word 做质粒图全过程
质粒绘图的专业软件——Winplas 使用说明
质粒绘图的专业软件——Winplas 2.7使用说明作者：佚名来源：生物秀时间：2008-6-27实验仪器大全实验试剂大全Winplas作为一个质粒绘图的专业软件，功能强大，而且极易上手，它可以绘制出具有发表质量的质粒图谱。
可广范应用于论文、教程的质粒插图，它的特性包括：1，无论是否知道质粒的原始序列都能绘制质粒图，像Vector NTI等综合软件也能绘制质粒图，但有一个前提就是首先得知道质粒得原始序列；2，可读入各种流行得序列格式文件，能方便地导入各种序列信息；3，可自动在识别序列中的限制性酶切位点；4，可对序列进行各种编辑，如：从文件插入序列、置换序列、序列编辑、部分序列删除等5，绘图功能强大，如：位点标签、任意位置文字插入、生成彩图、线性或环形质粒图谱，可输出到剪贴板或图像文件。
软件下载地址：/Soft/2008/2571.htm一，在不知道序列结构时绘制质粒图：1，点击File菜单中地New命令，出现一个MapView窗口，同时工具栏中地绘图命令显亮。
2，点击“Insert”菜单中的“Blank Seqment”命令，出现一个“Create New Plasmid”对话框。
－在Title栏中填入质粒名称，如pUC18。
－在Base Pairs栏中填入质粒大小，如3000。
－在Type单选框中设制质粒图谱为线型还是环形。
3，点击OK后，在Map View窗口就会出现一个圆环，其中有质粒名称及质粒大小。
4，下面的工作就是向圆环上添加文字描述、标记及弧。
①点击“Insert”菜单中的“Text”命令，或直接点击工具栏中的“Text”按纽，出现“Edit Text object”对话框。
－在“Text”书签中填入“Text”的内容，如：This is PUB 18’s map，选择左右对齐及居中。
－选定相应字符可以加黒、斜体等。
－在Font书签中改变字体格式、大小及颜色。
－文字就出现在Map View窗口中，使用鼠标左健，就可以随意拖动其位置。
质粒目的基因插入及引物设计流程
在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1
在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：
寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）
选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，
则说明CDS序列稳定可用；
将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点
三.克隆引物设计
2量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个， 因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。
5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，
01
但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG
02
最后可得Forward primer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag
03
tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
目的基因的20个碱基
3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向
最后要把引物顺序调整过来，点击“5→3”既得Reverse primer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取
word绘制质粒构建图（附详细说明）
word 做质粒图方法附说明：（比绘图软件更加简单且打印效果更为清晰）由于网上原有w ord制图方法表达简练，特加入具体讲解，图片过程依然弄不懂的同学可参考文字部分绘图工具栏——自选图形——基本图形——选择“弧形”——按住shif t以保证画出正圆弧画出的圆弧尽量超过圆周长的3/4，这样有利于圆弧重叠，以保证后面的圆弧片段准确覆盖到下面的圆上。
调节圆弧的长度方法：选中图形后按住s hift键，拖拽两端黄点拉伸或缩短弧形。
复制多个已绘制好的圆弧，新复制的圆弧可能会覆盖到原来的圆上，拖拽拉开即可。
注意在后续操作过程中不要随意改变圆弧大小，因此在复制圆弧前尽量需将圆整体调至后期编辑的最佳大小，方法：选中图形，按shift键，拉白色点调整图形大小。
将复制好的圆弧拉到另一个同样的圆弧上，直至两图形完全重叠，调整上面圆弧的长度（方法同上），双击后弹出该弧形的属性设置，可根据需要设置该圆弧片段的颜色、宽度和箭头方向。
下面作为质粒圆环的弧形最好提前将两端点拉至封闭形成一个圆。
如上述方法重复做几个弧形元件至最下面的圆上。
插入文本框、直线、箭头及标注进行说明。
文本框：“插入”菜单——文本框；直线、箭头：“绘图”工具栏——直线/箭头；标注：“绘图”工具栏——自选图形——标注双击插入的文本框及标注，在其属性选项中修改为填充色“无”，线条颜色“无”。
最后，很重要！由于我们使用w ord制作出来的图图是由各种元素堆积起来的，因此在后期写文章及更改格式的过程中很容易将这些元素搞乱掉，因此在制作好一张图后一定要记得将图的各种元素固定到一起，使用word中的“组合”选项。
方法：按住shif t键，将图上所有元素依次选中，不管是圆弧、文本框还是线段箭头注释都不要放过，然后在选中的内容上点右键，在弹出菜单中选择“组合”。
质粒构建从入门到精通
质粒构建从入门到精通今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记。
质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。
经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。
质粒构建流程示意图质粒构建的步骤「快递」目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼01PCR 扩增「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
PCR 的最大特点是能将微量的DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
PCR 扩增简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
Tips▼扩增过程中的关键点▼QPCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
答案点击下方空白处获得答案A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。
此外引物设计的好坏是关键。
除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。
常规引物设计原则1.引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2.引物 Tm 值最好在60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过5°C。
3.GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4.引物自身不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5.引物之间不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6.3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
质粒的制备
原理示意图
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二） 材料
