荧光定量PCR实验原理及数据分析
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茎
茎由互补配对序列组成
荧光素 淬灭剂
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26
实时荧光定量PCR分类－－分子信标
FRET
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27
实时荧光定量PCR分类－－分子信标 优 点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺 点
只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高
XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后， 它是一个常数，定为M
方程式（1）两边同取对数得： Log2M＝Log2X0 *（1＋En）Ct 整理方程式（2）： Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）
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（2）
荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系
– 相关系数（R2）：大于0.98 – 标准曲线斜率：-3 － -3.5 – PCR扩增效率（E）：0.9-1.2
• 检测灵敏度确认
– 35Cycles内可得到好的定量结果 – 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增
• No template control确认
– 35 Cycles内无引物二聚体产生
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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14
常用荧光定量标记方法
• 非特异性荧光标记 • SYBR Green I
• 特异性荧光标记 • TaqMan Probe
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30
内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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31
荧光定量PCR的解析方法
绝对定量解析方法
相对定量解析方法
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探针
热变性
引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
R
探针
延伸反应
R
R
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23
Taqman 探针法－－PCR体系的建立
1. 引物、探针的设计：
– 探针Tm为68-70℃, <30 bp, 5’不能有G, G可能会淬灭荧光素 – 引物尽量靠近探针, 扩增片段<400 bp, 引物Tm为59-60℃
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
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37
绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品 未知样品 空白对照
copies/ml
5×103 5×104 5×105 5×106 ?
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20
SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
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21
Taqman 探针法－－原理
• • • •
病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
分子信标
高特异性 荧光 背景低
只适合特定目标 设计困难 价格高
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29
荧光定量PCR技术的主要应用
• 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 • 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量 ，GMO定量检测等 • 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差 异显示结果验证等
Sample Ck 104 Ck 102
模板DNA量越多，荧光达 到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值
Cycle number
呈线性关系。
Lg of DNA concentration www.sangon.com
12
荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认
• 线性关系、扩增效率确认
Baseline
Cycle（循环数）
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6
荧光定量PCR原理－－Ct值
PCR扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct值的定义：
Ct value
Cycle（循环数）
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7
荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。
32
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
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33
绝对定量分析几要素
• • 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、 PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统 计显著性。 • • 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。
38
绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33
30
R = 0.9978
扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.29 -1 =2.01-1 =1.01
2
25 Ct 20 15 5×103 5×104 Copies 5×105 5×106
2
荧光定量PCR原理－－定义
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
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•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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36Fra Baidu bibliotek
绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
3
荧光定量PCR原理－－常用名词概念
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
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4
荧光定量PCR原理－－扩增曲线
平台期
荧光基团
Rn（荧光强度）
Lg－liner phase
Baseline
荧光检测元件
Cycle（循环数）
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5
荧光定量PCR原理－－荧光阈值
平台期
前15个循环信号作为荧光本底 信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～15个 循环的荧光信号的标准偏差的 10倍 手动设置:大于荧光背景值和阴 性对照的荧光最高值；进入指 数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值
Rn（荧光强度）
Lg－liner phase Threshold
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28
几种荧光定量PCR方法的应用比较
方法 SYBR Green I 优点 适用性广 灵敏 方便 便宜 特异性高 重复性好 缺点 引物要求高 易出现非特异性带 适用范围 适合科研中对各种目的基因定量 分析，基因表达量的研究，转基 因重组动植物的研究
TaqMan
价格高 只适合特定目标
17
SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
• 关键点：
– 设计合适引物，防止非特异性扩增！
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9
荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
En：扩增效率
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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10
荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
在扩增产物达到荧光阈值时 XCt＝X0 * （1＋En）Ct＝M （1）
荧光定量PCR实验原理及数据分析
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Marketing Dep. 冯彩宁
内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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Ct1
28.18 25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2
28.64 25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct
28.41 25.19 22.28 18.77 20.5
STD
0.16 0.04 0.12 0.10 0.05
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15
SYBR Green I 染料法－－原理
• SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
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16
SYBR Green I 染料法－－作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
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34
绝对定量质粒标准品的制备
目的基因
基因组DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因 目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
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质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
• 倍比梯度稀释方法：
– 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii – 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii – 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv – 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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22
Taqman 探针法－－工作机理
纵轴：荧光信号量 横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
n
理想的PCR反应
n：扩增循环数
Xn＝X0 * 2
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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Taqman 探针法－－优缺点 优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
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25
实时荧光定量PCR分类－－分子信标
环
标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补
18
SYBR Green I 染料法－－融解曲线
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
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19
SYBR Green I 染料法－－融解曲线
融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光： 定量准确
