2005版《中国药典》微生物限度检查修订内容

试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
48.1
96.3
43.0
97.5
52.5
94.9
50
银翘解毒片-枯草杆菌(低速离心+稀释法)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
72.2
97.2
78.5
96.4
75.0
97.5
法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基
或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板
上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。
27
菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落 数报告；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数 （每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或乘以稀释 倍数的值报告菌数。
18
●细菌培养温度:30～35℃。 ●霉菌、酵母菌培养温度:23（25）～
28℃。 控制菌培养温度:35～37℃ ●结果报告：以1g、1ml、10g、10ml 或
10cm2 为单位报告。
19
（2）检验量
● 抽样量 ：随机抽取不少于检验量（两个 以上最小包装单位）的3倍。
● 检验量：一次试验所用的供试品的量。 一般为10g或10ml；中药膜剂50 cm2， 化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包 装的药品酌减（不得少于3g）。
微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏 剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、 酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏 剂(贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂.
不要求：膏药。
13
3、2005版三部制剂通则项下的微生物限度要求
❖ 无菌检查：注射剂、外用溶液剂、灌洗剂。
❖ 微生物限度检查：片剂、栓剂、胶囊剂、散剂、 颗粒剂、气雾剂。
●检查沙门菌的供试品其检验量改为10g 或10ml。从2个包装以上取样。
20
（3）供试液制备
● 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有 效性及对微生物的生长和存活无影响。
● 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超 过1小时。
● 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超 过45℃。
● 供试液的体积：100ml。
31
三、药品微生物限度检查法的验证
32
（一）概述 ● 验证的目的: 确认所采用的方法适合于
供试品的微生物限度检查。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、
可靠及检验方法的完整性。
33
● 验证的必要性
理论上要求、试验结果要求
● 验证的内容
准确性(回收率)、专属性
34
●验证的类型 ▲前验证: 建立药品的微生物限度检查法时. ▲ 再验证: 修订的检验方法;供试品的组分或
大肠埃希菌大肠菌群含药材原粉及豆豉神曲等发酵成分制剂沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌阴道尿道给药制剂20052005用于手术烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂眼部给药制剂由100不得检出10不得检出耳鼻及呼吸道吸入给药制剂阴道尿道给药制剂含生药原粉的深部用药破伤风杆菌梭菌直肠给药制剂其它局部给药制剂104兼用给药途径的制剂应符合各给药途径的标准11五2005版制剂通则项下微生物限度要求1212005版化学药制剂通则项下的微生物限度要求无菌检查
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●供试品分类 ❖ 液体供试品 ❖ 固体、半固体或黏稠液性供试品 ❖ 需用特殊供试液制备方法的供试品
非水溶性供试品 膜剂供试品 肠溶及结肠溶制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品 具抑菌活性的供试品
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● 非水溶性供试品 ：增加“十四烷酸异丙酯法” （如油溶膏剂等） 。
●结肠溶制剂供试品 ：用pH7.6无菌磷酸盐 缓冲液溶解。
●气雾剂、喷雾剂供试品：冷冻1小时，放尽抛射剂， 药液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨B.S。
● 具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作 性（细化）。
23
（4）灭菌
培养基及稀释剂等灭菌:采用验证合格 的灭菌程序进行灭菌。
24
（5）稀释剂
稀释剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（增 加检出率，对被破坏的微生物有
5
（三）、2005年版微生物限度标准的控制 项目
●杂菌数：细菌数 霉菌和酵母菌数
●控制菌（致病菌）:大肠埃希菌 大肠菌群（含药材原粉及 豆豉、神曲等发酵成分制剂） 沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌（阴道、尿道给药制剂）
6
（四）2005年版微生物限度标准的 分类
1. 制剂通则、品种项下要求无菌的制剂 及标示无菌的制剂，应符合无菌检查 法规定。
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组稀释剂对照组13.196.9
15
90
9.7
93.5
48
银翘解毒片-枯草杆菌(稀释法-5个平皿)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
32.3
96.5
40.3
95.8
36.7
92.8
49
银翘解毒片-枯草杆菌(稀释法-10个平皿)
37
●验证方法：至少进行3次独立的平行试验
●试验组 ●菌液组 ●供试品对照组 ●稀释剂对照组
38
●结果判断：供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的 菌回收率。
❖ 试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品 对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 ]×100%
❖ 稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均 菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100%
●判断标准: 菌回收率均不低70% 。
39
（三）控制菌检查法的验证
●试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。 ●阴性对照菌株:设立阴性对照菌是为了验证该控制菌检查方法
的专属性。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃 希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌。 ●菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。 ●菌液制备:10～100cfu/ml。
微生物限度检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂 、 口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、 糖浆剂、膜剂、贴剂 、灌肠剂 、糊剂 、涂剂、涂膜 剂。
原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。 12
2、2005版中药制剂通则项下的微生物限度要求 无菌检查：注射剂。
无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制 剂、鼻用制剂、气雾剂、喷雾剂。
原检验条件发生改变可能影响检验结果 时 ;定期的方法验证.