• 含质粒的E. coli DH5a, JM109, Top10 菌株
（三） 试剂
• 1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调 节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭 菌20 分钟。 • LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
• 2. STE • 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 在1.034×105Pa高压灭菌20分钟。 • 3. SolutionⅠ-resuspension solution Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖—使大肠杆菌保持悬浮，不沉淀 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0)--抑制DNase的活性 高压灭菌后，4℃保存备用。 • 4. SolutionⅡ(现用现配制) –lysis solution Ⅱ 0.2mol/L NaOH –裂解细胞 1% SDS –蛋白变性
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
13. 质粒定量：取1-5µl DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转 入 分光光度计的石英比色杯中(or Nanodrop)，测定 OD260 及OD280，并计算OD260/ OD280比值和DNA浓度： DNA浓度 OD260×稀释倍数×50/1000 （ µg / µl ） 浓度= 稀释倍数× 浓度
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
质粒图谱阅读.pptx
*2-direction insertion
双向插入
*self-reconnection
自身环化
*no easy way of retrieving
the insert
重新筛选插入的片断困难
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A1 A
2 vector
B
2 A
vector 1
B
平齐末端连接时，插入的方向是 随机的，称为双向插入。会给后续 的工作造成很多麻烦。
原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异
性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌
落
。
方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，
若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所
编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可
与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该
抗体可携带酶或荧光，易于检测。
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完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的 表达。
当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物 共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5－溴 －4－氯－靛蓝，使得菌落呈现蓝色。
some cells (actually, very few) become
transformed: they acquire recombinant vector
Pseudo-positive
DNA.
positive
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第四节 重组子的筛选与鉴定
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质粒构建原理及步骤
质粒构建原理及步骤
质粒构建原理
质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
质粒构建方式
质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。
质粒载体制备
质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
步骤
01 PCR扩增
首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
其特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
简要步骤：利用引物设计软件如Primer 5 或NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微瞬离，放入PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
02 酶切连接
获得目标片段后，要交到载体中，必须借助两个工具来实现——酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶）。
简要步骤：配制琼脂糖凝胶（常用浓度 1-2%）后点样，切胶电泳
回收目的片段，选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割，酶切后的片段再次电泳回收，测定浓度后按比例加入T4 DNA 连接酶，粘性末端载体、目的片段、缓冲液，进行连接后直接转化。
质粒绘图及克隆流程图软件使用说明书
软件担保限制
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诺京公司保证，正如“软件”用户使用手册和光盘中所记录的，原购买商保存本软件的光盘在正 常使用条件下30天内（以收货凭证复印件时间为准）出现材料或质量上的问题，诺京公司将免费 提供更换。 无论任何情况下，诺京公司都不对丧失利益，丢失数据所造成的损害、其他附带性或后果性的损 害、其他使用“软件”中所出现的或“软件”无法使用的类似要求所造成的损害负责，即使诺京 公司已经向用户告知这些损害出现的可能性 软件将以现状被许可或发布。除上述产品质量担保外，诺京公司不承担任何明示或暗示的担保、 法律或其他规定的担保以及任何用于特殊用途的关于本“软件”和“软件”用户手册的律不允许排除或限制必然或偶然的损害赔偿责 任，因此上述限制可能不适用于您。
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目录
第一章 简介和安装....................................................................................................................... 6 1.1 NoeClone 独有新颖的特征................................................................................................ 6 1.2 注册你的 NoeClone 副本.................................................................................................. 6 1.3 技术支持................................................................................