融解曲线分析，出现 杂峰其他产物出现非 特异性荧光： 定量不准确
2. 反应参数的确定：
– 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S （Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
3. 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
– 引物浓度：100-900nM – 探针浓度：50-300nM
4. 其他与常规PCR相同
茎由互补配对序列组成
荧光素 淬灭剂
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实时荧光定量PCR分类－－分子信标
FRET
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实时荧光定量PCR分类－－分子信标 优 点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺 点
只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高
XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后， 它是一个常数，定为M
方程式（1）两边同取对数得： Log2M＝Log2X0 *（1＋En）Ct 整理方程式（2）： Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）
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（2）
荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系
– 相关系数（R2）：大于0.98 – 标准曲线斜率：-3 － -3.5 – PCR扩增效率（E）：0.9-1.2
• 检测灵敏度确认
– 35Cycles内可得到好的定量结果 – 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增
• No template control确认
– 35 Cycles内无引物二聚体产生
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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常用荧光定量标记方法
• 非特异性荧光标记 • SYBR Green I
• 特异性荧光标记 • TaqMan Probe
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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荧光定量PCR的解析方法
绝对定量解析方法
相对定量解析方法
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探针
热变性
引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
R
探针
延伸反应
R
R
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Taqman 探针法－－PCR体系的建立
1. 引物、探针的设计：
– 探针Tm为68-70℃, <30 bp, 5’不能有G, G可能会淬灭荧光素 – 引物尽量靠近探针, 扩增片段<400 bp, 引物Tm为59-60℃
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品 未知样品 空白对照
copies/ml
5×103 5×104 5×105 5×106 ?
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20
SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
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21
Taqman 探针法－－原理
• • • •
病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
分子信标
高特异性 荧光 背景低
只适合特定目标 设计困难 价格高
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荧光定量PCR技术的主要应用
• 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 • 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量 ，GMO定量检测等 • 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差 异显示结果验证等
Sample Ck 104 Ck 102
模板DNA量越多，荧光达 到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值
Cycle number
呈线性关系。
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荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认
• 线性关系、扩增效率确认
Baseline
Cycle（循环数）
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荧光定量PCR原理－－Ct值
PCR扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数
Rn（荧光强度）
Ct值的定义：
Ct value
Cycle（循环数）
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荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。
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绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
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绝对定量分析几要素
• • 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、 PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统 计显著性。 • • 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33
30
R = 0.9978
扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.29 -1 =2.01-1 =1.01
2
25 Ct 20 15 5×103 5×104 Copies 5×105 5×106
2
荧光定量PCR原理－－定义
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
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•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
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荧光定量PCR原理－－常用名词概念
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
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荧光定量PCR原理－－扩增曲线
平台期
荧光基团
Rn（荧光强度）
Lg－liner phase
Baseline
荧光检测元件
Cycle（循环数）
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荧光定量PCR原理－－荧光阈值
平台期
前15个循环信号作为荧光本底 信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～15个 循环的荧光信号的标准偏差的 10倍 手动设置:大于荧光背景值和阴 性对照的荧光最高值；进入指 数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值
Rn（荧光强度）
Lg－liner phase Threshold
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几种荧光定量PCR方法的应用比较
方法 SYBR Green I 优点 适用性广 灵敏 方便 便宜 特异性高 重复性好 缺点 引物要求高 易出现非特异性带 适用范围 适合科研中对各种目的基因定量 分析，基因表达量的研究，转基 因重组动植物的研究
TaqMan
价格高 只适合特定目标
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SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
• 关键点：
– 设计合适引物，防止非特异性扩增！
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
En：扩增效率
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
在扩增产物达到荧光阈值时 XCt＝X0 * （1＋En）Ct＝M （1）
荧光定量PCR实验原理及数据分析
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南
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Ct1
28.18 25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2
28.64 25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct
28.41 25.19 22.28 18.77 20.5
STD
0.16 0.04 0.12 0.10 0.05
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SYBR Green I 染料法－－原理
• SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
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SYBR Green I 染料法－－作用机理
热变性
引物退火
延伸反应
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绝对定量质粒标准品的制备
目的基因
基因组DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因 目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
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质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
• 倍比梯度稀释方法：
– 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii – 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii – 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv – 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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Taqman 探针法－－工作机理
纵轴：荧光信号量 横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
n
理想的PCR反应
n：扩增循环数
Xn＝X0 * 2
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
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Taqman 探针法－－优缺点 优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
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实时荧光定量PCR分类－－分子信标
环
标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补
18
SYBR Green I 染料法－－融解曲线
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
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SYBR Green I 染料法－－融解曲线
融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光： 定量准确
融解曲线分析，出现 杂峰其他产物出现非 特异性荧光： 定量不准确
2. 反应参数的确定：
– 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S （Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
3. 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
– 引物浓度：100-900nM – 探针浓度：50-300nM
4. 其他与常规PCR相同