微加工技术

7.2 与生物芯片制备相关的微加工技术
一提起“生物芯片”，人们很自然就会联想到近几十年来曾使我们的生产和生活发生重大变化的集成电路芯片，因此也常常把它理解为一种利用生物分子实现计算和数据处理功能的芯片。

的确有不少人在进行这种生物计算机的研究，但我们这里所说的生物芯片是指目前发展非常迅速的一项热门技术。

它与集成电路芯片有着本质区别：它处理的并不是电信号，也不具有运算功能，而是一种以生物分子为处理对象、执行生化分析检测的微型设备。

不过二者还是有很密切的联系，除了都有集成化、微型化、可对信号进行并行处理等特点以外，它们在制作工艺和材料方面也很相似。

生物芯片的制备所依赖的正是集成电路工业中应用十分成熟的光学光刻技术（photolithography）和微机电系统(Micro Electromechnical System, MEMS)及其他精密仪器加工中所采用的各种微细加工方法，如反应离子刻蚀(Reactive Ion Etching)、LIGA(Lithograghie, Galvanoformung und Abformung) 技术、激光切削/打孔（Laser Ablation/Drilling）、压模（Imprinting Method）, 微注塑（Microinjection Molding），热塑（Hot Embossing）等等[1]，在这里我们把它们统称为微加工（Microfabrication）技术。

简单地说，生物芯片是指能对生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件[2]。

按其结构及工作机理可将其分为微阵列芯片（Microarray chip）和微流体芯片(Microfluidic chip)两大类[3]。

微阵列芯片是将基因的片段（DNA或RNA）、蛋白质（如抗体）、细胞组织等生物样品，以微点样技术或其它技术固定在玻璃片等基片上制作形成的。

而微流体芯片则是微阵列芯片的延伸（有人将微阵列芯片称为第一代生物芯片，而将微流体芯片称为第二代生物芯片），它通过在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的各种微结构以及用于液体样品输运和控制的微泵、微阀等器件，将生命科学中许多不连续的过程如样品制备、化学反应和分离检测等步骤移植到芯片中并使其连续化和微型化，以获得所谓的微型全分析系统（Micro Total Analytical System，μTAS）或缩微芯片实验室（Lab –on-a-chip）。

两种芯片技术之间虽有少量交叉，但基本经历了各自独立的发展过程。

下面将对这两种芯片的制备技术分别进行介绍。

7.2.1生物芯片常用材料
由于生物反应多种多样，而不同的生物反应需要在不同的材料中进行，为了
能够在芯片上完成这些反应，制作芯片的材料就必须多种多样，如硅、玻璃、塑料以及陶瓷等[4]。

这其中，硅是比较常用的一种材料，这是由于在微电子领域，人们已经摸索出了一整套成熟的硅加工工艺。

对于需要温度控制的生物反应，例如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），链置换扩增（strand displacement amplification, SDA）等，由于硅具有良好的导热性，更是成为人们的首选。

但是硅的缺点是不透明，不利于光学检测，并且具有一定的导电性，尤其是具有比较强的表面非特异性吸附。

因此在制作毛细管电泳芯片时，人们一般不选用硅，而选用玻璃或者塑料。

同时在使用生物芯片时，必须考虑到生物相容性问题，而玻璃、塑料表面所具有的各种功能基团使其很容易进行化学修饰，从而使其生物兼容性大大提高。

再加上玻璃和塑料的价格相对较便宜，加工也比较方便，因此有许多种芯片是用玻璃或者塑料制作的[5] [6]。

7.2.2微阵列芯片制备中的微加工技术
微阵列芯片制备的关键是组成微阵列的生物分子探针的制备及固化。

目前探针制备的基本方法大致有原位合成法（光刻原位合成，分子印章原位合成等）和合成点样法（点接触法，喷墨法等）[7]。

美国Affymetrix公司采用的半导体光刻原位合成法[8]，是把半导体工业中的光刻技术和DNA的化学合成方法相结合，把光不稳定保护基团保护的四种DNA 模块固定在玻片上，通过光脱保护，由少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进行DNA合成。