质粒构建全过程
6 对载体进行切胶（110V，25-30min）回收后测浓度（nanodrop）
7 目的基因与载体的连接（一般20ul体系），16℃，1h（于PCR上保持）
8 对连接产物进行转化涂板（260rpm，转化42℃必须精准，全部涂板）
质粒构建全过程：
1 选择合适的模板进行PCR（一般50ul体系），P出目的基因
2 PCR产物进行回收（5ul用于跑胶鉴定（110V，25-30min），45ul用PCR产物回收试剂盒进行回收）
3 对回收后的PCR产物进行浓度测定（nanodrop）
4 同时对目的基因和载体进行酶切（37℃，3h，一般酶切1ug）
9 次日晚挑克隆，小试管摇过夜
10 对克隆出的菌液进行小抽
11 对小抽出的质粒进行酶切鉴定（一般酶切1ug质粒）
12 如有阳性结果，则送测序
13 测序正确后，可进行中扩增保存备用
质粒构建-protocol
一，引物设计:1,选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。
2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
1，使用word2，设计引物：primer-upPrimer-down3，核对----送公司合成。
4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4℃保存。
二，PCR（P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：12ul韩家淮实验室的菌液，相应的抗生素94℃ 5min菌液1ul 94℃ 30sec2x PFU mix 25ul 58℃ 30secPrimer 1ul 72℃ X min2d H2O 23ul 72℃ 5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：称的琼脂糖加入60ml的1X TAE加入的EB()25分钟后，即可点样跑胶。
（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。
（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。
对胶回收的产物跑胶验证。
可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。
三，酶切、链接：1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）insert ：上述胶回收产物35ul10 x H buffer（）7ul50ul的体系 dd H2O 6ul酶1 1ul酶2 1ul2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）Vector （1ug/ul）：2 ul10 x buffer（）3ul20ul的体系dd H2O 13ul酶1 1ul酶2 1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。
26 生物化学实验--重组质粒的提取及其限制性图谱的绘制
重组质粒的提取及其限制性图谱的绘制【目的】1 ．掌握碱裂解法分离、纯化质粒的理论和技术。
2 ．熟悉质粒 DNA 的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的技术。
【原理】1 ．质粒 DNA 的提取与鉴定原理细菌质粒是一类闭环双链的 DNA 分子，独立于细胞染色体之外，在细胞质中具有自主复制能力且可稳定遗传，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。
目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具—载体。
从大肠杆菌中提取质粒 DNA ，是一种分子生物学最基本的方法。
分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等，在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
分离质粒 DNA 的方法总体包括 3 个步骤：① 培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增；② 收集和裂解细菌；③ 分离和纯化质粒 DNA 。
本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。
其基本原理是在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后，使 DNA （包括质粒 DNA 和基因组 DNA ）释放出来。
在强碱条件下，DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液（ pH4.8 ）适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组 DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 复合物形式被高浓度盐沉淀。
质粒 DNA 留在上清，进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质，乙醇沉淀质粒 DNA ，低离子强度的 TE 缓冲液溶解后，加适量 RNase A 降解残留的 RNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种：① 共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在；② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③ 线性DNA 。
