展

基因芯片技术在植物中的应用研究进展
收利用。目前,基因芯片技术已在拟南芥、水稻、玉米和小
芯片上的生物分子间杂交反应是芯片检测关键的一步。 选择最佳反应条件,以减少生物分子间的错配率,从而获得 最能反映生物本质的信号。影响杂交双链形成的因素包括靶 标浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度等。
3.4信号检测与结果分析
荧光标记检测法常用的扫描仪有激光共聚扫描仪和 电荷偶联装置扫描仪。电荷偶联装置扫描仪扫描速度快、 不需要移动X—Y二维平台,而且价格便宜,但其灵敏度较 低。激光共聚扫描仪具有快速传输高质量图象与数据的 特性,且灵敏度高,是较理想的检测工具。 4基因芯片技术在植物中的应用
136
广东农业科学2013年第8期
基因芯片技术在植物中的应用研究进展
刘思言1,沈铖武2,王丕武3
(1.吉林农业大学生命科学学院,吉林长春 吉林长春 130118;2.中国科学院长春光学精密机械与物理研究所, 130033;3.吉林农业大学农学院,吉林长春130118)
摘要:基因芯片又称DNA芯片或生物芯片,是以预先设计好的方式将大量的生物信息密码固定在固相载体上组成的密集 分子阵列,基因芯片的原型是20世纪80年代中期提出的,是随着人类基因组计划的进展而发展起来的具有广阔应用前景的生物 技术之一。简述了基因芯片技术的定义、原理、分类、基因芯片的制作流程以及基因芯片技术在植物研究中各个方面的应用,并对 未来的发展前景进行了展望。 关键词:基因芯片:植物;应用 中图分类号:Q3 文献标识码:A 文章编号:1004—874X(2013)08—0136—03
Research progress of gene chip technology in plants
LIU Si—yanl.SHEN
Cheng-wu2,WANG

基因芯片技术是什么?一文读懂基因芯片!

基因芯片技术是什么?一文读懂基因芯片!

基因芯片技术是什么?一文读懂基因芯片!基因芯片技术是生物芯片的一种,它是生命科学领域里兴起的一项高新技术,它集成了微电子制造技术、激光扫描技术、分子生物学、物理和化学等先进技术。

生物芯片生物芯片是指将成千上万的靶分子(比如DNA、RNA或蛋白质等)经过一定的方法有序地固化在面积较小的支持物(如玻璃片、硅片、尼龙膜等)上,组成密集分子排列,然后将已经标记的样品与支持物上的靶分子进行杂交,经洗脱、激光扫描后,运用计算机将所得的信号进行自动化分析。

这种方法不仅节约了试剂与样品,而且节省了大量的人力、物力与时间,使检测更为快速、准确、敏感,是目前生物检测中效率高、最为敏感和最具前途的技术。

根据在支持物上所固定的靶分子的种类可将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片和芯片实验室等。

目前,技术比较成熟、应用最广泛的是基因芯片技术,其在基因组的表达分析、药物筛选、模拟生物的基因表达及功能研究、遗传疾病基因诊断、病原微生物的诊断等方面都有广泛的应用,是一种高效、大规模获取相关生物信息的重要手段。

基因芯片基因芯片也称DNA微阵列,是生物芯片的一种。

基因芯片原理最初是由核酸的分子杂交衍生而来的,即应用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测DNA芯片技术,实际上就是一种大规模集成的固相杂交。

是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交。

通过计算机对杂交信号的检测分析,得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。

由于常计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为DNA芯片。

基因芯片采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地固定于与光电测量。

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化【摘要】柽柳(Salix matsudana)是重要的园林树种,其cpSSR标记对遗传研究和种质资源保护具有重要意义。

