白血病患者RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义

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抑癌基因RASSF1A及其甲基化的研究进展

或佛波酯结合区高度同源，故也被称作蛋白激酶Ｃ保守区１编３ＲＳＦＡ的失活机制，ＡＳＩ码三个结构域；ＡＳ１ＲＳＦＢ含１、ｏ和外显子３～，ＤＡ全ｐ２１ｔ３６ｃＮ
目前认为ＲＳＦＡ基因表达失活主要与启动子区特异的高ＡＳ１
失，预示抑癌基因ＲＳＦＡ的缺失可能与多种肿瘤的发生发展因子（ＡＳ１如细胞周期蛋白Ａ或Ｅ）７的表达增多抑制ＲＳ１ＡＳＦＡ诱导
有关。目前许多学者热衷于研究ＲＳＦＡ基因启动子区的高甲的细胞周期停滞。ＡＳ１
基化与其失活的关系。本文现对ＲＳＦＡ基因的结构、癌机ＡＳ１抑综述。１ＲＳＦ基因的结构特点ＡＳ１另一种观点是与Ｒ通路相关的，ａ通路是所有细胞都有ｓａＲｓ制、失活机制、尤其是其甲基化与去甲基化的相关研究进展作一的一条高度保守的信号传递通路。Ｒ蛋白在有活性的ＧＰｓａＴ结
杂合性丢失及染色体缺失有关。ＤＡ甲基化是脊椎动Ｎ长为１６４ｂ，６ｐ只编码Ｒ相关结构域；ＡＳ１ｓａＲＳＦＣ含外显子２和甲基化、
外显子３～，ＤＡ全长为１０ｐ编码２０个氨基酸，白的物ＤＡ的自然化学修饰方式，ＤＡ甲基化转移酶介导，胞６ｃＮ０ｂ，７７蛋Ｎ由Ｎ将
体短臂（ｐ１３）克隆出一个与鼠的Ｒｓ效应蛋白Ｎｒ３２．上ａｏｅｌ和化。ＲＳＦＡ可能是Ｒ下游信号转导中的一个效应物ｊＡＳ１ｓａ，

乳腺癌组织及血浆中RASSF1A,CDH1甲基化的检测及临床意义

织及良性肿瘤组织５～１ｍｇ周围软组织和脂肪组织０（
已剔除）碎后研磨，入离心管内按说明书操作。剪倒提取的ＤＡ用紫外分光光度计定量后一２ ℃ 保存。Ｎ０ ② 血浆ＤＡ的提取：磁珠法试剂盒提取。分别取乳Ｎ用
前抽取患者静脉血５ｌＥＴ．抗凝，００ｍ，ＤＡＫ２０ｇ离心１ｒｉ，心转移上层血浆至１５离心管中，于０ｎ小ａ．ｍｌ再
４ ℃条件下１０ｇ离心１ｍｎ取上清以１０离心２０００ｉ，．ｍｌ
ＧＴＩ、ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＩｒＴＡＴＩｒ３Ｔ・５：ＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴ—
１３ＤＡ的提取．Ｎ
① 组织ＤＡ的提取：别取癌组Ｎ分
ＣＡＡＣＣ．５ｌ增体系：ＹＲＰｅｘＥＡＣＡＡＡ３扩２ｔｘ２ＸＳＢｒｍｉｘＴｑＭ１．ｌ上下游引物（０ｘｏＬ各０４ｌ样本ａＴ２５，１１ｌ）．１，ｍ／ｘ
１５ｌ．ｍ的管中，全速离心来洗脱ＤＡ。ＤＡ可立刻进ＮＮ
行分析或存储在一２ ℃ 以下以后备用。０１５阴、．阳性对照 ① 选取潍坊市人民医院２００９年３月ＰＲ反应体系中用水代替ＤＡＣＮ作为阴性对照。人脐带血淋巴细胞ＤＡ进行亚硫酸Ｎ氢盐处理作为未甲基化阳性对照。人脐带血淋巴细胞ＤＡ用ＢＩＮｓＩ甲基转移酶修饰后再进行亚硫酸氢盐处Ｉ

RASSF1A基因甲基化与肿瘤关系的研究进展

中图分类号：７０２Ｒ３．
文献标识码：Ｂ
文章编号：０１９０２０）５０４－１０－３（０８０－５０３５０
ＮＲ１ＲＳＦＡＭＳ１ＯＥ一ＡＳ１ — Ｔ复合体代表了１种新的Ｒｓ调节促进ａ研究表明，３号染色体短臂（ｈｈｒａｍｏ３ｃｒｍｓｍｅｔｅｓｏｔｒｆｈｏｏｏ，３）ｐ等位基因缺失在恶性肿瘤中频繁出现，提示３ｐ区域可能存
１ＲＳＦＡ的基因定位和蛋白结构ＡＳ１
ＲＳＦＡ是一微管结合蛋白，有１个与微管结合的区ＡＳ１含域，调节有丝分裂的进程。Ｉｕ等发现ＲＳＦＡ在有丝分裂ＪｉＡＳ１间期与微管结合，在有丝分裂时能修饰纺锤体和中心小体；不表
ＲＳＦＡ蛋白Ｎ端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合ＡＳ１一区域高度同源，亦称为蛋白激酶ｃ保守区１２，一与鼠的Ｒｓ［Ｃ端１ａ效应蛋白Ｎｒｌ和鼠蛋白Ｍａｐ高度同源。ｏｅｘｌ２ＲＳＦＡ基因的功能ＡＳ１
家族成员Ｂｘ和ｂｌａｃ－２结合，过度表达时启动半胱天冬酶依赖性
细胞凋亡。
用酵母双杂交筛选方法首次在３２．ｐ１３内１０ｋ的最小纯合２ｂ长缺失区克隆出１种能与ＤＡ修复蛋白ＸＡ相互作用的基因，ＮＰ且是与鼠的Ｒｓａ效应蛋白ＮｒｌＭａｐ高度同源的ｃＮ其ｏｅ和ｘｌＤＡ，包含１Ｒｓ个ａ结合区和１ＡＭ磷酸化位点，个Ｔ遂命名为Ｒｓａ相

RASSF1A抑制肝细胞癌生长的基础和临床研究-中华医学会

中华医学科技奖形式审查结果公布年份2018推荐奖种医学科学技术奖项目名称RASSF1A抑制肝细胞癌生长的基础和临床研究推荐单位推荐单位：江苏省医学会推荐意见：本项目在国内外较早提出RASSF1A等是新的肝细胞癌（HCC）预后的预测分子，初步阐明RASSF1A抑制肝癌发生发展的分子机制，利用自行构建的双重靶向性的纳米载体介导RASSF1A在HCC过表达，可明显抑制HCC在体内外的生长，本项目研究丰富了HCC发生发展的分子机制，还为利用RASSF1A基因进行HCC基因治疗提供了可行性依据，并为进行HCC基因治疗联合化疗药物治疗的临床前研究提供了实验依据。

关键技术还可临床转化。

本项目的实施及推广运用具有开拓性和创新性的贡献，也具有很强的前瞻性和可操作性。

该成果在基层医院中得到运用，对评估HCC患者的预后起到很好的预测作用，进一步指导临床治疗，取得良好的社会效益及经济效益。

目前获得国家发明专利授权1项，发表相关研究论文17篇，其中被SCIE收录17篇、在Web of Science核心合集中共被引用122次，引起国内外的广泛重视和认可，具有广泛的应用前景和深远的社会价值。

经认真审阅，该项目推荐材料真实可靠，候选单位、候选人具备获奖条件，提交资料齐全，符合要求，不存在知识产权纠纷或项目完成单位、完成人员排序争议。

同意申报中华医学科技奖。

项目简介多年来薛万江团队勇于创新，使得RASSF1A（Ras association domain family 1 A）在肝细胞癌（HCC）基础和临床研究处于国内领先地位，部分达到国际先进水平。

本项目已在SCI收录期刊发表论文17篇，已获国家发明专利1项，研究成果已获南通市科技进步二等奖2项。

在多年研究基础上，获得1项国家自然科学基金资助，1项江苏省高校自然科学研究项目资助，1项南通市科技计划项目资助。

此外，研究成果被多家单位应用，并多次在国内学术会议上交流。

本项目主要特色有以下四方面：1、HCC预后相关分子标志物的研究HCC的发生发展过程是一个由多个因素诱导、多基因和多条信号通路激活共同参与的复杂网络机制。

结肠癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态、mRNA表达变化及意义

甲基化检测．ＡＳ１
采用甲基化特
异性ＰＲ（ＰＲ）术。提取结肠癌组织和癌旁ＣＭＳＣ技正常结肠组织中的ＲＳＦＡ基因启动子区域。提ＡＳ１
取基因组ＤＡ后按ＥＮｔｙａｏｉ试剂盒ＮＺＤＡＭｅｌｉＫｔｈｔｎ
越低、有淋巴结转移和远处转移及Ｄｋｓｕｅ分期越晚，
其ＲＳＦＡ基因启动子甲基化发生率越高。结肠ＡＳ１癌组织中ＲＳＦＡ基因启动子甲基化者其ｍＮＡＳＩＲＡ表达缺失。说明ＲＳＦＡ基因启动子甲基化可能ＡＳ１与结肠癌的发生发展及转移有关。
采用ＳＳ１．ＰＳ２０统计软件。计数
资料比较用检验。Ｐ≤００为差异有统计学意．５
２结果
现，结肠癌癌旁正常结肠组织中的ＲＳＦＡ基因启ＡＳ１
动子未见甲基化，而在结肠癌组织中ＲＳＦＡ基因ＡＳ１
８例结肠癌癌旁正常结肠组织中的ＲＳＦＡ０ＡＳ１
ＤｓｏｎＲｅｔｍ，１９，２３：１－２．ｉＣｌｃｏｕ９９４（）３９３６
［］Ｆｖｕｔ，ＢｎｉＬＧｉＢｅａｖｕｔｎｏｐｖｏｅａ－５ａｌｏｅＰｅｏ，ｕ，ｔ１ａａｏｆｏｉｎｂｔｕ．Ｅｌｉｄ
山东医药２１年第５卷第４０ｉｌ２期
发的重要因素。安杰等对胃癌患者进行腹腔冲胞细胞ｌｍｉｎ即可表现出明显的生长抑制作用并诱导细胞凋亡，亡率可达７．％。因此，们认为凋８３我在结肠癌手术中，用稀释碘伏腹腔灌洗可能会杀利死手术过程中脱落的癌细胞，而有效预防、从控制肿瘤的种植转移和复发。

