高中生物热点课题6血红蛋白的提取和分离温习学案新人教版选修1

课题六 血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生

物大分子的大体进程和方式，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的大体原理，为此

后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方式。

课题难点：样品的预处置；色谱柱填料的处置和色谱柱的装填。

【导学诱思】

思考1：分离生物大分子的大体思路是什么？

思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？

思考3： 高温灭菌和酒精灭菌别离利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？

思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA ，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

一、基础知识：

㈠ 凝胶色谱法（分派色谱法）：

一、概念：按照被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作

用，来分离蛋白质的有效方式。

二、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋

白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，

移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3、具体进程：

A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。

B.（1） 混合物上柱；

颗

相对量较相对量较（1）

（2） （3） （4） （5） B A

（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；

（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。

（4）不同的蛋白质分子完全分开；

（5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。

㈡缓冲溶液：

一、概念：在必然的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或略加稀释不引发溶液PH发生明显转变的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

二、作用：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH大体不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以够制得利用的缓冲液。

思考：说出人体血液中缓冲对？

思考：在血红蛋白整个实验室顶用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

利用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）

㈢电泳：

一、概念：指发生迁移的进程。

二、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有在下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其

移动。电泳利用了待分离样品中各类分子和分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各类分子的分离。

3、分类：

①电泳

②电泳。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少和分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是。SDS能与各类蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷不同，使电泳迁移率完全取决于。

二实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处置——粗分离——纯化——纯度鉴定

1.样品处置

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除

②方式：离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将基层的红细胞液体倒入

再加入用的质量分数为％的氯化钠溶液洗涤

⑤低速离心（低速短时间）

⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

(2)血红蛋白的释放

加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细

胞破裂释放出血红蛋白.

(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:

第1层（最上层）：甲苯层

第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体

第3层（中基层）：的水溶液层，的液体

第4层（最基层）：其它杂质的沉淀层

(4)透析

思考：与其它真核细胞相较，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断何时应该搜集洗脱液。这使血红蛋白的分离进程超级直观，大大简化了实验操作。

思考：你能描述血红蛋白分离的完整进程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处置、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即样品的处置；再通过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。

课堂练习1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 ( )

A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快

2.蛋白质提取和分离分为哪几步 ( )

A．样品处置、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处置、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处置、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处置、纯化、粗分离、纯度鉴定

3. 在血红蛋白的整个提取进程中，不断用磷酸缓冲液处置的目的是 ( )

A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取进程 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．避免血红蛋白被02氧化 D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

4．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极周围的颜色逐渐加深，这说明 ( )

A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动

C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

5.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）

A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

综合测试题

一、选择题（共30小题，每小题2分，共60分。每题只有一个选项最符合题目要求，多选少选都不得分。）

一、用化学成份不清楚或不恒定的天然有机物配成的培育基称为

A．天然培育基 B．半合成培育基 C．合成培育基 D．加富培育基

二、琼脂在培育基中的作用是

A．碳源 B．氮源 C．凝固剂 D．生长因子

3、培育基的配制需要运用灭菌技术。下列关于灭菌的叙述中，正确的是