该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成大量的探针阵列，合成速度快。

例如：合成48（65536）个探针的8聚体寡核苷酸全序列仅需要4×8＝32步，8小时就可以完成，而如果用传统方法合成然后点样，则工作量的巨大是不可思议的。

同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达106/cm2。

但它也存在一些缺点，如合成反应产率较低，不到95％以上；探针长度较短，且每步去保护不很彻底，会导致杂交信号比较模糊，信噪比降低，为此有人用电子射线核酸作为保护剂，以提高产率及点阵密度。

此外，掩模的制造十分繁杂，既费时，又昂贵，也是其缺点之一。

另一种是美国Incyte Pharmaceutical公司采用的压电打印法（Piezoelectronic printing）进行原位合成[9]。

其技术原理与喷墨打印机相似，有打印机头在方阵上移动，在方阵每点上电流使喷头放大，并将装有某种碱基的试剂滴出μl到芯片
表面，然后固定。

在洗脱和去保护后，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。

合成的探针可达40－50mer，每步产率可达99％。

压电印刷法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。

合成点样法是采用传统的分子生物学合成所需的DNA探针，通过特定的高速精密机器手直接点在芯片上。

Stanford大学首创的接触式点涂法[10]就是通过使用高速精密机械手所带的移液头与玻璃芯片表面接触而将探针定位点滴到芯片上的。

常用的机械手有一套计算机控制的三维移动装置，多个打印头/碰印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。

根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置，打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印和喷印于芯片上。

直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时，针头与芯片保持一定距离。

二者比较，打印法的优点是探针密度高，缺点是定量准确性及重复性不好，打印针易堵塞，且使用寿命有限。

喷印法的优点是定量准确、重现性好，使用寿命长，缺点是斑点大，探针密度低。

与原位合成相比，合成点样法所需的DNA探针需事先合成、纯化，且需将如此大量且具有微小差别的片断分别保存。

但是合成的探针长度可达500－5000mer，所以杂交错配的可能性也就是选择性有较大的改善，可以逐句破译序列密码而不是逐字阅读序列。

当一个基因芯片点成之后，需要对其进行紫外线交联固定，即得到DNA微阵列或芯片。

7.2.3 微流体芯片制备中的微加工技术
微流体芯片的微加工技术最初也是从微电子工业中应用十分成熟的硅平板印刷技术中借用过来的。

该技术与扩印相片的原理是相似的，所不同的只是硅片取代了印相纸，具有微细结构的掩模取代了底片。

该技术的第一步是通过光学制板照相制备所需的掩模。

制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板，该铬层事先已按所需形成的微细结构图形刻蚀成了透光和不透光的两个部分。

第二步进行光学光刻。

首先将光刻胶（一种对光敏感的聚合物）涂在硅片上，然后让掩模与硅片接触，光源通过掩模照射到硅片上。

通过显影光刻胶中的图形，使其不需要的部分被溶解除去。

接下来通过对无胶保护的硅片用腐蚀剂蚀刻，再去除剩余的光刻胶便可获得所需芯片的微细结构[2]。

涂胶、光刻、刻蚀组成了工序的三个基本步骤。

对于某些集成的微型化器件来说，这样的工序可能要重复很多次，每次
可对不同材料的沉积层用不同图案的掩模来加工。

随着生物芯片的发展，其中的微结构和器件越来越复杂，所用的材料也不仅限于硅，相应的微加工方法也有了很大的扩展，包括了微机电系统以及其它精密仪器制作中的各种加工方法。

下面对生物芯片制备中常用的微加工技术分别进行介绍。

一、薄膜制备技术[11][12][13]
我们知道，生物芯片制备过程中的每一道工序就是通过特定形状的模板在衬底材料或沉积层上进行增厚或刻蚀，最终得到一个具有三维结构的芯片。