本研究通过选择设计柽柳cpSSR标记,建立了PCR反应体系,并优化了引物浓度和温度循环条件,缩短了PCR扩增时间。

优化后的PCR反应体系在扩增效果和稳定性上表现出明显改善,为柽柳遗传标记的应用奠定了基础。

未来,可以利用优化的体系深入研究柽柳的遗传多样性和种间杂交问题,为柽柳品种改良和保护提供更多的参考数据。

该研究为我国柽柳资源的保护与利用提供了重要的理论和技术支撑。

【关键词】柽柳cpSSR、PCR反应体系、引物浓度、温度循环条件、PCR扩增时间、优化、评价、后续研究。

1. 引言1.1 研究背景柽柳(Salix matsudana)是一种重要的园林树种,具有较强的耐寒、抗旱和适应性,被广泛应用于城市绿化、防风固沙等领域。

柽柳的遗传研究相对较少,尤其是针对其基因组水平的研究还比较欠缺。

对柽柳的基因组特征进行深入研究,有利于揭示其遗传背景、种质资源优化利用以及遗传改良。

建立柽柳cpSSR的PCR反应体系,并对其进行优化,对于进一步深入研究柽柳的遗传变异、种质资源保护和利用具有重要意义。

本研究旨在选择合适的柽柳cpSSR标记,建立稳定、高效的PCR反应体系,并对PCR反应条件进行优化,为后续柽柳遗传研究和育种工作提供技术支持和理论指导。

1.2 研究意义柽柳(Salix matsudana Koidz.)是一种常见的树种,具有较强的适应性和生长力,被广泛用于环境修复和园林绿化。

柽柳的基因资源研究对其遗传育种和进化研究具有重要意义。

而柽柳cpSSR(cpDNA simple sequence repeat)是一种重要的分子标记,在遗传多样性分析、种质资源评价和亲缘关系研究中发挥着重要作用。

2. 正文2.1 柽柳cpSSR的选择与设计柽柳(Salix matsudana) 是一种常见的柳树植物,具有较高的生长速度和适应性,常被用于环境修复和园林绿化。

干旱与NaHCO3胁迫下柽柳基因表达的比较

干旱与NaHCO3胁迫下柽柳基因表达的比较
C mp r o fGe eEx rsini a r a d os wiu d rIru h n HCO S rse/ ioin a g C u n o ai n o n p eso T ma / n rso i n e >o g ta d Na s n tess Qi at ,Y n h a - x a
维普资讯
第3卷 第2 6 期
20 0 8年 2月

Hale Waihona Puke 北林业大



V0. 6 No. 13 2 F b.20 e o8
J RNAL OF N OU ORT HEA T F RE TR UNI ERS T S O S Y V IY
D g Wag uhn ( e aoa r o o s Te eecBed gadBo enl yo iir o E uao ,Nr es i . n ceg K yLbrty fFr t reG nt r i n i eho g M n t d ct n ot at n Y o e i en t o f syf i h F r t nvr t, abn104 P C i )/ora o o ha o s yU vrt. 2O , ( ) 一 — o syU i sy H ri 00. 、R h a/ Junl N r es Fr t n e i 一 O83 2 、 1 4 er ei 5 n f t t e r i sy 6
Th fe e c so e e e p e so n T e di r n e fg n x r s in i amarx a drso iun e r u h nd Na i n o s wi d rd o g ta HCO sr s e r n e tg td usng te s swe e iv siae i c DNA c o ray mir a r . an r so is e ln swe e te td wih Na d o s wi e d i g r r ae t HCO s lto rd o g tsrs e o u s.r s ec ou in o r u h —te s d f r48 ho r ep —

NaCl胁迫下3种柽柳属植物生长、盐离子分布和SOS1基因相对表达量的比较

NaCl胁迫下3种柽柳属植物生长、盐离子分布和SOS1基因相对表达量的比较
关键词: 柽柳属; NaCl 胁迫; 耐盐机制; 生长; 盐离子分布; SOS1 基因
中图分类号: Q948������ 113; Q786 文献标志码: A 文章编号: 1674-7895(2019)01-0001-09 DOI: 10.3969 / j.issn.1674-7895.2019.01.01
植物资源与环境学报, 2019, 28(1) : 1-9
Journal of Plant Resources and Environment
NaCl 胁迫下 3 种柽柳属植物生长、 盐离子分布和 SOS1 基因相对表达量的比较
刘咏梅1,①, 程 聪1,①, 姜 黎2, 於丙军1,②
(1. 南京农业大学生命科学学院, 江苏 南京 210095; 2. 中国科学院新疆生态与地理研究所, 新疆 乌鲁木齐 830011)
收稿日期: 2018-08-11 基金项目: 国家自然科学基金联合项目( U1603111) ; 江苏省研究生科研与实践创新计划项目( KYCX18_0746) 作者简介: 刘咏梅(1994生理方面研究。
Comparisons on growth, salt ion distribution, and relative expression of SOS1 gene in three species of Tamarix Linn. under NaCl stress LIU Yongmei1,①, CHENG Cong1,①, JIANG Li2, YU Bingjun1,② ( 1. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China) , J. Plant Resour. & Environ., 2019, 28(1) : 1-9