211238303_SHOX2和RASSF1A基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展

·综述·SHOX 2和RASSF 1A 基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展单阳阳张健锋毛振彪【摘要】消化道肿瘤发病率较高，由于其早期诊断较为困难，导致患者预后较差，因此对高危人群的筛查、早期诊断和及时治疗尤为重要。

近年来，表观遗传学在肿瘤发病机制中的作用受到了广泛关注并取得了突破性研究进展。

促癌基因矮小同源盒基因2（SHOX 2）和抑癌基因Ras 相关结构域家族1A （RASSF 1A ）甲基化作为生物标志物在消化道肿瘤诊断和预后预测中的敏感度和特异度较高，有较高的应用价值。

该文就SHOX 2和RASSF 1A 基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展作一综述。

【关键词】 SHOX 2基因；RASSF 1A 基因；DNA 甲基化；消化道肿瘤DOI: 10. 3969/j. issn. 1673-534X. 2023. 02. 004基金项目：吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金项目（320.6750.19088-75）；南通市科技局基础科学研究面上项目（JC22022040）；南通市卫健委面上项目（MA2021004）作者单位：226001 南通大学附属医院消化内科通信作者：毛振彪，Email:*************尽管在消化道肿瘤治疗方面的研究已取得了较大进展，但在全球范围内消化道肿瘤的病死率仍较高，结直肠癌（CRC ）、胃癌、原发性肝癌的病死率分别为9.2%、8.2%、8.2%[1]。

因此，应用非侵入性方法检测早期肿瘤标志物十分重要，而DNA 甲基化是被研究得较多的表观遗传修饰，DNA 甲基化水平和模式的改变，可以导致抑癌基因沉默，或原癌基因激活，进而增高肿瘤的发生风险。

矮小同源盒基因2（SHOX 2）和Ras 相关结构域家族1A （RASSF 1A ）基因是多种肿瘤信号通路的调节剂，已被证明可以促进肿瘤的发生和进展；SHOX 2和RASSF 1A 基因甲基化检测的敏感度较高，尤其在疾病早期阶段[2]。

RASSF1A和SHOX2基因甲基化检测联合快速现场细胞学评价对肺癌的诊断价值

应用研究RASSF1A和SHOX2基因甲基化检测联合快速现场细胞学评价对肺癌的诊断价值任雪珠1，2，张树森2，3，蔡志刚1，2△，李海涛1，2，许晓岚1，2，齐天杰1，2，李宏林1，2摘要：目的评估RAS相关区域家族1A（RASSF1A）联合矮小同源盒基因2（SHOX2）基因甲基化检测和快速现场细胞学评价（C-ROSE）对肺癌的诊断价值。

方法选取行RASSF1A和SHOX2甲基化检测并有明确病理诊断的179例可疑肺癌患者，其中肺癌58例，肺良性病变121例。

179例中114例（肺癌45例，肺良性病变69例）通过迪夫快速染色完成C-ROSE检测。

以病理结果为金标准，分析RASSF1A、SHOX2甲基化和（或）C-ROSE诊断肺癌的敏感度及特异度，同时明确不同标本类型和不同肿瘤类型中RASSF1A和SHOX2甲基化的结果与病理诊断的一致性。

结果RASSF1A联合SHOX2甲基化检测的敏感度为77.59%（45/58），特异度为80.17%（97/121）。

亚组分析中，肺穿刺活检及肺泡灌洗液标本中甲基化与病理诊断一致率较好，分别为88.8%（8/9）、79.75%（126/158），而胸水的一致率稍差，为63.64%（7/11）。

小细胞肺癌和鳞癌甲基化检测准确率分别为100%（5/5）、92.31%（12/13），肺腺癌为66.67%（18/27）。

C-ROSE检测的敏感度为75.56%（34/45），特异度为95.65%（66/69）。

甲基化检测联合C-ROSE的敏感度为86.96%（39/45），特异度为86.67%（60/69）。

结论RASSF1A、SHOX2甲基化检测及C-ROSE用于肺癌的诊断均具有较高的敏感度和特异度，两者结合将成为病理学诊断的有效的补充手段，两者结合有助于进一步提高诊断肺癌的效能。

关键词：肺肿瘤；DNA甲基化；诊断；RAS相关区域家族1A；矮小同源盒基因2；快速现场细胞学评价中图分类号：R446.8，R734.2文献标志码：A DOI：10.11958/20212015Diagnostic value of RASSF1A and SHOX2gene methylation detection combined with rapid on-site cytological evaluation in lung cancerREN Xuezhu1,2,ZHANG Shusen2,3,CAI Zhigang1,2△,LI Haitao1,2,XU Xiaolan1,2,QI Tianjie1,2,LI Honglin1,2 1The Frist Department of Respiratory and Critical Care Medicine,the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang050000,China;2Hebei Key Laboratory of Respiratory Critical Care;3Department of Respiratory and CriticalCare Medicine,Xingtai People's Hospital Affiliated to Hebei Medical University△Corresponding Author E-mail:*******************Abstract:Objective To evaluate the diagnostic value of RASSF1A and SHOX2gene methylation detection combined with rapid on-site cytological evaluation(C-ROSE)in lung cancer.Methods A total of179patients suspected lung cancer patients with RASSF1A and SHOX2methylation detection and definite pathological diagnosis were selected,including58 cases of lung cancer and121cases of benign lung disease.C-rose detection was performed in114of179patients(45lung cancers and69benign lung lesions)by Diff-quick ing pathological results as the gold standard,the sensitivity and specificity of RASSF1A,SHOX2methylation and/or C-ROSE in the diagnosis of lung cancer were analyzed.The consistency between the results of RASSF1A and SHOX2methylation in different specimen types and different tumor types and pathological diagnosis was determined.Results The sensitivity and specificity of RASSF1A combined with SHOX2 methylation detection were77.59%(45/58)and80.17%(97/121),respectively.In the subgroup analysis,the coincidence rates between methylation and pathological diagnosis in lung biopsy and biopsy and alveolar lavage fluid(BALF)specimens were88.89%(8/9)and79.75%(126/158),respectively,while the consistency of pleural fluid was less than63.64%(7/11).In the subgroup analysis of lung cancer types,the accuracy of methylation detection was100%(5/5)and92.31%(12/13)in lung small cell carcinoma and squamous cell carcinoma.which was66.67%(18/27)in lung adenocarcinoma.The sensitivity and specificity of C-ROSE detection were75.56%(34/45)and95.65%(66/69)respectively.The sensitivity of methylation 基金项目：2020年度河北省医学科学研究课题计划（20200060）；河北省县级综合医院适宜卫生技术推广项目资助（20200017）作者单位：1河北医科大学第二医院呼吸与危重症医学一科（邮编050000）；2河北呼吸危重症重点实验室；3河北医科大学附属邢台市人民医院呼吸与危重症医学科作者简介：任雪珠（1986），女，主管检验师，主要从事ROSE在呼吸介入技术中的应用价值研究。