薄膜制备实际上就是其中增厚的过程，即在芯片上沉积一层供下一步工序刻蚀用的薄膜材料，其厚度相对衬底材料来说要薄得多。

实际加工中需要淀积的薄膜材料有很多种，如二氧化硅（SiO2）、多晶硅、金属层等。

有多种方法可以用于薄膜制备，具体选用那种方法一般由所需沉积的材料以及沉积层的性质来决定。

其中最简单的方法就是硅的热氧化法。

热氧化是指硅片与氧化剂在高温下（>900℃）反应生长出一层二氧化硅（SiO2）膜。

二氧化硅膜在生物芯片微器件或结构中有很重要的用途，例如用作支撑或应变层、绝缘层、腐蚀掩蔽层、牺牲层等等。

硅的热氧化一般是常压下在高温电阻加热炉内进行，有干氧氧化、湿氧氧化两种方法。

干氧氧化生成的SiO2膜结构致密、干燥、均匀性好、掩蔽能力强、钝化效果好，缺点是氧化速率很慢。

湿氧氧化的速率要比干氧氧化快，但生成的SiO2膜致密性要差一些，表面也存在一些缺陷。

所以现在普遍采用干氧—湿氧－干氧交替的氧化方法来制备较厚的SiO2膜。

对于100nm以下的SiO2膜则通常采用干氧氧化的方法来制备。

热氧化法虽然简单，但只能局限于SiO2膜的制备。

事实上，生物芯片制备过程中还需要沉积其他的各种薄膜。

其中多晶硅膜、氮化硅（Si3N4）膜以及磷硅玻璃（PSG）钝化层等一般采用化学气相沉积法（Chemical Vapor Deposition，CVD）来制备。

这种方法是指单独或综合利用热能、辉光放电等离子体、紫外光照射、激光照射等能源，使气态物质在固体的热表面上发生化学反应并在该表面上淀积，从而形成稳定的固态物质膜。

该方法具有淀积温度低、薄膜成分与厚度易控、膜厚与淀积时间成正比、均匀性与重复性好、台阶覆盖优良、操作简单、适用范围广泛等特点，利用它几乎可以制备微结构器件中所需要的各种薄膜。

目前已开发出多种实用的CVD技术，其中最常用的是常压化学气相沉积（APCVD）、低压化学气相沉积（LPCVD）和等离子体化学气相沉积（PCVD或
PECVD）三种。