工业大麻miR156基因家族在NaHCO3胁迫下的表达模式及生物信息学分析

工业大麻miR156基因家族在NaHCO3胁迫下的表达模式及生物信息学分析
曹焜ꎬ孙宇峰ꎬ张晓艳ꎬ赵越ꎬ边境ꎬ朱浩ꎬ王盼ꎬ韩承伟ꎬ孙凯旋ꎬ王晓楠 ∗
( 黑龙江省科学院大庆分院ꎬ黑龙江 大庆 163319)
摘 要:工业大麻 miR156 基因家族在碱性盐胁迫响应过程中发挥重要的调控作用ꎬ为探究工
业大麻 miR156 基因家族响应 NaHCO 3 胁迫的分子机制ꎬ以盐碱耐受型工业大麻品种火麻一号为供
达模式仍有待进一步探究ꎮ
以上研究报道了 miRNA156 对植物盐碱耐受性的调控作用ꎬ但对其分子调控机制研究尚不深
入ꎮ 尤其是在工业大麻中ꎬ miRNA156 如何感知外界胁迫信号ꎬ 并 通 过 调 控 下 游 相 关 基 因 响 应
NaHCO 3 胁迫的分子机制研究鲜有报道ꎮ 为此ꎬ本研究采用生物信息学和 qRT - PCR 方法ꎬ对工业
似ꎬ花椒、烟草、刺头朝鲜蓟、大豆的 miR156 成熟体序列非常保守ꎬ而工业大麻 miR156 与其他植物
进化关系分析ꎬ使用 miRDeep2 软件预测新 miRNA 的前体序列和结构ꎬ采用 WebLogo 3 ( http: / /
weblogo.threeplusone.com / ) 绘制 miR156 家族序列保守性 Logo 图ꎮ
1.2.2 工业大麻 miRNA156 成熟体 qRT -PCR
2 结果与分析
利用软件 miRDeep2 对 novel_miR_75 和 novel_miR_179 的候选前体序列进行预测ꎬ红色为成熟
序列ꎬ黄色为环状结构ꎬ紫色为 star 序列( 图 1( A) ) ꎬ前体序列均可形成较为稳定的二级茎环结构ꎬ
且成熟体产生于前体的 5’ 端上臂ꎬ保守性较强ꎮ 从图 1( B 中可以看出ꎬ成熟序列相同或高度相
胁迫过程中的调控作用ꎬ并未针对某个特定的 miRNA 展开研究ꎮ

多枝柽柳叶片响应NaCl胁迫的转录组分析

多枝柽柳叶片响应NaCl胁迫的转录组分析

多枝柽柳叶片响应NaCl胁迫的转录组分析作者:陈亚辉张师瑒杨庆山宋志忠姜姜来源:《江苏农业学报》2022年第05期收稿日期:2022-01-20基金項目:山东省农业良种工程项目(2019LZGC009);国家自然科学基金面上项目(32071612);国家留学基金委项目(202108320311)作者简介:陈亚辉(1990-),男,江苏泰州人,博士,助理研究员,研究方向为生态修复。

(E-mail)*******************通讯作者:姜姜,(E-mail)**********************摘要:在转录组层面解析盐生植物多枝柽柳响应盐胁迫的分子机制,为进一步挖掘耐盐关键基因提供参考。

用200 mmol/L NaCl处理多枝柽柳0 h、48 h、168 h后,采集叶片进行转录组测序,分析差异表达基因(DEGs)并进行qRT-PCR验证。

转录组测序原始数据拼接出Unigenes 105 702个,同时在KEGG、KOG、NR和SwissProt 4大功能数据库中检索到注释的Unigenes为27 670个。