RASSF1A基因在胶质瘤组织中甲基化研究及临床意义

ｎｒａｒｉｉｓｅａｄｈｃｉｉａｐａｈｌｇｃｌｉｎｉｃａｅｏｍｌｂａｎｔｓｕｓｎｔｅｌｎｃｌｔｏｏｉａｓｇｆｎｃＭｅｈｏｉｔｄｓ：ｅｒｍｏｅｍｅｈｌｔｏｓａｕｏｈｅｒｍｏｅｅｉｎｆＴｈｐｏｔｒｔｙａｉｎｔｔｓｆｔｐｏｔｒｒｇｏ０
ＤＮｉ— ｎＬＵＹｎｈｉ Ⅳ ＷｅｒｎＤｐｒｅｔｆＮｕｏｕｇｒ，ｈｎｆｇＨｓｉｌｆＣｉａＭｅｉＯＧＸｎｍｉｇ，Ｉｕ —ｕ，ｉａ．ｅａｔｎｅｒｒｅＳｅｇｎｏｔｈｎｄ — ｍｏｓｙｉｐａｏ．
维普资讯
｝床肿瘤学杂志２０缶０８年６月第１３卷第６期
ＣｉｅｅＣｉｃｌＯｃｌｇ，ｕ．２０，ｏ．，ｏ６ｈｎｓｌｉａｎｏｙＪｎ０８Ｖ１ｎｏ３Ｎ．
・９・４９
ＲＳＦＡＳ１Ａ基因在胶质瘤组织中甲基化研究及临床意义
【关键词】胶质瘤；ＲＳＦＡ；甲基化；ＭＳＰＲＡＳ１ —Ｃ
中图分类号：７９４Ｒ３１文献标识码：Ａ文章编号：０９— ４０２０）６— ４９— ４１００６（０８００９０
ＴｈｌｎｉａｅｅｃｏｏｅｅｈａｔｏｏｈｅＲＡＳｅｃｉｃｌｒｓａｒｈｏｎｐｒｍｔｒｍｔｙｌｉｎｆｔＳＦ１ｉｌｏａｎｇｉｍＡ
ＲＳＦＡｗｓｎｌｅｙｍｔｙａｏｅｉｃＰＲ（ —ＣＡＳ１ａａａｚｄｂｅｈｌｔｎｓｃｆ —ＣｙｉｐｉＭＳＰＲ）ｉ６ｃｓｓｕｇａｌｒｓｃｅｌｍｓ（９ｃｓｓｉｓｏｙｍ．６ｎ４ａｅｒｉｌｅｔｇｏａ１ａｅｔａｔｃｔａ１ｓｃｙｅｄｉｗｈｒｏｃｓｓｉｐｎｙｏ，１ｃｓｓｗｔｌｂａｔｍｓａｄ６ｃｓｓｎｒａｂａｉｕｓＲｓｌ：ｈｒｍｔｔｙａｏａｆａｅｔｅｅｄｍｍａａｅｉｇｉｌｓａ）ｎａｅｏｌｒｎｔｓｅ．ｅｕｔＴｅｐｏｏｒｍｅｌｔｎｒｔ０ｗｈ１ｈｏｏｍｉｓｓｅｈｉｅＲＳＦｌｍａａ５２（０４）ｎｏａｂａｓｕｓｗｓ（／）ＴｅｒｔｏｐｏｏｒｙｅｍｔｙｔｎｏＡＳ１ＡＳ１ｉｇｏｓ．％３／６ａｄｉｎｒｌｒｉｔｓｅａ０６．ｈｅｆｒｍｔｐｒｅｌｉｆＳＦＡｎｉｗ６ｎｍｎｉ０ａｅｈｈａｏＲＡｉｌｍａａｄｎｒａｂａｓｕｓｓｏｅｉｉｃｎｃｒｌｉ（５２／．０ｎｇｉｎｏｍｒｉｔｓｅｈｗｄｓｎｆａｔｏｒａｏ６．％３，Ｐ＝００７．ｈｅｔｅｐｏｏｅｔｙａｏａｅ０ｏｌｎｉｇｉｅｔｎ５．１）ｗｉｈｒｍｔｒｈｌｉｒｆｌｍｅｔｎｔＲＳＦＡｉｓｏｙｍａｅｅｄｍｏａａｄｇｌｌｓｍｓｅｅ３２（２１）６．％（１１）６．％（／１，ｅｐｃｖｌ．ｏＡＳ１ａｒｃｔ，ｐｎｙｍｎｌｂａｔａｒ６．％１／９，８８ｎｔｏｏｏｗ１／６，３６７１）ｒｓｅｔｅＮｉｙｓｎｃｎａｓｃｌｉｅｅｃａｂｅｅＰ＝．１）ｏｅｅ，ｈｅｅｎｔｔｉｉｉｉａｔｔｔｔａｄｆｒｎｅｓｓｒｄ（０２ｏＨｗｖｒｔｅｐｏｅｔｌｉｆＡＳ１ｇｏａｗｒｏｓｔｔｇｆｉｓｉｉｆｗｏｖ１ｏｍｈａｏｎｉａｓ．

RASSF1A基因启动子甲基化与肿瘤关系的研究进展

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ。ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＸｉｎｊｉａｎｇＳｈｉｈｅｚｉ－８３２００２）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｒａｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｆａｍｉｌｙｌａｇｅｎｅ（ＲＡＳＳＦｌＡ）ｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｏｆｇｅｎｅＲＡＳＳＦＩ。ｎｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ
２００９年１０月第３１卷第５期
农垦医学ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｎｇｋｅｎＭｅｄｉｃｉｎｅ
Ｏｃｔ．２００９Ｖ０１．３ｌＮｏ．５
加，认为ＲＡＳＳＦＩＡ的这种作用可能是转录后水平的调节，可能与ＲＡＳＳＦＩＡ的ＤＡＧ结合域有关，因为缺少ＤＡＧ功能域的ＲＡＳＳＦｌＣ对ＣｙｃｌｉｎＤｌ的表达几乎无影响。２．２．２ＲＡＳＳＦｌＡ基因启动子甲基化与鼻咽癌的关系ｋ等【ｌ纠分析了４例鼻咽癌移植瘤标本、４株鼻咽癌细胞系和２１例原发性鼻咽癌标本，发现ＲＡＳＳＦＩＡ基因５ＣｐＧ岛的完全甲基化率在移植瘤中为１００％（４／４），在鼻咽癌细胞系中为７５％（３／４），在原发性鼻咽癌中为６６．７％（１４／２１），在正常鼻咽上皮没有甲基化，基因突变只在原发性鼻咽癌中发现２个，而且在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有ＲＡＳＳＦｌＡ基因的高表达缺失，在用甲基化抑制剂５氮杂脱氧胞苷（５７一ａｚａ一２，ｄｅｏｘｙｃｙｔｉ— ｄｉｎｅ）处理后，ＲＡＳＳＦｌＡ基因重新表达并显著抑制细胞的生长和增殖。Ｃｈｏｗ等¨钊将野生型ＲＡＳＳＦＩＡ基因转染到ＲＡＳＳＦｌＡ基因缺陷型的鼻咽癌细胞Ｃ６６６２１中，发现再新表达ＲＡＳＳＦＩＡ蛋白的鼻咽癌细胞Ｃ６６６２１能显著减少其细胞克隆形成，抑制非贴壁性细胞生长。这些研究表明ＳＦＡＳ—ＳＦｌＡ基因是鼻咽癌的一个非常重要的候选抑癌基因，启动子区的高度甲基化是其失活的主要机制。２．２．３ＲＡＳＳＦｌＡ基因启动子甲基化与食管鳞状细胞癌的关系ＫｕｒｏｋｉＴ等【１７１为评价食管鳞状细胞癌中ＲＡＳＳＦＩＡ的启动子甲基化状态，检测了２３例食管鳞状细胞癌细胞系及４８例原发性肿瘤癌和旁正常组织ＲＡＳＳＦＩＡ的基因表达，分别有７４％及５２％存在ＲＡＳＳＦｌＡ高甲基化。统计学分析，ＲＡＳＳＦｌＡｍＲＮＡ的失活与高甲基化相关。可见启动子高甲基化所致的ＲＡＳＳＦｌＡ基因失活在食管鳞状细胞癌发生过程的早期起重要作用，可能在食管癌中也是候选抑癌基因。研究还发现，食管癌组织中ＲＡＳＳＦｌＡ基因表达缺失与食管癌的淋巴结转移和分期相关，伴有淋巴结转移或分期较晚者的表达缺失率均明显高于无淋巴结转移或病期较早者。这一研究结果与在胃癌旧ｊ、肺癌＂１等研究结果相似，这表明ＲＡＳＳＦＩＡ基因在食管癌发展过程中亦发挥作用。食管癌淋巴结转移和ＴＭＮ分期晚期患者预后不良，检测ＲＡＳＳＦｌＡ基因表达可作为评价食管癌预后的重要指标。２．２．４ＲＡＳＳＦｌＡ基因启动子甲基化与胃癌的关系

肝细胞癌患者血浆和癌组织中RASSF1A基因甲基化及临床意义

２０２，ｈｎ）３０２Ｃｉａ
【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｅｃｔｅａｔｅｙｔｎｉｔｒｏｒｆＡＳ１ｅｅｎｅｐｅｌｌｍｎｍｒＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｔｔｈａｒｎｍｔｌｉｅｏｔＳＦｇｒｈｒａａａｄｔｏｉｄｅｅｂｈａｏｎｈｐｍｅｏＲＡｎｉｐｉａｐｓｕ
２安徽医科大学第一附属医院中心实验室．
３香港中文大学病理学系．
ｗｔＣｗｅｅｄｔｃｅｙｍｅｈｌｔａｓｅｉｃｐｌｍｅａｅｃａｎｒ－ｉＨＣｒｅｅｔｄｂｔｙａｉ・ｐｃｆｏｙｒｓｈｉｅｈｍ・ｉ・
参考文献
１张雷达．阻塞性黄疸大鼠耐受入肝血藏号３５１，２０３２６．２何晓顺，吴金浪．大鼠肝脏缺血损伤后组织学与超微结构变化的动态观察．中华实验外科杂志，０２１（）２９— ５．２０，９３．４２１３杨进城，王志伟，李朝龙．大鼠肝肠淤血再灌注对远隔器官损伤作用的实验研究．第一军医大学学报，０４，４２１８— ０２３２０２（）：９２０，０．４熊成龙，常温肝缺ｍ再灌注肝血窦内皮细胞损伤，中华外科杂志，
【作者单位】．１安徽医科大学第一附属医院普外科，合肥２０２ａｔｎＭＳ）ｈｏｒｌｉｅｅｎｍｅｙａｏｔｕｎｐｓ３０２ｃｉ（Ｐ．Ｔｅｃｒａｏｂｔｅｔｌｉｓｔｓｉｌｍａｏｅｔｎｗｈｔｎａａ