35
（二）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
●验证用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、黑曲霉、枯草杆菌。
●菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。
●菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。 ●菌液制备:50～100cfu/ml。
40
●验证方法：试验组 阴性菌对照组
●结果判断：试验组应检出 阴性菌对照组不得检出
41
（四）药品微生物限度检查法验证试验 结果不符合要求的处理方法
●中和法 ●培养基稀释法 ●薄膜过滤法 ●离心沉淀法 ●联合方法
42
四、药品微生物限度检查法验证示例
43
银翘解毒片-金黄色葡萄球菌(常规法)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
92.5
96.3
90.1
94.4
91.1
93.3
44
银翘解毒片-大肠埃希菌(常规法)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
91.8
97.9
89.8
94.4
90.1
96.7
45
银翘解毒片-白色念珠菌(常规法)
36
❖ 1．取经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯
菌液的制备 草杆菌、铜绿假单胞菌 10104肉汤培养物、 生孢梭菌 64941硫
乙醇酸盐培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5 ~10-7为50~100个 /ml，做活菌计数备用 ❖ 2．取经25℃ 培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物 1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 ~10-6为50~100个/ml，做活菌计数 备用 ❖ 3．取经25℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml盐水洗 下霉菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管比浊，与浊度相当后， 取1 ml +9 ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50~100个/ ml， 做活菌计数备用
28
（7）控制菌检查
●修订特点: 减少篇幅 不作具体生化试验的规定 增加鉴定方法 适应微生物分类变化要求 增加控制菌检查项
29
●修订的检查法 大肠埃希菌检查法、铜绿假单胞菌检查法、 沙门菌检查法、金黄色葡萄球菌检查法。
●新增的检查法 大肠菌群检查法（近期、远期污染）、梭菌检
查法检查法。
30
●供试品的控制菌检查应按已验证的方法 进行，增菌培养基的实际用量同控制 菌检查方法的验证。
2005版《中国药典》 微生物限度检查 修订内容
辽宁省药品检验所
赫爱平、张雅杰
2005年5月
1
一、2005年版药典微生物限度标准修订 情况
二、2005年版药典微生物限度检查法的 修订情况
三、药品微生物限度检查法的验证
2
一、2005年版药典微生物 限度标准修订情况
3
（一）、2005年版微生物限度标准的制订原 则
❖ 注射用水：微生物限度 取本品至少200ml，采用薄膜 过滤法处理后，依法检查（附录Ⅺ J），细菌、霉菌和 酵母菌总数每100ml不得过10个。
15
二、2005年版药典 微生物限度检查法
的修订情况
二 0 0四 年 十 月
16
（一）微生物限度检查法
起草的指导思想: 完善检查法. 增加试验的可操作性. 使方法更具科学性，保证检验结果的准确性. 与国际接轨.
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
91.5
94.9
92.3
96.2
91.5
97.1
46
银翘解毒片-黑曲霉(常规法)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
92.5
95.7
91.4
98.3
90.8
96.9
47
银翘解毒片-枯草杆菌(常规法)
9
❖ 4、兼用给药途径的制剂，应符合各给药 途径的标准
10
（五）、2005版制剂通则项下 的
微生物限度要求
11
1、2005版化学药制剂通则项下的微生物限度要求 无菌检查：注射剂、植入剂、冲洗剂。
无菌检查及微生物限度检查：软膏剂、眼用制剂、气雾 剂 、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂
、 乳膏剂 。
51
银翘解毒片-枯草杆菌(低速离心+薄膜过滤法)
果。 ●菌数报告规则：（1）、（2）、（3）、（4）。
26
②薄膜过滤法
方法：滤膜、材质、过滤等相关要求。
操作注意：避免微生物受损，降低检出。
取相当于1g或1ml供试品的供试液lml直接过滤，或加至
100ml稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓
冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方
复 苏作用）
pH6.8无菌磷酸盐缓冲液
pH7.6无菌磷酸盐缓冲液
25
（6）细菌、霉菌、酵母菌计数①平皿法
●培养时间:必要时，可适当延长培养时间至5～7天 . ●点计：逐日点计. ●同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时，则两个平板菌落数不能
相差1倍或以上。 ●培养基平板上生长特殊菌落：以菌落数高的培养基中的菌数为记数结
17
（二）增、修订内容（1）总则
● 操作环境 洁净度：微生物限度检查应在环境洁净度10000级
下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。 洁净度定期检测:单向流空气区域、工作台面及环境 应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮 游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进 行洁净度验证。
❖2000年版：细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订；
控制菌（致病菌）按给药途径制订。
❖2005年版：均按给药途径制订。 ❖理由：同一剂型有不同的给药途径；新剂型的出现；
国外药典的限度标准制订原则
4
（二）、2005年版微生物限度标准的 应用
本版药典明确指出:药品的生产、贮存、 销售过程中的检验,原料及辅料(中药提 取物及辅料)的检验, 新药标准制订,进口 药品标准复核,考察药品质量及仲裁等, 除另有规定外，其微生物限度均以本标 准为依据。
7
2.口服给药制剂
●不含药材原粉的制剂 ●含药材原粉的制剂 ●含豆豉、神曲等发酵成分的制剂
8
3. 局部给药制剂
⑴ 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂（无菌） ⑵用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂 ⑶用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂 ⑷眼部给药制剂（由100，不得检出→10，不得检出） ⑸耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 ⑹阴道、尿道给药制剂（含生药原粉的深部用药，破伤风杆菌→梭菌） ⑺直肠给药制剂 ⑻其它局部给药制剂
❖ 无菌检查或微生物限度检查：软膏剂、乳膏剂、 凝胶剂、喷雾剂、眼用制剂、鼻用制剂。
14
（六）、品种项下的微生物限度要求
❖ 辅料：乳糖、淀粉、糊精、玉米朊、精制玉米油等。
❖ 纯化水：微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后， 依法检查（附录Ⅺ J），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml 不得过100个。