LPCVD主要用于生长多晶硅与氮化硅，PECVD淀积温度低，常用于淀积磷硅玻璃与氮化硅。

然而，不管采用何种CVD方法，其成膜的性质既与所利用的化学反应密切相关，也与衬底温度、气体流量与纯度、反应装置的形状以及反应系统的清洁度密切相关。

在生物芯片中用于制备各种电极的金属层通常是采用真空蒸发或溅射技术获得的。

蒸发是在真空腔中将待蒸发的金属材料加热到熔融态，使其原子获得足够能量后蒸发脱离金属表面，飞向衬底淀积形成金属薄膜。

按照热源的不同，可将蒸发分为电阻加热蒸发与电子束蒸发两种。

而溅射则是利用在强电场作用下气体放电产生的高能离子轰击溅射出靶才原子形成薄膜。

此外电镀也可用于金属层的淀积。

而对于生物技术中所需的一些绝缘层和聚合物层则可通过喷涂或旋涂的方法获得。

二、光刻技术[11][12][13]
如前所述，光刻是一种图像复印技术。

在生物芯片制备过程中，要把制备好的硅、二氧化硅、氮化硅、多晶硅、金属等薄膜加工成所需要的形状都要使用光刻技术。

根据光刻过程中曝光所用的射线不同，光刻方式可分为紫外线光刻、X 射线光刻、电子束光刻和粒子束光刻。

无论用哪种射线和方式进行光刻，其工艺步骤大体是一样的，包括涂胶、前烘、曝光、显影、漂洗、坚膜等步骤。

光刻过程中使用的光刻胶也称为光致抗蚀剂，它由高分子聚合物、增感剂和
溶剂以及其他添加剂按一定比例配制而成。

光刻胶分负胶(光照部分固化，没受光照部分在显影液中会被显掉）和正胶（光照部分在显影液中会被显掉）两类。

负胶工艺容易控制，有很高的感光速度，很好的粘附性和抗蚀能力，而且成本低。

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主要缺点是分辨率较低，不适于细线条光刻。

而正胶有较高的分辨率，可作1μm 甚至更细线条的光刻。

但正胶的粘附性较差，成本也较高。

加工过程中使用的光刻胶的正负性直接对应着所需掩模板的正负性（即掩模上的图形是亮的还是暗的）：同种加工工艺，不同的光刻胶，需要用不同性质的掩模板，如图7-2-1所示。

实验表明，光刻胶膜厚对分辨率有很大的影响，胶膜越厚，分辨率越低，这种现象负胶比正胶更明显。

在生物芯片等微型分析器件的制备中，有时需要厚光刻胶膜，例如几微米、几十微米甚至上百微米厚的胶膜。

这除了要使用特殊的光刻胶以及控制转速等条件外，还必须有一个密闭的涂胶盘腔，并且要控制该腔内的压力和气氛。

而且有时还不能用普通的光刻机对其进行光刻。

目前发展了一种用紫外光进行深层光刻的方法，这种特殊的光刻机可使紫外光以一定的角度射进与之配合使用的特殊光刻胶中，这样可以得到侧壁陡直具有很高深宽比的微结构。

三、刻蚀技术
刻蚀工艺是将光刻后的图形腐蚀复制到各种薄膜材料或衬底材料上，并将其加工成器件或结构所要求的三维形状，这里上一步光刻留下的抗蚀剂可被用作腐蚀时的掩蔽层，也可用其他的沉积层作为掩蔽层。

刻蚀工艺分为湿法刻蚀与干法刻蚀两类。

湿法刻蚀全都是化学刻蚀，即通过化学反应来进行刻蚀。

大多数湿法刻蚀具有各向同性的特点，即刻蚀过程中刻蚀剂不仅刻蚀掉深度方向的材料，而且几乎以同样的速度同时刻蚀掉侧壁的材料。

但在某些特定的溶液和材料中，在不同方向上的刻蚀速率明显不同，这就是所谓的各向异性刻蚀。

在实际加工中需根据不同的待刻蚀材料选用不同的刻蚀剂。

对于硅微加工来说，常用的刻蚀剂主要有三种：（1）乙二胺、邻苯二酚和水的混和液（简称EDP）；（2）KOH水溶液；（3）HF、HNO3和醋酸的混合液（简称HNA）。

其中HNA是各向同性的，而EDP和KOH水溶液都可以进行各向异性刻蚀。

对于玻璃、陶瓷，刻蚀剂可以是氢氟酸或它与NH4Cl混合液。

而常用作电极材料的惰性金属则通常需要用王水（浓HNO3和浓HCl按1:3的体积比混合）来刻蚀。

对于铂等惰性金属，有时也用图7-2-2所示的剥离工艺取代刻蚀工艺对其进行微细图形加工，即先在芯片上涂上一层光刻胶，并刻出掩模对应的图形窗口后不去胶，而是淀积所要求的电极金属，其膜厚不超过光刻胶厚度，当用
适当溶剂去除光刻胶后，淀积在光刻胶上的金属膜也随之一同被剥离去除，只留下所要求的金属图形[3]。

干法刻蚀
是用在低气压
下气体放电形
成的等离子体
进行刻蚀。

产
生等离子体的
方法可以是直
流（DC ）放电，
也可以是交流
（AC ）放电。

干法刻蚀具有
分辨率高、各
向异性刻蚀能
力强、不同材料之间刻蚀选择比大、刻蚀均匀性及重复性好、便于工艺监控以及易于实现连续自动操作等优点，可用于硅、绝缘体、有机物和金属材料的加工，在生物芯片制备中常用于刻蚀较深的微流路、微反应池等。