血浆RASSF1A甲基化检测及其在非小细胞肺癌诊断中的意义

ｃｎｅａｅｔ，ｎｔｖｌｅｉｏ — ｌｃｌｌｎａｃｒ（ＳＬ）ｄａｎｓ．ＭｅｏｓａｃｒｔｎｓａｄｉａｎｎｎｓｌｅｕｇｃｎｅＮＣＣｐｉｓｕｍａｌｉｏｉｇｓｔｄ：Ａｈ
ｓｍｉｎｓｄｍｅｈｌｔｎｓｅｉｃＰＲ（Ｐ）ｗｓｕｅｏｄｔｃｈｔｔｓｏｅ・ｅｔｔｙａｉ —ｐｃｆＣｅｏｉＭＳａｓｄｔｅｅｔｔｅｓａｕｆＲＡＳＦｒｍｏｅＳ１ｐｏｔｒＡ
织中ＲＳＦＡ启动子甲基化情况，检测血浆中该基因异常甲基化在ＮＣＣ诊断中的意义。方法：应ＡＳ１探讨ＳＬ
用半巢式ＭＳ分析了９Ｐ法６例ＮＣＣ１肺良性病变患者及２ＳＬ、２例Ｏ例健康人血浆游离ＤＡ，Ｐ法分析了９ＮＭＳ６例ＮＣＣ患者对应的肿瘤组织ＤＡ，测ＲＳＦＡ的异常甲基化改变。结果：血浆及相应的肿瘤组织ＳＬＮ检ＡＳＩ ① ＲＳＦＡ异常甲基化检出率分别为４．５和４．６％，浆中该基因甲基化仅发生在相应的肿瘤组织甲ＡＳ１３７％８９血基化阳性的ＮＣＣ患者。② 血浆ＲＳＦＡ异常甲基化只与肿瘤的组织学类型有关，癌组（７１％）ＳＬＡＳ１鳞５．４高于腺癌组（３３％，００）３．３Ｐ＜．５。但与患者的年龄、别、否吸烟，瘤的ＴＭ分期、化程度和有无淋巴性是肿Ｎ分结转移无关（００）Ｐ＞．５。③ 检测ＲＳＦＡ异常甲基化用于诊断ＮＣＣ的敏感性４．５％，异性１０，ＡＳ１ＳＬ３７特０％阴性预测值４．０，１３％阳性预测值１０。结论：ＡＳ１０％ＲＳＦＡ异常甲基化很可能是ＮＣＣ发生过程中的早期ＳＬ分子事件，测血浆游离ＤＡ中该基因异常甲基化可能成为ＮＣＣ早期诊断的有效方法之一。检ＮＳＬ

