【CN109609485A】一种甲壳素脱乙酰酶及其应用【专利】

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CN 109609485 A
CN 109609485 A
权 利 要 求 书
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1 .一种来源于油菜黄萎菌(Verticillium longisporum)VL1的甲壳素脱乙酰酶，所述 甲壳素脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(72)发明人 佟毅 沈满云
(74)专利代理机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 11290
代理人 洪俊梅 张淑珍
(51)Int .Cl . C12N 9/80(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种甲壳素脱乙酰酶及其应用
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CN 109609485 A
说 明 书
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一种甲壳素脱乙酰酶及其应用
技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于油菜黄萎菌(Verticillium longisporum)VL1的甲壳素脱乙酰酶及其应用。
背景技术 [0002] 甲壳素又名几丁质，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体(D-GlcNAc)通过β-1 ,4糖苷键 连接而成的 直链高分子氨基多糖 ，主要存在于无脊椎动物 (特别是虾、蟹 、昆 虫等甲壳类动 物的外壳)、海藻(如绿藻)、真菌(如霉菌)等中，是除纤维素以外的又一大类重要的多糖。然 而 ，甲壳素不溶于水 、稀酸 、碱、乙 醇或其 它有机溶剂 ，所以 大大限 制了其利 用价值 ，而其脱 去乙酰基后的 产物壳聚糖取决于脱乙酰度不同 ，可以 溶于酸及中性水溶液。由于壳聚糖具 有生物官能 性 和相容性 、血液 相容性 、安全性 、微生物降 解性等优良 特性 ，因此在医药 、食 品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域得到了广泛应 用(Kaur and Dhillon 2014)。目前，生产壳聚糖主要采用的浓碱热解法(40％以上的氢氧 化 钠) 存在诸多问 题 ，如反应时间 长 、能 耗大 、产品 质量 (主要是 指平均分子 质量 和脱乙 酰 度)不稳定，并会造成严重的环境污染问题。 [0003] 甲壳素脱乙酰酶(Chitin deacetylase，简称CDA，E .C .3 .5 .1 .41)可将甲壳素中的 乙酰基脱除，从而使其转化为壳聚糖(Ghormade ,Kulkarni et al .2010) ，可有效解决传统 方法 制备壳聚 糖存在的问 题 ，提供了一 种高品 质、低成 本 、节能 环保的 壳聚 糖新型生 产方 法。 [0004] 目前，国内外已有CDA研究的若干相关报道，其产生物种包括真菌、细菌及昆虫等， 其中主要来源是真菌(Zhao ,Park et al .2010)。1973年，Araki等(Araki and Ito 1974)首 次从接合菌纲(Zygonycetes)的鲁氏毛霉(Mucor rouxii)中发现了CDA。1982年，Kauss等 (K a u s s ,J e b l i c k e t a l .1 9 8 3) 从 植 物 病 原 菌 菜 豆 炭 疽 菌 (C o l l e t o t r i c h u m lindemuthianum)中分离得到CDA，这是从非接合菌中发现该酶的最早报道，其最适反应温 度为60℃，最适pH为偏碱性环境。随后，越来越多真菌、细菌被报道具有甲壳素脱乙酰酶活 性，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans) (Alfonso ,Nuero et al .1995)、蓝色犁头霉 (Absidia coerulea)(Gao ,Katsumoto et al .1995)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Matsuo ,Tanaka et al .2005)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Martinou , Koutsioulis et al .2002) 、金针菇 (Flammulina velutipes) (Yamada ,Kurano et al .2008)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)(Gauthier ,Clerisse et al .2008)以及芽孢杆 菌(Bacillus)(He ,Xu et al .2014)(Sun ,Zhang et al .2016)(Raval ,Simsa et al .2017) 和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) (Sun ,Zhang et al .2014)。