因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。
琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同，超螺旋＞线性＞开环。
质粒构建流程
质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000 Hl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200 Hl氯仿混合，震荡15$,室温孵育3min。
3）4℃, 12000rpm 离心 10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550 H1）5）加入1倍体积（550 H1） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃, 10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500 Hl去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50 Hl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃, 12000rpm 离心 60s13）点样：5Hl RNA+ 1 H l 10X14）-20℃保存2. RNA反转录试剂盒： TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10Hl体系）② 5XgDNA eraser buffer 2Hl① gDNA eraser 1HlTotal RNA 4Hl （可根据RNA浓度调整）⑥ RNase free water 3HlPCR仪中进行，程序：42℃, 2min f4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20Hl体系）④5XprimerScript buffer 2 4ul⑤primerScript RT enzyme mix I 1ul⑥RT primer mix 1ul⑦RNase free water 4ul1）反应液10 HlPCR 仪：37℃, 15min—85℃, 5s―4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中-20℃长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50 Hl体系如下：5XPS buffer 10Hl PCR程序：dNTP 4Hl 95℃5minHl 95℃30sHl 56℃30s , 35cyclecDNA 1 H l（可变）72℃1minR-primer 1Hl 72℃10minF-primer 1 H l 注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时点样：5Hl PCR 产物+ iHl 6X4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01①②转移至HiBind MicroElution DNA柱（套收集管），室温离心10000g, imin。
质粒电泳图说明
质粒电泳图说明最快的是超螺旋，其次是线性DNA，最慢的是开环DNA；其实我们提取质粒的时候常见的是两条带：超螺旋和开环DNA，但是个人觉得线性的DNA 也是存在的，只是量很少而已，因为质粒如果变成线性的话，其就不能进行正常复制，就会慢慢降解掉。
所以提取出来的量就会很少，但是我觉得是存在的。
用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。
（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。
判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。
因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。
根据我做实验的经验，回答你的问题1 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。
出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。
如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。
2 酶切将质粒线性化以后，才可以用mark判断大小。
如果有三种构像，可以用中间那条带与mark比较判断大小。
3 商品化的质粒我没有直接跑过电泳。
我估计应该大部分是超螺旋构像。
4 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小首先得搞清楚，你用得内切酶在质粒序列中（包括你克隆的基因）总共有几个位点？如果2个以上，出现上述结果就比较好解释了。
可以将酶切前后得质粒一起跑电泳，比较一下，酶切后得四条带与酶切前两条带得大小是否有差异。
部分酶切也是有可能的，原因是你的质粒量太大，酶没有作用完。
或者是酶活力不够/酶量太少。
质粒提取比较好的情况下，最前面得超螺旋构像较多。
假如提取质粒时，加溶液II以后，剧烈地振荡，你就会发现，在质粒电泳图中，开环构像比例很高，甚至会超过超螺旋构像的亮度，也就是说这种质粒质量很差。
word绘制质粒构建图(附详细说明)
word 做质粒图方法附说明：（比绘图软件更加简单且打印效果更为清晰）由于网上原有word制图方法表达简练，特加入具体讲解，图片过程依然弄不懂的同学可参考文字部分绘图工具栏——自选图形——基本图形——选择“弧形”——按住shift以保证画出正圆弧画出的圆弧尽量超过圆周长的3/4，这样有利于圆弧重叠，以保证后面的圆弧片段准确覆盖到下面的圆上。