血清RASSF1A基因甲基化对原发性肝癌诊断价值的Meta分析

８６南昌大学学报(医学版)２０２０年第６０卷第２期㊀J o u r n a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s)２０２０,V o l．６０N o．２血清R A S S F１A基因甲基化对原发性肝癌诊断价值的M e t a分析黄宇操,张雨薇,杨文龙(南昌大学第二附属医院感染科,南昌３３０００６)摘要:目的㊀采用M e t a分析评价血清R a s相关区域家族１A(R a s a s s o c i a t i o nd o m a i n f a m i l y１A,R A S S F１A)基因甲基化在原发性肝癌诊断中的价值.方法㊀检索P u b M e d㊁E M B A S E㊁C o c h r a n e㊁万方和知网数据库２０００年１月至２０１９年１０月有关血清R A S S F１A基因甲基化对原发性肝癌诊断的文献,最终纳入文献１１篇,累计试验组８１９例(原发性肝癌),对照组８２７例(包括慢性肝炎㊁肝硬化㊁良性肝脏疾病等),用S t a t a１２．０软件进行M e t a分析.结果血清甲基化R A S S F１A基因检测肝细胞性肝癌合并敏感性(S E N)＝０．５６(９５％C I:０．３６~０．７４),特异性(S P E)＝０．８１(９５％C I:０．６４~０．９２),阳性似然比(P L R)＝３．０(９５％C I:１．５~５．９),阴性似然比(N L R)＝０．５５(９５％C I:０．３６~０．８３),诊断比值比(D O R)＝５(９５％C I:２~１４),S R O C曲线下面积(A U C S R O C)＝０．７５(９５％C I:０．７１~０．７９).结论血清R A S S F１A甲基化检测对肝癌诊断具有一定的价值.关键词:R a s相关区域家族１A;基因甲基化;肝细胞性肝癌;液体活检;M e t a分析中图分类号:R７３５．７㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:２０９５Ｇ４７２７(２０２０)０２－００６８－０５D O I:１０．１３７６４/j．c n k i．n c d m．２０２０．０２．０１４D i a g n o s t i cV a l u e o f S e r u m R A S S F１A M e t h y l a t i o n i nP r i m a r yH e p a t i cC a r c i n o m a:aM e t aＧA n a l y s i sH U A N GY uＧc a o,Z H A N GY uＧw e i,Y A N G W e nＧl o n g(D e p a r t m e n t o f I n f e c t i o u sD i s e a s e s,t h eS e c o n dA f f i l i a t e d H o s p i t a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y,N a n c h a n g３３０００６,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e㊀T o e v a l u a t e t h e d i a g n o s t i c v a l u e o f s e r u m R a s a s s o c i a t i o nd o m a i n f a m i l y １A g e n e(R A S S F１A)m e t h y l a t i o ni n p r i m a r y h e p a t i cc a r c i n o m au s i n g m e t aＧa n a l y s i s．M e t h o d s T h eP u b M e d,E M B A S E,C o c h r a n e l i b r a r y,W a n f a n g D a t a a n dC N K Iw e r e r e s e a r c h e d f o r l i t e r a t u r e p u b l i s h e db e t w e e n J a n u a r y２０００a n dO c t o b e r２０１９a b o u t t h e d i a g n o s i s o f p r i m a r y h e p a t i c c a r c i n oＧm aw i t h s e r u m R A S S F１A m e t h y l a t i o n．F i n a l l y,１１r e f e r e n c e sw e r e a c c e p t e d,i n c l u d i n g８１９p a t i e n t s w i t h p r i m a r y h e p a t i c c a r c i n o m a a n d８２７c o n t r o l s(c h r o n i c h e p a t i t i s,c i r r h o s i s a n db e n i g n l i v e r d i sＧe a s e s)．M a t aＧa n a l y s i sw a s p e rf o r m e du s i ng S t a t a１２．０s o f t w a r e．R e s u l t s㊀Th e s e n si t i v i t y a n d s p e c iＧf i c i t y o fR A S S F１A m e t h y l a t i o nd e t e c t i o n f o r d i ag n o s i n gh e p a t o c e l l u l a r c a r ci n o m aw e r e０．５６(９５％C I:０．３６Ｇ０．７４)a n d０．８１(９５％C I:０．６４Ｇ０．９２),r e s p e c t i v e l y．T h e p o s i t i v e l i k e l i h o o dr a t i o,n e g a t i v e l i k e l i h o o d r a t i o,d i a g n o s t i c o d d s r a t i o a n d a r e au n d e r t h eS R O Cc u r v ew e r e３．０(９５％C I:１．５Ｇ５．９),０．５５(９５％C I:０．３６Ｇ０．８３),５(９５％C I:２Ｇ１４)a n d０．７５(９５％C I:０．７１Ｇ０．７９),r e s p e c t i v e l y．C o n c l u s i o n S e r u m m e t h y l a t e dR A S S F１Ad e t e r m i n a t i o nh a s c e r t a i nv a l u e i n t h ed i a g n o s i so f p r i m a r y h e p a t i c c a r c i n o m a．K E Y W O R D S:R a s a s s o c i a t i o nd o m a i n f a m i l y１A;D N A m e t h y l a t i o n;h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a;l i q u i db i o p s y;m e t aＧa n a l y s i s收稿日期:２０１９Ｇ１０Ｇ２６作者简介:黄宇操(１９９４ ),男,硕士研究生,主要从事肝炎㊁肝衰竭的临床研究.通信作者:杨文龙,副教授,EＧm a i l:w e n l o o y a n g＠１６３．c o m.㊀㊀肝细胞性肝癌(h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a, H C C)是目前临床上最常见的癌症之一,和大多数恶性肿瘤一样,缺乏典型的早期表现,传统组织活检有着诸如穿刺风险㊁受解剖位置限制㊁体验痛苦㊁操作繁琐㊁价格昂贵等限制性,并且常见的血清肿瘤标志物,如脱ＧΥＧ羧基凝血酶㊁甲胎蛋白异质体３㊁鳞状细胞癌抗原㊁血管内皮生长因子等对早期H C C诊断效能不佳[１],致使很多患者错过了最佳治疗阶段. L E O N等[２]发现肿瘤患者比正常健康人血液中有更多的循环D N A,就此液体活检进入人们的视野.液体活检是指对血液或其他体液进行的低侵入性或非侵入性检测,选择检测有关肿瘤患者的遗传信息,为临床应用提供新的手段和方法.然而肝癌的发病机制涉及的基因繁多,在２０００年,R a s相关区域家族１(R a s a s s o c i a t i o n d o m a i n f a m i l y１, R A S S F１)基因作为D N A修复蛋白X P A的双杂交结合伴侣被偶然发现[３],R A S S F１基因由于２个启动子的不同使用及不同的剪接方式产生７种不同的亚基(R A S S F１A G)[４],但在各种肿瘤中仅有R A S S F１A启动子C p G岛的甲基化被检出[５].有研究[６]报道在肝细胞性肝癌患者组织中R A S S F１A 甲基化检出率达８５％(７２/８２).随着研究的进展,在血清㊁血浆和尿液样本中也观察到R A S S F１A的广泛甲基化,这表明R A S S F１A作为H C C生物标志物具有很强的候选资格[７].然而众多研究中肝癌患者血清的甲基化R A S S F１A检测率差距较大,在C HA N等[８]的研究中检出率高达９３．７％(５９/６３),而在WU等[９]研究中检出率却只有１９．２％(７/２６).基于此,本研究纳入关于R A S S F１A甲基化诊断H C C的研究进行M e t a分析,探讨其准确性.１㊀资料与方法１．１㊀文献检索策略检索２０００年１月至２０１９年１０月P u b M e d㊁E M B A S E㊁C o c h r a n e㊁万方和中国知网数据库收入的相关研究文献.检索关键词为: h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a R a sa s s o c i a t i o n d o m a i nf a m i l y１A H C C R A S S F１A s e n s i t i v i t y s p e c i f i c i t y 肝细胞性肝癌 D N A甲基化 .通过阅读文献全文和追踪参考文献减少遗漏.１．２㊀纳入和排除标准纳入标准:１)关于外周血中R A S S F l A甲基化对H C C进行诊断的研究;２)能提取出用于计算诊断试验有关指标的数据.排除标准:１)数据无法利用的文献;２)重复发表的文献.１．３㊀数据提取每篇文献由２名研究人员独立阅读标题㊁摘要以及全文并提取数据,分歧均通过第３人裁定.提取数据包括:第一作者㊁发表年限㊁实验地区或国家㊁试验组及对照组例数㊁试验组及对照组疾病分类㊁完整的四格表数据.１．４㊀质量评价标准由２名研究人员对纳入文献逐篇根据诊断准确性研究的质量评价工具Q u a l i t y A s s e s s m e n t o fD iＧa g n o s t i cA c c u r a c y S t u d i e s(Q U A D A S)中的１４个条目进行评价.１．５㊀统计学方法本次研究采用S T A T A１２．０分析软件进行统计学分析.通过S R O C曲线及S p e a r m a n相关性分析来确定有无阈值效应的存在;异质性通过I２值进行评价,当I２ȡ５０％时,表明各研究间异质性明显,采用随机效应模型进行拟合.反之,则采用固定效应模型.合并的统计量采用敏感性(s e n s i t i v i t y, S E N)㊁特异性(s p e c i f i c i t y,S P E)㊁阳性似然比(P L R)㊁阴性似然比(N L R)㊁诊断比值比(D O R)及其９５％置信区间(C I)表示,并绘制S R O C曲线,计算曲线下面积(a r e au n d e r c u n r e,A U C S R O C).通过M e t a回归分析用于探索异质性来源.制作漏斗图评价纳入文献是否存在发表偏倚,当P＜０．０５时,说明纳入的文献存在发表偏倚,反之,则不存在发表偏倚.P＜０．０５为合并指标差异具有统计学意义.２㊀结果２．１㊀纳入文献情况根据检索策略和纳入排除标准,最终纳入研究文献１１篇,１篇为前瞻性研究,１０篇为回顾性研究.共收集病例试验组８１９例(原发性肝癌),对照组８２７例(包括慢性肝炎㊁肝硬化㊁良性肝脏疾病等).８项研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(M S P)检测R A S S F１A甲基化;３项研究采用甲基化敏感的内切酶Ｇ定量聚合酶链反应(M S R EＧP).文献筛选流程见图１,纳入文献基本特征见表１.２．２㊀M a t e分析２．２．１㊀阈值分析S R O C曲线不呈肩臂状态,见图２,S p e a r m a n 相关系数r＝０．１５５,P＝０．６５０,提示不存在阈值效应.９６黄宇操等:血清R A S S F１A基因甲基化对原发性肝癌诊断价值的M e t a分析最终纳入文献11篇阅读全文，排外研究样本仅为肝脏组织文章6篇通过题目和摘要，排外综述、荟萃分析、个案报道等文献剩余17篇通过题目和摘要，排外综述、荟萃分析、个案报道等文献632篇初筛后得到文献649篇检索数据库获得文献1011篇剔除重复发表和无效的文献及明显不符合纳入标准的文献362篇图１㊀文献筛选流程图11②①⑩⑨⑧⑦⑥⑤④③1.00.500.51.01.0图２㊀纳入研究的S R O C 曲线表１㊀纳入文献基本特征表序号作者㊀㊀㊀年份国家/地区金标准㊀㊀检测方法试验组例数对照组例数真阳性假阳性假阴性真阴性文献评分/分①Z HA N G 等[１０]２００７中国大陆病理或至少２种影像成像检测阳性M S P ５０１７３５２１５１５１２②C H A N 等[８]２００８中国香港病理M S R E ＧP ６３６３５９３７４２６１２③C H A N G等[１１]２００８中国大陆病理M S P ２６１６７３１９１３１２④MA U R I Z I O 等[１２]２０１１意大利病理M S P４２６３１３１５２９４８１０⑤HU A N G 等[１３]２０１１中国大陆病理和影像学M S R E ＧP ７２３７４０４３２３３１２⑥MO HAM E D等[１４]２０１２埃及病理M S R E ＧP ４０４０３６２５４１５１１⑦HU A N G 等[１５]２０１４中国大陆病理M S P ３１１０１６８１５２１２⑧董晓刚等[１６]２０１６中国大陆病理M S P ６０６０４４０１６６０１２⑨WU等[９]２０１７中国台湾病理M S P ２３７２５６２１１６２１６２４０１１⑩D O N G等[１７]２０１７中国台湾病理M S P ９８１６５５１１４４７１５１１２ P A S H A 等[１８]２０１９埃及病理或A F P 联合磁共振M S P１００１００４０１４６０８６１２２．２．２㊀诊断指标的合并异质性分析I ２＝９６．２１％,提示纳入的研究间存在异质性(P ＜０．０１),对纳入文献进行逐篇排除后,仍存在异质性,采用随机效应模型进行指标合并,结果见表２,血清R A S S F １A 基因甲基化检测诊断H C C 合并S E N 及S P E 森林图见图３４.２．２．３㊀M e t a 回归分析从研究类型(p r o d e s i g n )㊁人群特点(s u b je c t )㊁检测方法(m e t h o d )３个角度进行亚组分析,结果显示,合并S E N 的结果中检测方法(P ＜０．０１)㊁研究类型(P ＜０．０１),这２个因素是异质性的主要来源,而在合并S P E 的结果中未发现能解释其异质性的因素.见图５.２．２．４㊀发表偏倚检测发表偏倚采用D e e k s 试验进行评价(图６),未发现明显的发表偏倚(P ＝０．５７).表２㊀纳入文献的各项指标的合并结果试验组例数对照组例数A U CS R O CS E NS P EP L RN L RD O R８１９８２７０．７５(９５％C I :０．７１~０．７９)０．５６(９５％C I :０．３６~０．７４)０．８１(９５％C I :０．６４~０．９２)３．０(９５％C I :１．５~５．９)０．５５(９５％C I :０．３６~０．