其中，蜡样芽胞杆 菌 (Bacillus cereus) 来源的CDA表现出与野生型真菌相似的酶活力(Sun ,Zhang et al .2016)。 [0005] 目前为止所发现的真菌来源的CDA基本都是单肽链糖蛋白 ，表现出良好的热稳定 性 ，但不同 来源的 CDA在细胞内的 位置、最适pH值 、最适温度、分子量 、等电 点以 及对金 属离
(10)申请公布号 CN 109609485 A (43)申请公布日 2019.04.12 C12N 15/55(2006 .01) C12N 15/70(2006 .01) C12N 15/75(2006 .01) C12N 1/21(2006 .01) C12P 19/26(2006 .01) C12R 1/125(2006 .01) C12R 1/19(2006 .01)
( 57 )摘要 本发明通过对不同物种的不同基因组序列
进行分析研究 ，筛选得出了若干未知蛋白 ，并进 一步从中鉴定出了具有出色脱乙酰酶活性的甲 壳素脱乙 酰酶 ，更具体而言 ，本发明涉及一 种来 源于油菜黄萎菌( Verticillium longisporum ) Vlo的甲壳素脱乙 酰酶 ，与已 经报道的甲壳素脱 乙酰酶相比 ，该甲壳素脱乙酰酶对生产条件要求 较低 ，具有较高的 生物安全性 ，并且具有更适合 工业化应用的特性，表现出广泛的应用潜力。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910001595 .5
(22)申请日 2019 .01 .02
(71)申请人 吉林中粮生化有限公司 地址 130033 吉林省长春市经济技术开发 区仙台大街1717号 申请人 中粮营养健康研究院有限公司 中粮生物化学（安徽）股份有限公司
2 .编码如权利要求1所述的甲壳素脱乙酰酶的DNA分子， 优选地，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 3 .如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子进一步在其3’端连接有编码 六聚组氨酸标签的核苷酸序列。 4 .包含如权利要求2或3所述的DNA分子的表达载体， 优选地，所述表达载体为pET24a(+)或pHThis。 5 .导入如权利要求4所述的表达载体的转化细胞， 优选地，所述转化细胞为大肠杆菌转化细胞或枯草芽孢杆菌转化细胞； 更优选地，所述转化细胞为大肠杆菌Transetta(DE3)细胞或枯草芽孢杆菌1012细胞。 6 .包含选自于如下物质中的一种或多种的试剂盒： 如权利要求1所述的甲壳素脱乙酰酶； 如权利要求2或3所述的DNA分子； 如权利要求4所述的表达载体；以及 如权利要求5所述的转化细胞。 7 .制备如权利要求1所述的甲壳素脱乙酰酶的方法，所述方法包括如下步骤：在培养基 中培养如权利要求5所述的转化细胞；以及收集所述培养基中的所述甲壳素脱乙酰酶。 8 .一种催化甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的 甲壳素脱乙酰酶；如权利要求2或3所述的DNA分子；如权利要求4所述的表达载体；如权利要 求5所述的转化细胞；和/或如权利要求6所述的试剂盒， 优选地，所述催化甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖在温度为50℃-70℃(优选55℃-65℃、更 优选58℃-62℃、最优选60℃)并且pH为3 .0-8 .0(优选3 .5-7 .5、更优选4 .0-7 .2、进一步优选 4 .5-6 .5、特别优选5 .0-6 .0、最优选5 .5)的条件下进行。 9 .如权利要求1所述的甲壳素脱乙酰酶；如权利要求2或3所述的DNA分子；如权利要求4 所述的表达载体；如权利要求5所述的转化细胞；和/或如权利要求6所述的试剂盒在催化甲 壳素脱乙酰化生产壳聚糖中的用途， 优选地，所述催化甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖在温度为50℃-70℃(优选55℃-65℃、更 优选58℃-62℃、最优选60℃)并且pH为3 .0-8 .0(优选3 .5-7 .5、更优选4 .0-7 .2、进一步优选 4 .5-6 .5、特别优选5 .0-6 .0、最优选5 .5)的条件下进行。