ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响

收稿日期：2012－04－23；修回日期：2012－05－13基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（200906036）；国家自然科学基金面上项目（20776058）作者简介：于小青（1982－），女，山东潍坊人，硕士研究生。

研究方向：植物次生代谢与调控。

△该作者目前就读于华中科技大学生命科学与技术学院，系2009级本科生。

*通讯作者：付春华。

E－mail：fuch2003@126．com ·研究报告·ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响*于小青1，杨海燕△，张蒙1，栗茂腾1，2，付春华1，2*，余龙江1，2（1．华中科技大学生命科学与技术学院，资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉430074；2．华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，湖北武汉430074）摘要：ORCA3是一个受MeJA诱导的调控植物基础和次生代谢的转录调控因子。

本文拟探讨ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响，旨在为创制紫杉醇稳定高产的红豆杉细胞系，解决细胞大规模培养中紫杉醇含量低的瓶颈问题提供参考。

从长春花中克隆ORCA3基因后，采用农杆菌介导法转入红豆杉细胞中，通过PCR、组织化学活性染色等检测法，筛选得到20余株转基因细胞系。

HPLC检测转基因细胞系内紫杉醇含量表明：与阴性对照相比，转基因细胞系的紫杉醇含量增加了0．5 2．5倍，最高可达159．315μg/g。

因此，ORCA3转录因子可以调控红豆杉细胞中紫杉醇合成。

关键词：红豆杉；遗传转化；ORCA3；紫杉醇中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1008－0457（2012）03－0189－05紫杉醇（Taxol）是一种重要的抗肿瘤药物，由于它在红豆杉植物中含量极低（约为0.01%），市场供求矛盾突出［1］。

目前，紫杉醇主要靠天然提取和化学半合成法获得，这两种方式均需要依赖有限的红豆杉资源。

因此，细胞大规模培养方法被认为是生产紫杉醇最有希望的替代途径之一［2］。

国内外学者对细胞大规模培养生产紫杉醇的各技术环节进行了深入探讨，建立了许多提高细胞培养中紫杉醇产量的工艺方法［3－6］，但尚未用于产业化生产，主要问题是细胞系培养过程中紫杉醇含量下降，产量不稳定。

因此，创制紫杉醇稳定高产的红豆杉细胞系是解决这一瓶颈问题的关键［7］。

转录因子是植物次生代谢最为重要的调节环节之一，有效的转录调控可大幅度提高次生代谢产物的合成［8］。

ORCA3（Octadecaniod－derivative Responsive Catharanthus AP2－domain protein）是一个受茉莉酸甲酯诱导的植物基础和次生代谢的转录调控因子，长春花细胞中过量表达ORCA3促使长春碱的含量提高了100倍［9］。

本文拟克隆长春花ORCA3，并利用根癌农杆菌介导法将该基因导入到红豆杉细胞，以探讨ORCA3对紫杉醇产量的影响，为创制高产紫杉醇新种质奠定基础。

1材料与方法1．1材料转化受体材料为实验室长期继代保存的曼地亚红豆杉（Taxus media cv．Hicksii）细胞。

每25d 继代1次，细胞继代培养基配方为：B5+3%蔗糖+0．2mg/L二氯苯氧乙酸+0．5mg/Lα－萘乙酸+0．5mg/L6－苄基嘌呤，固体培养基添加1%琼脂，pH为5．8。

培养温度为（24ʃ1）ħ，暗培养。

长春花（Catharanthus roseus）实生苗叶片用于ORCA3基因克隆。

克隆所用载体为pGEMT；植物表达载体为pBI121。

山地农业生物学报31（3）：189 193，2012 Journal of Mountain Agriculture and Biology1．2方法1．2．1DNA提取参照李荣华等［10］的SDS－CTAB法提取长春花和红豆杉细胞基因组DNA。

1．2．2ORCA3基因克隆根据NCBI中的ORCA3基因序列（AF485783）设计引物：ORCA3－ybF：5’－AAgagctcATGTCCGAAGA AATCATT－3’（引入Sac I位点）；ORCA3－ybR：5’－AActcgagTTA-ATATCGTCTCTTCTT－3’（引入Xho I位点），以长春花总基因组DNA为模板扩增ORCA3基因。

PCR 程序为：95．0ħ3mins，94．0ħ30s，52．0ħ30s，72.0ħ1mins。

以上35个循环。

最后72．0ħ延伸10mins。

1．2．3细胞杉细胞的遗传转化中国红豆杉细胞遗传转化按照实验室前期建立的体系进行［6］：菌液OD600=0．6，侵染时间25min，培养48h（温度21ħ）后，用含100mg/L头孢霉素的无菌水冲洗10 s，然后将材料转至含300mg/L头孢霉素的抑菌培养基上，两周后转至含150mg/L卡那霉素筛选培养基上培养，筛选5个周期后的阳性转基因细胞株用于后续试验。

1．2．4转基因细胞株的PCR检测以ORCA3－ybF和ORCA3－ybR为引物，转基因细胞株总DNA 为模板，扩增ORCA3基因。

PCR程序同2．2．2。

1．2．5紫杉醇的提取与检测紫杉醇的提取参照Li等［11］的方法进行，HPLC条件为：C18柱（4．6ˑ150mm，Agilent，USA）；柱温25ħ；227nm检测；用甲醇ʒ水=70ʒ30体系作流动相；流速为1mL/ min。