８３)５(９５％C I :２~１４)０７南昌大学学报(医学版)２０２０年４月,第６０卷第２期StudyId Pasha2019Wu2017Dong2017Dong2016Huang2014Mohamed2012Maurizio2011Huang2011Chang2008Chan2008Zhang2007COMBINED I 2=96.21[94.90-97.52]Q =263.82,df =10.00,P =0.000.56[0.36-0.74]0.70[0.55-0.82]0.94[0.85-0.98]0.27[0.12-0.48]0.56[0.43-0.67]0.31[0.18-0.47]0.90[0.76-0.97]0.52[0.33-0.70]0.73[0.60-0.84]0.52[0.42-0.62]0.09[0.06-0.13]0.40[0.30-0.50]SENSITIVITY （95%CI ）0.11.0SENSITIVITY图３㊀血清R A S S F １A 甲基化检测诊断H C C 合并S E N 森林图StudyId Pasha2019Wu2017Dong2017Dong2016Huang2014Mohamed2012Maurizio2011Huang2011Chang2008Chan2008Zhang2007COMBINED 0.01.0SPECI FICITYSPECIFICITY （95%CI ）0.86[0.78-0.92]0.94[0.90-0.96]0.92[0.88-0.95]1.00[0.94-1.00]0.20[0.03-0.56]0.38[0.23-0.54]0.76[0.64-0.88]0.89[0.75-0.97]0.81[0.54-0.96]0.41[0.29-0.54]0.88[0.64-0.99]0.81[0.64-0.92]Q =259.14,df =10.00,P =0.00I 2=96.14[94.80-97.48]图４㊀血清R A S S F １A 甲基化检测诊断H C C 合并S P E 森林图Sensitivity(95%CI ）*P <0.05,**P <0.01,***P <0.01Sensitivity(95%CI ）*P <0.05,**P <0.01,***P <0.01㊀㊀注:m e t h o d 中Y e s 表示采用M S P 方法,N o 表示采用M S R E ＧP 方法;p r o d e s i g n 中Y e s 为前瞻性研究,N o 为回顾性研究;s u b je c t ,Y e s 为阐明研究对象人群特点,N o 为未阐明.图５㊀敏感性(左)与特异性(右)M e t a 回归分析11②①⑩⑨⑧⑥⑤④③⑦10010110000.050.100.150.201/r o o t (E S S )Diagnostic Odds RatioDeeks ’Funnel Polt Asymmetry Testpvalue=0.57图６㊀纳入研究的漏斗图３㊀讨论㊀㊀本研究结果发现血清R A S S F １A 甲基化检测诊断肝细胞性肝癌合并S E N＝０．５６(９５％C I :０．３６~０．７４),S P E ＝０．８１(９５％C I :０．６４~０．９２),说明单独的血清中R A S S F １A 甲基化检测在诊断H C C 漏诊率及误诊率偏高,本次纳入的研究中对照组均为患有肝脏疾病个体,未设立正常人群作为对照,可能降低该检测在整体人群中对H C C 诊断的敏感性及特异性;阳性似然比(P L R )＝３．０(９５％C I :１．５~５．９),阴性似然比(N L R )＝０．５５(９５％C I :０．３６~０．８３),说明血清中R A S S F １A 甲基化检测在确定诊断以及排除诊断H C C 中具有一定的价值;诊断比值比(D O R )＝５(９５％C I :２~１４);S R O C 曲线下面积(A U C S R O C )＝０．７５(９５％C I :０．７１~０．７９),说明血清中R A S S F １A１７黄宇操等:血清R A S S F １A 基因甲基化对原发性肝癌诊断价值的M e t a 分析甲基化检测鉴别H C C患者和非患者能力尚可.本研究进一步通过M e t a回归分析确定异质性的来源,结果发现是否为前瞻性研究及检测方法是合并S E N异质性的来源.提示未来需要更多的前瞻性研究帮助明确R A S S F１A甲基化检测对H C C 的诊断价值,另外,虽然有研究表明焦磷酸测序已成为临床诊断中定量检测D N A甲基化最合适的技术之一[１９],但是对甲基化基因的捕捉㊁提纯等方面仍未统一,故在甲基化检测方法可能需要进一步的规范,如探针及引物的选择㊁扩增方法㊁离心方法等.本次研究的亚组分析中发现采用M S R EＧP方法的合并S E N(０．８４)高于采用M S P方法的合并S E N (０．４２),反之,在合并S P E中后者(０．８７)高于前者(０．６０).说明两种检测方法均存在一定的局限性.目前诸多研究中提到多基因或者多种标志物蛋白联合构建诊断模板能提高诊断的准确性,例如在L U等[２０]的研究中发现将３个异常甲基化基因和１个m i R N A组合以建立甲基化H B V相关H C C预测模型,获得了高灵敏度和特异性(＞８０％),然而在WU等[９]的研究指出,D N A甲基化的结合可能会增加评估的风险影响准确性,在董晓刚等[１６]的研究中２个不同的信号传导通路的基因(P１６㊁R A S S F１A)甲基化联合检测却可能提高H C C检出率,因此若联合不同信号通路的异常基因可能对构建诊断模板意义更大.此外,D O N G等[２１]在其一项病例对照研究中指出,血清R A S S F１A甲基化和A F P水平的组合可能是一种有前途的非侵入性生物标志物.本次M e t a分析也存在一定的局限性.在纳入的部分文献中,H C C患者数量相对对照组较少,而且纳入的H C C患者的病因未得到详尽的阐述,无法完成不同病因(乙肝㊁丙肝㊁脂肪肝等)引起的H C C诊断的亚组分析;同时纳入研究的异质性也可能影响M e t a分析的结果.参考文献:[１]㊀陈小炎,刘也夫．血清肿瘤标志物在原发性肝癌诊断中的研究进展[J]．现代肿瘤医学,２０１９,２７(９):１６２５Ｇ１６２９．[２]㊀L E O NSA,S HA P I R O B,S K L A R O F FD M,e t a l．F r e eD N Ai n t h e s e r u mo f c a n c e r p a t i e n t sa n dt h ee f f e c to f t h e r a p y[J]．C a n c e rR e s,１９７７,３７(３):６４６Ｇ６４６．[３]㊀D AMMA N N R,L IC,Y O O NJH,e t a l．E p i g e n e t i c i n a c t i v a t i o n o fa R A S a s s o c i a t i o n d o m a i nf a m i l y p r o t e i nf r o m t h el u n g t u m o u r s u p p r e s s o r l o c u s３p２１３[J]．N a tG e n e t,２０００,２５(３):３１５Ｇ３１９．[４]㊀D AMMA N N R,S C H A G D A R S U R E N G I N U,S T R U N N I K OＧV A M,e t a l．E p i g e n e t i c i n a c t i v a t i o no f t h eR a sＧa s s o c i a t i o nd oＧm a i n f a m i l y１(R A S S F１A)g e n e a n d i t s f u n c t i o n i nh u m a n c a rＧc i n o g e n e s i s[J]．H i s t o lH i s t o p a t h o l,２００３,１８(２):６６５Ｇ６７７．[５]㊀D AMMA N NR,S C H A G D A R S U R E N G I N U,S E I D E LC,e t a l．T h e t u m o r s u p p r e s s o rR A S S F１Ai nh u m a nc a r c i n o g e n e s i s:a nu p d a t e[J]．H i s t o lH i s t o p a t h o l,２００５,２０(２):６４５Ｇ６６３．[６]㊀S O N G MS,S O N GS J,A Y A DNG,e t a l．T h e t u m o u r s u p p r e sＧs o rR A S S F１Ar e g u l a t e sm i t o s i sb y i n h i b i t i n g t h eA P CＧC d c２０c o m p l e x[J]．N a tC e l l B i o l,２００４,６(２):１２９Ｇ１３７．[７]㊀K H A NFS,A L I I,A F R I D IUK,e t a l．E p i g e n e t i cm e c h a n i s m s r e gＧu l a t i n g t h ede v e l o p m e n t of h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a a n dt h e i r p r o m i s e f o r t h e r a p e u t i c s[J]．H e p a t o l I n t,２０１７,１１(１):４５Ｇ５３．[８]㊀C H A N KC,L A I PB,MO K TS,e t a l．Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o fc i r c u l a t i n g m e t h y l a t e dD N Aa s ab i o m a r k e r f o rh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a[J]．C l i nC h e m,２００８,５４(９):１５２８Ｇ１５３６．[９]㊀WU H C,Y A N G HI,WA N G Q,e t a l．P l a s m aD N A m e t h y l aＧt i o nm a r k e r a n dh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a r i s k p r ed i c t i o nm o de lf o r t h eg e n e r a l p o p u l a t i o n[J]．C a r c i n o g e n e s i s,２０１７,３８(１０):１０２１Ｇ１０２８．[１０]㊀Z H A N G YJ,WU H C,S H E NJ,e t a l．P r e d i c t i n g h e p a t o c e l l uＧl a r c a r c i n o m ab y d e t e c t i o no f a b e r r a n t p r o m o t e rm e t h y l a t i o ni n s e r u m D N A[J]．C l i nC a n c e rR e s,２００７,１３(８):２３７８Ｇ２３８４．[１１]㊀C H A N G H,Y IB,L IL,e ta l．M e t h y l a t i o no f t u m o ra s s o c i a t e dg e n e s i n t i s s u e a n d p l a s m a s a m p l e s f r o m l i v e r d i s e a s e p a t i e n t s[J]．E x p M o l P a t h o l,２００８,８５(２):９６Ｇ１００．[１２]㊀MA U R I Z I O M S,F R A C A N Z A N IA L,T A V A Z Z ID,e ta l．A b e r r a n tm e t h y l a t i o n o f o n c o s u p p r e s s o r g e n e s d e t e c t e d i n t h ep e r i p h e r a l b l o o d o f p a t i e n t sw i t h c h r o n i c h e p a t i t i s Ca n d h e p aＧt o c e l l u l a r c a r c i n o m a[J]．H e p a t o l,２０１１,５４(S１):１０７．[１３]㊀HU A N GZ H,HU Y,HU A D,e t a l．Q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f m u l t i p l em e t h y l a t e d g e n e si n p l a s m af o rt h ed i a g n o s i sa n dp r o g n o s i so fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a[J]．E x p M o lP a t h o l,２０１１,９１(３):７０２Ｇ７０７．[１４]㊀M O H A M E DN A,S W I F YE M,A M I N NF,e t a l．I s s e r u ml e v e l o f m e t h y l a t e d R A S S F１A v a l u a b l ei n d i a g n o s i n g h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a i n p a t i e n t sw i t hc h r o n i c v i r a l h e p a t i t i sC[J]．A r a bJG a s t r o e n t e r o l,２０１２,１３(３):１１１Ｇ１１５．[１５]㊀HU A N G W,L IT,Y A N G W,e t a l．A n a l y s i s o fD N A m e t h y lＧa t i o n i n p l a s m a f o rm o n i t o r i n g h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s[J]．G e n e tT e s tM o l B i o m a r k e r s,２０１５,１９(６):２９５Ｇ３０２．[１６]㊀董晓刚,郭文佳,丁伟．p１６㊁R A S S F１A在肝细胞性肝癌患者肿瘤组织及血浆中异常甲基化的检测及临床意义[J]．中国医药生物技术,２０１６,１１(３):２５２Ｇ２５８．[１７]㊀D o n g X,H o uQ,C h e nY,e t a l．D i a g n o s t i c v a l u e o f t h em e t h y lＧa t i o no fm u l t i p l e g e n e p r o m o t e r s i ns e r u mi nh e p a t i t i sBv iＧr u sＧr e l a t e dh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a[J]．D i s M a r k e r s,２０１７,１０(８):１Ｇ６．[１８]㊀P A S H A H F,MO HAM E D R H,R A DWA N MI．R A S S F１Aa n dS O C S１g e n e sm e t h y l a t i o n s t a t u s a s a n o n i n v a s i v em a r k e rf o rh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a[J]．C a n c e r B i o m a r k,２０１９,２４(２):２４１Ｇ２４７．[１９]㊀Y E M H,C H E NJ,L A IM D．P y r o s e q u e n c i n g a n d i t s a p p l i c aＧt i o n i nc l i n i c a ld i a g n o s i sa n dt h e r a p y[J]．Z h o n g h u aB i n g L iX u eZ aZ h i,２０１３,４２(２):１３８Ｇ１４２．[２０]㊀L U CY,C H E NSY,P E N G H L,e t a l．C e l lＧf r e em e t h y l a t i o n m a r k e r sw i t h d i a g n o s t i c a n d p r o g n o s t i c p o t e n t i a l i n h e p a t o c e lＧl u l a r c a r c i n o m a[J]．O n c o t a r g e t,２０１７,８(４):６４０６Ｇ６４１８．[２１]㊀D O N G X,H E H,Z H A N G W,e ta l．C o m b i n a t i o no fs e r u m R A S S F１A m e t h y l a t i o na n dA F Pi sa p r o m i s i n g n o nＧi n v a s i v eb i o m a r k e r f o rH C C p a t i e n tw i t hc h r o n i c H B Vi n f e c t i o n[J]．D i a g nP a t h o l,２０１５,１０(１):１３３Ｇ１４０．(责任编辑:况荣华)２７南昌大学学报(医学版)２０２０年４月,第６０卷第２期。

RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910658196.6(22)申请日 2019.07.21(71)申请人广州奥百阕谱生物科技有限公司地址 511400 广东省广州市番禺区市桥街大北路永恒大街6号永隆洗衣厂车间楼213-2室(72)发明人陈敏　汪莉　冯德峰　(74)专利代理机构北京汉鼎理利专利代理事务所(特殊普通合伙) 11618代理人潘满根(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)(54)发明名称RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒，所述试剂盒包括茎环状引物，所述茎环状引物用于特异性扩增检测RASSF1A基因的转录起始区上游-1至-187bp中富含CpG岛的序列。

本发明设计的茎环状引物，其能显著提高DNA中甲基化DNA的检出效率，防止非甲基化DNA模板的非特异性扩增；本发明的试剂盒能增加检测肿瘤特异性的同时，提高了检测的灵敏度。

权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页CN 110283913 A 2019.09.27C N 110283913A1.RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括茎环状引物，所述茎环状引物用于特异性扩增检测RASSF1A基因的转录起始区上游-1至-187bp中富含CpG 岛的序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述茎环状引物的3'端序列是根据RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的位点序列进行设计，而所述茎环状引物的5'端序列不能和RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的3'端甲基化序列互补杂交，但可以和非甲基化的3'端序列互补杂交。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述茎环状引物是茎环状上游引物SEQ ID NO:1：AAACACAAACCAAACAAAACCGAAGTCGGGGTTCGTTTTG，其中下划线处为针对亚硫酸盐转化后的基因组DNA互补的特异扩增序列，而非划线部分为茎环形成序列。

RASSF1A甲基化在前列腺癌诊断中的Meta分析

RASSF1A甲基化在前列腺癌诊断中的Meta 分析作者：张建东张雁钢来源：《中国当代医药》2013年第27期[摘要] 目的探讨RAS相关区域家族1A基因（RASSF1A）甲基化在前列腺癌诊断中的意义。

方法收集已发表的关于RASSF1A基因甲基化在前列腺癌与前列腺增生症中报道的国内外文献，针对结果进行统计学综合（Meta）分析。

采用优势比（OR）及95%置信区间（95%CI）评价疗效，统计学分析采用RevMan 4.2软件。

结果共9篇文献符合纳入标准，包括前列腺癌组541例和前列腺增生组258例的RASSF1A甲基化研究结果，Meta分析显示，研究文献中总的OR值及95%CI均在垂直线的右侧（OR=6.39，95%CI为4.32～9.46），差异有统计学意义（P[关键词] RAS相关区域家族1A基因；甲基化；前列腺癌；诊断[中图分类号] R737.25 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（c）-0010-04前列腺癌（prostate cancer，PCa）是老年男性的常见疾病，在欧美发病率较高。

目前，在美国PCa的发病率已经超过肺癌，成为威胁男性健康的第一位肿瘤。

随着我国人均寿命的不断增长，饮食结构的改变及诊断技术的不断提高，近年PCa发病率迅速增高。

局限性早期PCa，早期发现可以得到有效的治疗或可以达到治愈。

但是，接近90%的患者发现时已发生骨转移，失去手术治疗的机会。

PCa发生骨转移后中位生存时间为9～12个月[1-2]。

目前，PCa的筛查依赖于血清前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、超声和直肠指检。

但是，直肠指检和超声发现肿瘤时，多数患者已属于疾病进展期或晚期。

血清PSA的检测用于PCa的早期筛查后，提高了PCa的诊断率。

但是，其仍存在许多不足：①PSA筛查的敏感性较低，只有约30%PSA阳性筛查者病理证实为PCa[1]；②PSA值在灰阶的患者，穿刺活检阳性率更低，研究表明PSA在3～15 μg/L时，穿刺活检阴性率为70%～80%[2]；③PSA值低于阈值时，仍有患PCa的可能，例如，Thompson等[3]对9459例PSA肿瘤是多因素参与、多基因变异积累、多阶段发生的复杂的病理过程。

RASSF1A基因在肿瘤发生发展中的作用

展起着重要作用。１９９８年，ｅｉｏ等在肺癌及乳腺癌细胞系的Ｓｋｄ
ｇｃｓｕａｄ蛋白的磷酸化位点。ＡＭ蛋白是人共济失调ｉｔｉｍｔｔ）ｅａａｅＴ
一
研究中发现３２．ｐ１３存在１个１０ｂ长的最小纯合缺失区，此２ｋ据
关。大量研究发现，抑癌基因的失活与其启动子高甲基化有密切关联 …。Ｒｓａ相关区域家族１ＲｓａｓｃｔｎｄｍｉｆｍｌＡ（ａｓｉｉｏａａｉｏａｏｎｙ
１ＲＳＦＡ）２０发现的新型候选肿瘤抑制基因（ｕｒＡ，ＡＳ１是００年ｔｍｏｓｐｒｓｏｇｎ，Ｓ）Ｒｓ因是人类肿瘤研究中１种重要的ｕｐｅｓｒｅｅＴＧ。ａ基
葛东峰综述
关键词：ＡＳ１肿瘤抑制基因；ＲＳＦＡ；甲基化中图分类号：７０２Ｒ３．３文献标识码：Ｂ
姚运红审校
癌等许多实体肿瘤中存在着较高的表达缺失Ｊ由此推断。ＲＳＦＡ基因可能是１ＡＳ１种重要的候选肿瘤抑制基因。２ＡＳ１ＲＳＦＡ作用机制
路的信号传导，阻断Ｒｓ生长效应信号由细胞外传向细胞内，ａ使其丧失介导细胞分化、促进细胞增殖和激活原癌基因的功能，从而发挥抑制肿瘤的作用。目前认为可能有２种机制可以解释其抑制肿瘤生长的作用：ＡＳ１ ①ＲＳＦＡ蛋白通过抑制Ｒｓａ激活生长效应信号的传导途径而发挥抑癌作用；ＡＳ１蛋白的失活 ②ＲＳＦＡ导致Ｒｓａ作用的失衡，使其主要发挥促进生长的作用Ｊｈｖ－。Ｓｉａｋｍａ等研究发现，ＲＳＦＡ瞬时转染人不表达该基因的ｕｒ将ＡＳ１肺腺癌细胞株Ｈ１９２９后发现，胞周期被阻断在Ｇ．细，Ｓ期。ＲＳＦＡ蛋白可能是细胞周期蛋白Ｄ（ｙｌＤ）ＡＳ１１ｃｃｉ１的抑制蛋白，ｎ其通过抑制内源性ｃｃｉ的积累，ｙｌＤ１ｎ并能增强ｐ２（４）ｃ— １０ＥＦ和ｙｅｎ２基因启动子结合，ｌＡｉ抑制ｅｃｉ２的表达，ｙｌＡｎ从而阻滞细胞从

医学论文基因RASSF1B、RASSF1F在肿瘤细胞中转录表达及临床意义

基因RASSF1B、RASSF1F在肿瘤细胞中转录表达及临床意义摘要：株肿瘤细胞总RNA的提取结果。

基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。

关键词：肿瘤细胞，RASSF1基因家族，转录，RAS家族近年来较多研究都发现染色体3P21.3等位缺失在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌等常见肿瘤中频繁发生，推测该位点可能存在一个或多个肿瘤抑制基因。

2000年，Dammnn等[1]利用酵母双杂交筛选的方法从3P21.3内120 kb长最小纯合缺失区分离出一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因，由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)与小鼠RAS相关区域家族1（RAS association domainfamily 1）与小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源，遂命名为RAS相关区域家族1，即RASSF1基因。

由于选择性剪切和不同启动子的使用，RASSF1基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。

有研究发现RASSF1能直接参与细胞周期的调控医学论文，在体内和体外能抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡[2]。

最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因段的丢失，DNA 核苷酸序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与抑癌基因DNA核苷酸序列中的胞嘧啶核苷酸（C）和鸟嘌呤核苷酸（G）二联连结中（CpG）的胞嘧啶碱基环中的第5位碳原子上所发生的甲基化具有极其重要的相关性[4]。

抑癌基因R ASSF1的表达作用机制已经初步明确,但其转录本基因在恶性肿瘤中的作用研究较少，尤其是RASSF1B,RASSFIF在肿瘤细胞中的表达比较还未见相关报道。

本文旨在通过RT-PCR的方法，检测五种常见的肿瘤细胞中RASSF1家族中RASSF1B,RASSF1F不同转录本的表达情况，为基因治疗提供理论基础。

1 试验材料与方法1.1 试验材料5株肿瘤细胞AGS（胃腺癌）、95D（高转移肺癌）、LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)和U937（白血病细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MMLV 反转录试剂盒购于Promega公司。

肺癌早期诊断本可以更精准——SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测

肺癌早期诊断本可以更精准——SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测不多说，先上两个肺癌案例：病例1:病史就诊上海某专科三甲医院患者情况男性63岁，吸烟史30年，6000⽀/年;体检胸部CT提⽰“左肺下叶结节，考虑恶性病变可能性⼤；两肺慢性炎症临床诊断于2018-04-12⾏⽀⽓管镜经左B5a亚段进⾏先⽑刷刷检，后活检取样。

刷检直接涂⽚检测：见异型细胞团刷检⽑刷洗脱细胞甲基化检测：SHOX2 和 RASSF1A 双甲基化检出活检病理提⽰：数⼩⽚肺组织，倾向肺腺癌初步诊断肺恶性肿瘤病例2：病史就诊郑州某三甲医院患者情况⼥性54岁，⽆吸烟史;因“咳嗽咳痰，胸痛1⽉余，⽓促10天”门诊⼊。