干法刻蚀工艺包括等离子体刻蚀、离子束刻蚀、反应离子刻蚀以及新近出现的感应耦合离子刻蚀。

无论哪种刻蚀工艺，都是利用低压气体放电条件、气体类型和所用的反应系统的不同，刻蚀反应的模式都取决于系统压力、温度、气流、功率和相关的可控参数。

四、牺牲层技术
牺牲层技术是MEMS 加工中用来制作表面微结构的关键与核心技术。

所谓牺牲层技术就是利用不同材料在同一种腐蚀剂中腐蚀速率的巨大差异选择性地腐蚀去掉结构层薄膜下面的一层材料（即牺牲层材料），从而形成空腔或各种需要的悬空结构。

在生物芯片制备中，可用来直接形成密闭的微流体通道和反应池，也是微泵和微阀中一些活动部分的重要加工工艺。

牺牲层技术的关键在于选择牺牲层材料及腐蚀液，要使该腐蚀液对牺牲层腐蚀得很快而对牺牲层上下方的结构膜材料腐蚀得很慢，两者腐蚀速率之比越大，结构模层受影响就越小，实现的结构就越精确与理想。

表7-2-1列出了常用
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的牺牲层材料、对应的腐蚀液以及可与牺牲层材料搭配的结构层膜材料。

表7-2-1 常用牺牲层材料、腐蚀液及对应的结构膜材料[11]
五、微模塑（Micromolding）技术
上面介绍的都是硅平面加工工艺中最重要的基本加工方法，在后来的MEMS 加工以及生物芯片制备中同样起到非常重要的作用。

但是，在生物芯片中还常常要制作一些具有很高深宽比的微结构和器件，而且需要对除硅之外的多种材料进行加工，这就要求还有其它相应的微加工工艺。

微模塑（Micromolding）技术就是其中的一种。

它是指依靠事先制作好的模具将塑性材料加工成所需形状的方法。

微模塑技术主要包括以下几种：
1、LIGA和准LIGA技术[11][12]
LIGA是德文的制版术（Lithographie）、电铸成形（Galvanoformung）和注塑（Abformung）的缩写。

这是一种重要的非硅基微机械加工技术，可以制造具有很多纵横比的平面图形复杂的三维结构。

在生物芯片加工中，除了可以用来刻蚀很深的微通道和微反应池外，还是微泵和微阀等器件制作中的重要方法。

它加工的结构纵向尺寸可达数百微米，最小横向尺寸为1μm，尺寸精度达亚微米级，而且有很高的垂直度、平行度和重复精度。

LIGA技术包括以下3个工艺过程：
（1）深层同步辐射X射线光刻：指利用同步辐射X射线透过掩模对固定于金属基底上的厚度可高达几百微米的X射线抗蚀层进行曝光。

然后将其显影制成初级模板，由于被曝光过的抗蚀剂将被显影除去，所以该模板即为掩模覆盖下的未曝光部分的抗蚀剂层，它具有与掩模图形相同的平面几何图形。

（2）电铸成形
电铸成形是根据电镀原理，在胎模上沉积相当厚度金属以形成零件的方法。

在LIGA技术中，把初级模板（抗蚀剂结构）模腔底面上利用电镀法形成一层镍或其它金属层，形成的金属基底作为阴极，所要成形的微结构金属的供应材料（如Ni，Cu，Ag）作为阳极，进行电铸，直到电铸形成的结构刚好把抗蚀剂模板的形腔填满。