NaCl胁迫处理48 h后,多枝柽柳叶片中6 374个基因的表达水平上调,5 380个基因的表达水平下调;NaCl胁迫处理168 h后,叶片中有3 837个基因的表达水平上调,7 808个基因的表达水平下调。

根据注释到KEGG 通路中的DEGs,筛选获得8个表达差异极其显著的DEGs,主要编码WRKY和bZIP家族转录因子。

此外,由KEGG通路分析可知,MAPK信号转导途径可能参与多枝柽柳生长发育及其对NaCl胁迫的应答反应。

本研究通过测定和解析在高盐胁迫下多枝柽柳叶片转录组信息,揭示了盐胁迫激活MAPK信号转导途径以及WRKY、MYB和bZIP等转录因子参与耐盐调控过程,为进一步研究多枝柽柳耐盐分子机制奠定了基础。

关键词:多枝柽柳;NaCl胁迫;转录组测序;转录因子;MAPK信号传导途径中图分类号: Q753 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2022)05-1188-15Transcriptome analysis of Tamarix ramosissima leaves in response to NaCl stressCHEN Ya-hui1, ZHANG Shi-yang2, YANG Qing-shan3, SONG Zhi-zhong4, JIANG Jiang1(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Faculty of Science, University of British Columbia, Vancouver V6T 1Z4, Canada;3.Saline-alkali Afforestation Experimental Station, Shandong Academy of Forestry Sciences, Jinan 250000,China;4.The Engineering Research Institute of Agriculture and Forestry, Ludong University,Yantai 264039, China)Abstract: To uncover the molecular mechanism of halophyte Tamarix ramosissima (T. ramosissima) in response to salt stress was analyzed at the transcriptome level to provide references for further exploration of key salt-tolerant genes. T. ramosissima plants were treated with 200 mmol/L NaCl for 0 h, 48 h and 168 h, respectively, and the leaves were collected for transcriptome sequencing. The differentially expressed genes (DEGs) were excavated and further verified by qRT-PCR. In total, 105 702 unigenes were spliced from the raw data of transcriptome sequencing,of which 27 670 were retrieved from KEGG, KOG, NR and SwissProt. After 48 hours of NaCl stress treatment, the expression levels of 6 374 genes in T. ramosissima leaves were up-regulated and 5 380 genes were down-regulated. After 168 hours of NaCl stress treatment, the expressionlevels of 3 837 genes were up-regulated and 7 808 genes were down-regulated. According to the DEGs annotated to the KEGG pathway, eight highly differentially expressed DEGs were obtained,which mainly encoded transcription factors such as WRKY and bZIP families. In addition, the analysis of KEGG pathway showed that MAPK signal transduction pathway may be involved in the growth and development of T. ramosissima and its response to NaCl stress. This research article aims to measure and analyze the transcriptome information of T. ramosissima under high salinity stress conditions. This article also reveals that the salt stress activates the MAPK signal transduction pathway and WRKY, MYB, bZIP and other possible transcription factors involved in the salt tolerance regulation process. This research builds a foundation for future research on transcriptome information of T. ramosissima.Key words: Tamarix ramosissima;NaCl stress;transcriptome sequencing;transcription factor;MAPK signal transduction pathway盐渍土在全球分布广泛,其土壤中盐分含量高,土壤理化性质差,严重危害植物的生长发育[1-3]。

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化

柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化【摘要】柽柳(cpSSR)是一种常用的分子标记工具,用于遗传多样性研究和种质资源鉴定。