所用HPLC仪为法国Gilson公司全自动高效液相色谱仪，紫杉醇标准品由美国NCI提供。

每个样品测定3次，计量资料以均数ʃ标准差表示，两组间均数比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果与分析2．1转录因子ORCA3基因克隆及表达载体的构建以长春花（Catharanthus roseus）叶片总DNA为模板，利用ORCA3－ybF/ORCA3－ybR特异引物PCR扩增后在500 800bp之间获得1条明亮的条带（图1）。

测序分析发现，获得的基因片段大小为603bp，基因序列与长春花中报道的序列一致。

之后，利用XbaⅠ和SmaⅠ酶功位点将ORCA3基因构建到PBI121载体上，并转化根瘤农杆菌EHA105。

含有ORCA3基因的EHA105阳性菌株用于转化红豆杉细胞。

注：M．DNA Marker DL5000；1 2．长春花总DNA PCR产物图1长春花ORCA3基因的PCR产物电泳图Fig．1PCR profile of ORCA3gene from Catharanthus roseus 2．2转基因细胞株的筛选与放大培养转化后的红豆杉细胞在筛选培养基上，培养1个月后，细胞团内部大部分细胞逐渐褐化，同时褐化细胞周围长出颜色较浅的新细胞团（图2A）。

将新长出的细胞继续进行继代筛选培养，抗性细胞生长较快，呈鲜亮的乳白色；假阳性细胞色泽较暗，呈褐色，生长很慢，逐渐死亡（图2B）。

将抗生素筛选得到的细胞团进行进一步扩大培养（图2C），得到较大生物量的转基因细胞株20余株，用于后续转基因细胞的鉴定及外源基因的表达分析研究。

2．3红豆杉转基因细胞株的PCR鉴定及GUS组织活性染色随机选取5株筛选培养5个周期的抗性细胞，对外源基因ORCA3进行扩增，结果表明，转基因红豆杉细胞总DNA中，均能成功扩增出外源转录因子ORCA3片段（图3），证明外源目的基因能稳定地整合到植物基因组中。

对上述5株转基因细胞及对照细胞进行GUS 染色，结果表明，抗性细胞呈现蓝色，而未转化的对照组细胞则为乳白色或半透明色（图4），并且挑取的细胞几乎全部变蓝，说明细胞转化和筛选的效果良好，外源基因已经在红豆杉细胞内成功表达。

2．4转基因细胞株紫杉醇含量检测对上述5个红豆杉基因工程细胞株进行紫杉醇含量测定，结果表明，紫杉醇标准品的出峰时间为6．701min（图5），对照组未转化的红豆杉细胞中紫杉醇含量为63．8μg/gDW，转空载体的细胞091山地农业生物学报2012年注：A．筛选第1个周期；B．小愈伤团法筛选第2个周期；C．细胞扩繁图2转化红豆杉细胞的抗性筛选与放大培养（Bar =5mm ）Fig．2Resistance screening of transformed Taxus cell lines （Bar =5mm ）注：M．DNA Maker DL5000；1．含ORCA3质粒；2．未转化红豆杉细胞；3 7．转基因红豆杉细胞图3转基因细胞PCR 鉴定Fig 3PCR identification of transgenic cell lines注：1．对照组未转化细胞；2．转空载体细胞；3 7．不同的转基因细胞株图4转基因细胞的GUS 组织化学染色Fig．4GUS activity staining of transgenic cell lines株的含量与未转化细胞差别不大，为78．3μg /g DW 。

检测的转基因细胞样品中紫杉醇含量有3株高于对照未转化细胞（图6），最高为159.315μg /g ，为对照组的2．5倍；有1株与对照含量相当，有1株仅为对照含量的1/3，说明通过转入ORCA 3转录因子，可以得到紫杉醇含量提高的红豆杉转基因细胞系。

图5紫杉醇标准品HPLC 色谱图Fig．5HPLC chromatogram of taxol standard191第3期于小青，等：ORCA 3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响注：同一列上方有相同字母表示差异不显著（P≤0．05）；1．阴性对照；2．转空载体细胞株；3 7．转基因细胞株图6转基因细胞株紫杉醇含量测定Fig.6Taxol yield of different transgenic cell lines3讨论转录因子调控为上游事件，可以同时对多个合成途径调控，往往有一因多效的作用［12］。

特定产物的生成与否、量的多少主要由参与其合成的多个酶蛋白的活性所决定，而这些相关酶的表达受到相应的转录因子调节。

转录因子的基因工程被认为是植物次生代谢遗传改良的有效途径，随着植物次生代谢调控机制的阐明，特别是随着调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和功能鉴定，转录因子基因工程将为人类开发利用有效次生代谢物这一巨大的宝库提供更为有效的手段［13］。

近年来，转录因子调控次生代谢的研究越来越多［8］。

OR-CA3属于AP2家族转录因子，在长春花中超表达，使长春花碱含量提高约100倍。

本文通过克隆长春花转录因子ORCA3基因，并通过农杆菌导入法将该基因成功导入红豆杉细胞基因组中，经检测表明，转基因细胞株中紫杉醇含量有3株高于野生型，最高为159.315μg/g，为对照组的2．5倍，而长春花中超表达ORCA3，可使长春碱的含量提高100倍。

超表达同一基因，对产物的合成影响差别很大，一方面可能是单一因子作用不明显。