临床诊断于2018-05-02⾸次⾏⽀⽓管镜，取得肺泡冲洗液15ml。

肺泡冲洗液细胞学TCT：可见增⽣的⽀⽓管上⽪细胞，并见少量中性粒细胞及淋巴细胞，未见其他异常肺泡冲洗液甲基化检测：SHOX2 甲基化未检出，RASSF1A 甲基化检出于2018-05-16⾏纵隔淋巴结穿刺活检病理提⽰：恶性肿瘤，待免疫组化协诊免疫组化结果：⼩细胞癌CD56（+）,CgA（+），CK（点状+），CK7（少数鳞状+），Ki-67（70%+），NSE（+），P40（-），PAX-8（-），Syn（+），TTF-1（+）。

初步诊断肺恶性肿瘤注意到病例中的“甲基化检测”了没？这是透景⽣命最新推出的新⼀代肺癌甲基化联合细胞学诊断产品——Lung-MeTM，应⽤国家专利的双靶点SHOX2 + RASSF1A甲基化基因组合，可提供早于常规肿瘤标志物检测的肺癌早早期分⼦诊断信息。

检测样本本试剂盒主要使⽤肺泡灌洗液、肺泡冲洗液及刷检洗脱液等肺部疾病特异性样本，⽤于肺癌⾼危⼈群的良恶性鉴别诊断。

主要⽤途任⼀基因检出甲基化即定义为样本甲基化检测阳性，提⽰肺部病变恶性的可能性增加；两基因同时未检出甲基化则定义为样本甲基化检测阴性，提⽰肺部病变良性的可能性增加，但不排除恶性的可能。

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文章编号：1673-8640（2012）07-0554-03中图分类号：Q503文献标志码：A白血病患者RASSF 1A 基因甲基化状态及其临床意义陈卫群1，黄琛2，詹喜炎2，刘水逸2，余洁2，张红梅2，卢忠心1（1．武汉市中心医院中心实验室，湖北武汉430014；2．武汉市中心医院检验科，湖北武汉430014）摘要：目的研究白血病患者骨髓中Ras 相关区域家族1A （RASSF 1A ）基因启动子甲基化状态及其临床意义。

方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR ）检测86例白血病患者和60例非白血病患者对照组骨髓中RASSF 1A 基因启动子的甲基化状况，分析不同白血病类型之间的差异。

结果86例白血病患者中，有12例（13．95%）RASSF 1A 基因启动子甲基化，而60例非白血病患者骨髓均未检测到甲基化，二者比较差异均有统计学意义（P ＜0．05）。

淋巴系白血病患者RASSF 1A 基因甲基化比例（23．1%）明显高于髓系白血病患者（6．4%）（P ＜0．05）。

结论白血病患者骨髓中存在RASSF 1A 基因甲基化，淋巴系白血病甲基化比例明显高于髓系白血病。

RASSF 1A 基因甲基化检测可能成为白血病分型的生物标志物之一。

关键词：白血病；Ras 相关区域系统1A 基因；甲基化；生物标志RASSF 1A gene methylation and its clinical significance in leukemia patients CHEN Weiqun 1，HUANGChen 2，ZHAN Xiyan 2，LIU Shuiyi 2，YU Jie 2，ZHANG Hongmei 2，LU Zhongxin 1．（1．Central Laboratory ，the CentralHospital of Wuhan ，Hubei Wuhan 430014，China ；2．Department of Clinical Laboratory ，the Central Hospital of Wuhan ，Hubei Wuhan 430014，China ）Abstract ：ObjectiveTo research Ras association domain family 1A （RASSF 1A ）gene promoter regionmethylation in bone marrow of leukemia patients and its clinical significance．MethodsMethylation of RASSF 1A genepromoter region was detected by methylation specific polymerase chain reaction （MS-PCR ）in the bone marrow of 86leukemia patients ，and the difference of different kinds of leukemia was analyzed．A total of 60non-leukemia subjects were enrolled as controls．ResultsTwelve of 86（13．95%）leukemia patients had RASSF 1A gene promoter regionmethylation．No methylation was found in bone marrow of the control group ，and there was a statistical significance （P ＜0．05）．RASSF 1A gene methylation ratio in lymphoid leukemia （23．1%）was higher than that in myeloid leukemia （6．4%）（P ＜0．05）．ConclusionsLeukemia patients have RASSF 1A gene methylation．The ratio ofRASSF 1A gene methyaltion in lymphoid leukemia is obviously higher than that in myeloid leukemia．RASSF 1A gene methyaltion may be a significant parameter for diagnosis and genotyping of patients with leukemia．Key words ：Leukemia ；Ras association domain family 1A gene ；Methylation ；Biomarker基金项目：国家自然科学基金（81071921）；湖北省自然科学基金（2010CDB09002）；武汉市卫生局基金（WX08D11）作者简介：陈卫群，女，1968年生，副主任技师，主要从事肿瘤标志物与基因治疗研究。

通讯作者：卢忠心，联系电话：027-82211532。

白血病是造血系统的恶性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一。

我国白血病患者约为3 4人/10万人。

小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高，每年至少以3 4万的速度增加。

目前白血病的发病机制尚不十分清楚，一般认为白血病的发生与理化因子（如核辐射、苯中毒等）有密切的联系。

Ras 相关区域家族1A （RASSF 1A ）基因是2000年新发现的抑癌基因，其甲基化与许多肿瘤相关，但其与白血病的关系还不清楚。

我们以不同类型的白血病患者为研究对象，用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction ，MS-PCR ）检测其骨髓RASSF 1A 基因甲基化水平，探讨RASSF 1A 基因甲基化与白血病的发生和变化之间的关系。

材料和方法一、研究对象收集86例经骨骼穿刺病理细胞学确诊的白血病患者骨髓，男41例，女45例，年龄22 87岁。

其中急性髓系白血病（AML ）24例、慢性髓系白血病（CML ）23例、急性淋巴系白血病（ALL ）19例、慢性淋巴系白血病（CLL ）20例。

同时收集60例因贫血或发热原因待查经骨骼穿刺病理细胞学确诊为非白血病患者骨髓作为对照组，男28例，女32例，年龄22 80岁。

二、仪器与试剂QIAamp DNA kit试剂盒购自美国QIAGEN 公司；甲基化修饰试剂盒购于ZYMO RESEARCH 公司；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购于TaKaRa公司；引物由上海生工公司合成；聚合酶链反应（PCR）仪为美国BIO-RAD CFX96荧光定量PCR仪；核酸检测仪为美国Beckman DU730紫外可见分光光度仪。

三、MS-PCR检测RASSF1A基因甲基化应用QIAamp DNA kit试剂盒提取总DNA，提取核酸用紫外分光光度计检测纯度，于-80ħ保存。

按EZ DNA Methylation Kit试剂盒说明将提取的DNA未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，转化后的样本进行PCR扩增。

引物序列为：甲基化引物5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3'和5'-AAC CCCGCGAACTAAAAACGA-3'；非甲基化引物5'-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3'和5'-CAAACC CCACAAACTAAAAACAA-3'。

反应体系为25μL，反应条件为：95ħ预变性10min，95ħ变性1 min，65ħ退火1min，72ħ延伸1min，共35个循环，最后一轮72ħ延伸10min。

扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。

以已知甲基化细胞系K562和非甲基化细胞系RPMI8226提取DNA 混合物作为甲基化和非甲基化的阳性对照，以不含DNA的水作为阴性对照。

四、统计学方法采用SPSS13．0软件进行统计学分析。

组间比较采用卡方检验，P＜0．05表示差异有统计学意义。

结果一、RASSF1A基因启动子甲基化检测结果86例白血病患者骨髓中有12例（13．95%）检出甲基化条带，而60例非白血病患者均未检出甲基化条带，二者比较差异有统计学意义（χ2= 9．122，P=0．001）。

见图1，表1。

注：Marker为DNA标志；M为甲基化；U为非甲基化；Control为已知甲基化细胞系K562和非甲基化细胞系RPMI8226提取DNA混合物作为甲基化和非甲基化的阳性对照；H2O为不含DNA的水（阴性对照）；P4、P10、P11、P15、P22为患者样本图1白血病患者RASSF1A基因启动子甲基化状态二、RASSF1A基因启动子甲基化与白血病分型的关系淋巴系白血病患者骨髓中RASSF1A基因甲基化率（23．1%）明显高于髓系白血病患者（6．4%）（P＜0．05）。

髓系白血病中AML患者的骨髓甲基化率为8．3%，而CML患者为4．3%，二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。

淋巴系白血病中ALL患者的骨髓甲基化率为26．3%，而CLL患者为20．0%，二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。

见表1。

表1白血病患者RASSF1A基因启动子甲基化状态组别例数甲基化例数甲基化率（%）χ2值P值白血病组4．9470．028髓系白血病4736．40．3560．500 AML2428．3CML2314．3淋巴系白血病39923．10．2190．465 ALL19526．3CLL20420．0急性白血病43716．30．3870．378慢性白血病43511．6讨论肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，表现为抑癌基因与修复基因的高甲基化与癌基因的去甲基化。

基因的甲基化沉默机制有2种：（1）由于启动子区的甲基化导致启动子区结构改变，启动困难；（2）甲基化引起组蛋白脱乙酰化而致染色质结构改变，关闭基因［1］。

RASSF1A基因是2000年新发现的候选抑癌基因，位于染色体的3p21．3。

作为Ras的负性调控分子，RASSF1蛋白通过抑制细胞内Cyclin D1聚积、抑制cdc20介导的APC活性、维持微管的稳定等途径诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期进程。

RASSF1A基因缺失和启动子区高甲基化是大多数人类肿瘤组织的频发事件，是RASSF1A基因失活的主要机制［2-3］。

多数肿瘤组织RASSF1A基因启动子区甲基化的发生率为35% 60%，小细胞肺癌（72% 79%）、肝癌（66．7% 95%）、鼻咽癌（67% 84%）等具有更高的甲基化发生率。