本研究旨在建立和优化柽柳cpSSR-PCR反应体系,以提高PCR反应效率和准确性。

首先通过引物设计,选择合适的引物序列,然后优化反应条件,包括浓度、温度和时间等。

最后应用温度梯度PCR技术,快速筛选出最适合的反应条件。

本研究的意义在于为柽柳遗传研究提供了可靠的实验方法,为遗传资源利用和品种改良提供了重要支持。

展望未来,可以进一步探究cpSSR在其他植物物种的应用,并不断完善PCR反应体系的建立和优化方法。

通过本研究的实施,将推动柽柳遗传研究的进一步发展,促进植物种质资源的保护与利用。

【关键词】柽柳,cpSSR,PCR反应体系,引物设计,反应条件优化,温度梯度PCR,重要性,展望,研究方向,总结。

1. 引言1.1 研究背景柽柳(Salix purpurea)是一种重要的草本植物,具有重要的生态和经济价值。

柽柳在生态恢复、河岸防护、固沙等方面具有重要作用,因此对柽柳的研究日益引起人们的关注。

目前对柽柳的遗传研究还比较薄弱,尤其是缺乏足够的分子标记信息。

SSR(Simple Sequence Repeat)是一种重要的分子标记技术,具有很高的遗传多样性和稳定性。

而cpSSR(cpDNA-based SSR)是基于叶绿体DNA的SSR标记,不受核基因亲缘效应的影响,具有更高的适用性。

建立柽柳的cpSSR标记技术,对于深入了解柽柳的遗传多样性、进化关系以及种质资源的保护和利用具有重要意义。

目前尚未报道关于柽柳cpSSR标记的研究,缺乏相关的信息。

本研究旨在建立柽柳cpSSR—PCR反应体系,并对其进行优化,为后续的柽柳遗传研究奠定基础。

通过引入cpSSR技术,将为柽柳的种质资源研究提供新的手段,推动柽柳的遗传研究和资源利用。

1.2 研究目的研究目的是为了建立和优化柽柳cpSSR-PCR反应体系,以提高柽柳遗传多样性研究的效率和准确度。

基因芯片研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响

基因芯片研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响

基因芯片研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响祁冰;侯丽辉;吴效科;杨琳;宋家欣【期刊名称】《科技导报》【年(卷),期】2008(26)23【摘要】应用基因芯片技术研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达谱的影响。

方法采用胰岛素信号转导通路调节糖代谢的关键分子——PI-3K的特异性阻断剂沃漫青霉素作用于猪卵巢颗粒细胞,人工诱导胰岛素抵抗(IR)的细胞模型;同时应用小檗碱作用在细胞模型上,作用48h后提取细胞总RNA,应用猪全基因组单通道芯片对样本基因进行筛查,得出差异表达基因数据并进行分析。

结果显示,中药小檗碱作用模型细胞后差异表达基因42个。

差异表达基因主要涉及的功能有:物质代谢、炎症与免疫反应、信号转导等。

由此可得出结论:小檗碱可通过多种途径在基因水平上对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞起作用。

【总页数】4页(P70-73)【关键词】小檗碱;胰岛素抵抗;基因芯片;卵巢颗粒细胞【作者】祁冰;侯丽辉;吴效科;杨琳;宋家欣【作者单位】黑龙江中医药大学附属第一医院【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R711.75【相关文献】1.苍附苁仙汤对多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞胰岛素样生长因子-1受体基因表达的影响 [J], 梁莹;杜惠兰;穆玉霞2.小檗碱和葛根素对卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的调控 [J], 姚晶萍;邱学敏;高磊;吴效科;侯丽辉;倪延群3.小檗碱、隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞凋亡相关基因的影响 [J], 杨琳;祁冰;宋家欣;侯丽辉;吴效科4.基因芯片研究隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响 [J], 祁冰;宋家欣;杨琳;吴效科;侯丽辉5.小檗碱改善多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗大鼠子宫组织局部胰岛素抵抗的作用机制研究 [J], 李慕白;王婷婷;张多加;吴效科;张明明因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

基因芯片技术及其产前应用进展

基因芯片技术及其产前应用进展

基因芯片技术及其产前应用进展刘婷婷(综述);徐红兵(审校)【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2014(30)14【摘要】芯片是在固体基质上的二维阵列,通过高通量、小型化、多通道、平行处理的实验方法检测生物物质的一种技术。

1983年,芯片的概念首次被提出。

目前的芯片种类包括:DNA芯片、蛋白芯片、肽芯片、组织芯片、细胞芯片、化学物质芯片、抗体芯片、糖芯片、表型芯片及反向蛋白芯片等[1]。

其中基因芯片工业化始于1995年,由斯坦福大学的Ron Davis和Pat Brown实验室研发,随后成立的公司有Affymetrix,Agilent,Arrayit,Illumina等。