而后将它们浸入剥离溶剂中，对抗蚀剂形成的初级模板进行腐蚀玻璃，剩下的金属结构即为所需的微结构件。

（3）注塑
将电铸制成的金属微结构作为二级模板，将塑性材料注入二级模板的模腔，形成微结构塑性件，从金属模中提出。

也可用形成的塑性件作为模板再进行电铸，利用LIGA技术进行三维微结构件的批量生产。

由于LIGA技术有赖于价格昂贵的同步辐射X光源，而且与集成电路工艺相容性不好，于是在90年代中期出现了一种准LIGA技术，它用其它光源代替同步辐射X光进行厚胶深层光刻，而其余电铸与注塑等工艺步骤与常规LIGA 技术相同。

准LIGA技术由于回避了很难得到的同步辐射X光，而且又可省去制作困难的X射线掩模板，因此经济性和广泛性大大高于常规的LIGA技术。

目前可替代X射线进行厚光刻胶深层光刻的有远紫外准分子激光和紫外光两种光源。

2、热塑（Hot Embossing）[4][6][13][14]
尽管LIGA技术可以对金属、塑料、陶瓷等多种材料进行加工，但它的设备投资很大，而且对加工环境的要求也很高。

所以在生物芯片的加工中，尤其是在塑料衬底上制作微流体通道和微反应池时，出于降低成本和加工方便考虑，也常常采用热塑的方法。

这种方法在加工时，也需要先制作好相应的模具。

然后通过加热使塑性材料形成所需形状，冷却后拿去模具便可得到所需的构件。

模具可以用多种材料制成，如硅片、石英、SU－8厚光刻胶、金属丝等等，其图形可以通过前面所介绍的湿法刻蚀等方法获得。

热塑可分为压模法（Imprinting Method）和注塑（Injection Molding）两类。

压模法是将模具放在待加工的塑料坯料（即衬底）上面，然后施加一定大小的压力，同时给塑料加热使其软化，这样模具上的图形便可压印到塑料上。

在压力继续存在的情况下，进行冷却，以使所得到的塑料构件固化。

注塑则是指先将液体状态的塑性材料浇注到模板的模腔里面（也即模板上被刻蚀掉的部分），并在其上覆盖上一定的厚度，以保持构件的机械强度。

冷却
后将模板取出，即可得到所需的塑料构件。

在生物芯片中，有时还需要供样品进出的微孔，这也可以用注塑的方法实现。

六、键合（Bonding ）技术[11][13]
制作出密闭的微流体通道和反应池等结构是生物芯片及其它生化分析仪器加工中一个关键的步骤。

这除了可以用前面介绍的牺牲层技术来实现外，还可以通过已经刻蚀好的芯片上加上一个盖片来实现，这个过程称为键合。

由于生物芯片的衬底材料有很多种，所以键合的对象也可能是多种组合，如硅－硅键合、硅－玻璃键合、玻璃－玻璃键合、塑料之间键合等等，它们各自适应的键合原理和方法也有所不同。

主要有以下几种：
1、阳极键合：阳极键合也称静电键合，
它是利用静电力使两种材料键合在一起。

它可
以用于玻璃与半导体材料（如硅片）或金属材
料的键合与封接。

阳极键合如图 所示。

键合
时，硅片接电源正极，玻璃接负极，并对玻璃
和硅片加热（180－500℃）。

在高温下玻璃的
导电性加强，在电场作用下玻璃中的Na ＋向负
极方向漂移，在紧邻硅片的玻璃表面形成耗尽
层，由于耗尽层带负电荷，硅片带正电，两者
之间存在很大的静电力使两个表面紧密接触，在较高温度下，两界面的原子发生相互作用形成牢固的化学键，从而使硅和玻璃接合在一起。

硅－硅也可以通过这种方式键合，不过一般应先在其中的一块硅片表面溅射一层磷硅玻璃薄层（约4μm 厚）。

如图7-2-2所示。

2、热键合：玻璃－玻璃可以通过一个简单的热循环过程来进行键合。

表7-2-2是磷硅玻璃间键合条件的实验参数。

表7-2-2 PSG －PSG 热键合条件和步骤
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