调节圆弧的长度方法：选中图形后按住shift键，拖拽两端黄点拉伸或缩短弧形。
复制多个已绘制好的圆弧，新复制的圆弧可能会覆盖到原来的圆上，拖拽拉开即可。
注意在后续操作过程中不要随意改变圆弧大小，因此在复制圆弧前尽量需将圆整体调至后期编辑的最佳大小，方法：选中图形，按shift键，拉白色点调整图形大小。
将复制好的圆弧拉到另一个同样的圆弧上，直至两图形完全重叠，调整上面圆弧的长度（方法同上），双击后弹出该弧形的属性设置，可根据需要设置该圆弧片段的颜色、宽度和箭头方向。
下面作为质粒圆环的弧形最好提前将两端点拉至封闭形成一个圆。
如上述方法重复做几个弧形元件至最下面的圆上。
插入文本框、直线、箭头及标注进行说明。
文本框：“插入”菜单——文本框；直线、箭头：“绘图”工具栏——直线/箭头；标注：“绘图”工具栏——自选图形——标注双击插入的文本框及标注，在其属性选项中修改为填充色“无”，线条颜色“无”。
最后，很重要！由于我们使用word制作出来的图图是由各种元素堆积起来的，因此在后期写文章及更改格式的过程中很容易将这些元素搞乱掉，因此在制作好一张图后一定要记得将图的各种元素固定到一起，使用word中的“组合”选项。
方法：按住shift键，将图上所有元素依次选中，不管是圆弧、文本框还是线段箭头注释都不要放过，然后在选中的内容上点右键，在弹出菜单中选择“组合”。
注意有时候由于一张图上有的元素可能会重叠，无法将这些元素全部选中，此时可在已经选中的元件上右键，选择“叠放次序”——置于底层，接下来继续按住shift键选择压在下面的元件即可。
质粒DNA的分离与纯化t Word 文档
质粒DNA的分离与纯化吴乃虎（中国科学院遗传与发育研究所）黄美娟（北京大学生命科学学院细胞遗传学系）一. 导言1. 质粒DNA的分离应用质粒作为基因克隆的载体，—个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA 制剂。
通常所说的质粒DNA的制备，事实上包括质粒DNA的分离和质粒DNA纯化两个步骤或两个内容。
⑴质粒DNA的分离这是指应用溶菌酶或是十二烷硫酸钠(SDS)处理大肠杆菌寄主细胞，使之完全裂解，释放出完整的染色体DNA及质粒DNA。
在这个步骤，要求操作十分温和而小心谨慎，要尽量避免染色体DNA发生断裂。
大肠杆菌细胞裂解液经离心之后，获得了含有大量质粒DNA的上清液。
⑵质粒DNA的纯化在离心所得的大肠杆菌细胞裂解液上清液中，不可避免地含有寄主细胞染色体DNA 短片段，因此需要设法除去这些污染的DNA片段，使质粒DNA得以纯化出来。
2. 选择制备质粒DNA技术程序必须考虑的因素己经发展出了许多种用于制备质粒DNA的快速简易的方法。
针对不同的具体实验的对象，究竟应选择何种技术程序，主要应考虑如下这些因素：⑴所研究的目的质粒DNA分子量的大小；⑵实验程序要尽可能简单，並有良好的重复性；⑶要使用溶菌酶溶菌的细菌种属，以及溶菌酶以外的其它溶菌药剂；⑷实验方法要温和，如果是制备大分子量的质粒DNA，这点尤其要重视；⑸质粒DNA的产量(这点与质粒拷贝数密切相关)；⑹提取质粒DNA的实验用途，例如供作限制酶酶切分析，或是进行转化实验等。
3. RNA及蛋白质等污染物的去除对于—般的转化实验以及克隆过程，并不—定需要制备纯化的质粒DNA。
但是为了构建限制性酶切图谱，为了获得发表用的图片，以及—些特定的克隆程序等，则需要制备纯化的货粒DNA。
为此需要在质粒DNA纯化过程中加RNase处理以除去RNA，用酚抽取除去蛋白质，或是加入核酸酶抑制剂：焦碳酸二乙酯，以除去—些菌种中存在内源核酸酶。
二. 微量碱法制备质粒DNA1. 溶液配制（1）Solution 1[ 50mM Glucose,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA]Glucose 991.0mg2M Tris-HCl(pH 8.0) 1.25ml0.5M EDTA (pH 8.0) 2.0mlLysozyme 4mg/mlG.D.H2o --------→ 100a.Autoclaved for 15 mins at 10 b/in2 and stored at 40C。
质粒的提取和电泳ppt课件
2) Northern blot的第一步；
28S 18S
注意：RNA提取过程中 主要避免RNA酶的污染。
（3） PCR及电泳分析
1)获得目的基因的最常用方法； 2)可以进行探针标记； 3)可以进行基因的定点突变 4)PCR酶切片段长度分析（PCRRFLP）； 5)可以定量分析基因含量（real time PCR）.
加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。
注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。
（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置
冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。
（去除蛋白质）
2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形 成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；
3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.
碱裂解法提取质粒试剂：
1. 基因组DNA提取、酶切、电泳 2.提取RNA、 电泳 3. RT-PCR 4.ＰCR产物与T载体连接 5. 转化
（1）基因组DNA提取、酶切、电泳
123
Smear1) 建立基因组的第一步 2) 人类基因组测序的第一步 3) Southern blot的第一步
（2）RNA的提取、电泳
1) RT-PCR的第一步，也是目的 基因获得的第一步；
5mol/L 醋酸钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。