目前DNA 芯片已经被广泛使用,蛋白、肽、糖芯片作为芯片的延伸。

目前基因芯片广泛运用于各个领域,在医学领域的发展尤其迅猛,在疾病的病因学、产前诊断、产后诊断等方面发挥了不同于其他检测方法的优势。

本文将对基因芯片技术及其在产前诊断中的潜在应用价值作一综述,以加深临床工作者对其认识和了解,从而有助于作出适当的临床决策。

【总页数】3页(P2133-2135)【作者】刘婷婷(综述);徐红兵(审校)【作者单位】重庆医科大学附属第一医院产科,重庆400042;重庆医科大学附属第一医院产科,重庆400042【正文语种】中文【相关文献】1.基因芯片技术在筛选肝癌差异表达基因研究中的应用进展 [J], 郭银燕;赵伟;文剑2.基因芯片技术在产前诊断中的应用 [J], 邢娅;孙路明3.基于染色体核型分析及单核苷酸多态性基因芯片技术的脐静脉血产前诊断分析[J], 王立芳; 龙喜贵4.耳聋基因芯片技术在产前筛查中的临床应用 [J], 刘然;吉彤珍;高阳5.基因芯片技术在中药现代化研究中的应用进展 [J], 刘玉峰;许肈初;马海燕因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

利用基因芯片对疏叶骆驼刺幼根耐盐差异表达基因的研究的开题报告

利用基因芯片对疏叶骆驼刺幼根耐盐差异表达基因的研究的开题报告

利用基因芯片对疏叶骆驼刺幼根耐盐差异表达基因的研究的开题报告一、研究背景及意义疏叶骆驼刺属于荒漠环境下生长的植物,具有耐高温、耐旱、耐盐等特性,在荒漠生态系统中有重要的生态意义。

然而,由于全球气候变化和人类活动的影响,荒漠化程度不断加深,使得疏叶骆驼刺等荒漠植物的生存环境受到影响,产生较大的威胁。

因此,探索疏叶骆驼刺耐盐机制和分子调控机制,为环境修复和植物资源的保护与利用提供理论和实践基础。

基因芯片技术是一种高通量检测技术,能够检测出数万个基因的表达情况,可以用于分析不同环境下的差异表达基因,从而揭示出调节生物生长发育、应对环境胁迫等生物学过程的相关分子机制。

因此,利用基因芯片技术对疏叶骆驼刺幼根进行耐盐条件下的差异表达基因分析,有望揭示疏叶骆驼刺耐盐机制的分子调控过程,并为研究荒漠植物的适应性机制提供深入的理论依据。

二、研究内容及方法1. 研究内容本研究旨在利用基因芯片技术对疏叶骆驼刺在不同盐胁迫条件下的幼根进行差异表达基因分析,挖掘疏叶骆驼刺响应盐胁迫的分子机制,为研究疏叶骆驼刺的耐盐机制提供深入的理论依据。

2. 研究方法(1)实验材料:疏叶骆驼刺种子,NaCl溶液。

(2)实验设计:将疏叶骆驼刺种子播种于含不同浓度NaCl溶液的培养基中,分别培养一定时间后采集疏叶骆驼刺幼根进行基因芯片分析。

(3)总RNA提取:采用Trizol试剂从采集的疏叶骆驼刺幼根中提取总RNA,并通过Agilent 2100生化分析仪检测RNA完整性和纯度。

(4)cDNA合成:采用SuperScript III First-Strand Synthesis System进行cDNA合成。

(5)基因芯片分析:采用Affymetrix GeneChip进行基因芯片分析,分析疏叶骆驼刺在不同盐胁迫条件下的差异表达基因。

利用实时荧光定量PCR技术对基因芯片分析结果进行验证。

三、预期成果与结论本研究将利用基因芯片技术对疏叶骆驼刺在不同盐胁迫条件下的幼根进行差异表达基因分析,分析疏叶骆驼刺在响应盐胁迫时的分子机制和相关途径。

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