细菌扩大培养的知识

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种子的扩大培养
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
工艺 三级种子
8小时产酸 （%）
2.2～2.7
12小时产酸 （%）
4.6～5.2
二级种子 1.0～1.5 2.6～3.4
② 糖酸转化率高且稳定
发酵周期 （h) 32
35
工艺
三级种子 二级种子
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第七章 种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求 种子制备与质量控制 实例
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种子的扩大培养 第一节 种子扩大培养的目的与要求
一、定义: 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处
于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶 或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的 纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
• 实验室种子的制备一般采用两种方式 – 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的 菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接 作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂 菌。 – 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用液体培养法。
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1、培养物选择的原则
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大 培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原 则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷 酸盐等。如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌 空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀 分布，获得相同的培养条件。
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1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 30小时开始出现芽孢
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6、种子的质量要求 量：要求达到一定的浓度 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH 酶活等 无污染
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第三节 种子质量的控制
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采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东， 发酵科技通讯，2003,7
背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%左右）
二级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%以上） 文章：三级种子工艺 斜面→一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）→二级种子（2m3） →三级种子（20m3)→发酵（240m3)
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接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体 前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病 治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理 功能。因发酵法生产Υ亚麻酸与从天然植物提取相比具有一 系列优点，发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
培养基
影响孢子质量
培养条件
的因素 及控制
培养时间 和
冷藏时间
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1 培养基
• 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象， 其主要原因是原材料质量波动。
– 例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培 养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用 量的不同对孢子质量的影响也不同。
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种子的扩大培养 培养基成分表
用途 保藏
斜面
成分（%）
牛肉膏 （英国） 1，蛋白胨（日本），琼脂粉 （日本）1.8， 无机盐
添加 0.1的口服葡萄糖，其余同上
规模
一级 二级 三级
口服葡萄糖 3， 玉米浆 2.4，尿素 0.65，无机 盐等
玉米淀粉双酶糖 2.0， 玉米浆 2.0 ，甘蔗糖 蜜 1.0, 尿素 0.35， 无机盐等
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薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4 )2 SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
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一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
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种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求： 菌种总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵罐后，能迅速生长，迟缓期短 无杂菌污染 能保持稳定的生产能力
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种子的扩大培养 液体种子制备
1.好氧培养：
¾ 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产 卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus） 可以用摇瓶液体培养法:
¾ 将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机 上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管→三角瓶→摇床→种子罐
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不同接种量影响菌体的生长和发酵
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发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
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20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
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3、起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面 目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的 形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵Υ亚麻酸 时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
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采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
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本研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明 显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽孢的微生物
——获得一定数量和质量的菌体 对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
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对于产孢子的微生物 ¾ 获得一定数量和质量的孢子 ¾ 获得一定数量和质量的菌丝体
产酸（%）
10.93 9.8
糖酸转化率 （%）
59.8
单罐产量 (吨）
21
58
18
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4、接种量的确定 移入种子的体积
接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
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种子的扩大培养 孢子的制备
1.细菌孢子的制备 9 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰
富的配方。 9 培养温度一般为37˚C。 9 细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的
细菌培养则需要5~10天。
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种子的扩大培养 2.霉菌孢子的制备 9 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
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3、发酵级数的确定 1.种子罐的作用： • 主要是使孢子发芽，生长繁殖
成菌（丝）体，接入发酵罐能 迅速生长，达到一定的菌体 量，以利于产物的合成。
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种子的扩大培养
种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取 决于： – 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； – 所采用发酵罐的容积
一是成本
二是驯化
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例：柠檬酸发酵 以蔗糖为原料
成分
斜面
麦芽汁 蔗糖
NH4 NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
麦汁 2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
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种子的扩大培养 2.厌氧培养： ¾ 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）
试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
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（二）生产车间种子的制备
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般 在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程 为生产车间阶段。
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机盐 等
1200 ml /5000 ml 1.2 / 2 m3
12 / 20 m3
发酵
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.060.08 ，甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐等
9 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 9 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用
一级种子
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确定种子罐级数需注意的问题
¾ 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌 机会；
¾ 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发 酵罐的生产率，增加染菌机会；
¾ 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但 也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条 件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减 少种子罐的级数。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:
– 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不 同。
• 原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机 离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、 Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也 会影响孢子的质量。
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种子的扩大培养 第二节 种子制备的技术概要
一、种子制备的过程 • 种子制备的过程大致可分为： – 实验室种子制备阶段 – 生产车间种子制备阶段
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（一）实验室种子的制备
实验室阶段不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床 等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子 培养。
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5、种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
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种子的பைடு நூலகம்大培养
舒琴， 林产化学与工业，2004
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
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9 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较 少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
9 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐 （ 27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌 丝体）→发酵罐
麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 9 培养的温度一般为25~28˚C。 9 培养时间一般为4~14天。
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3.放线菌孢子的制备 9 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养
基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成 分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机 盐等。 9 培养温度一般为28˚C。 9 培养时间为5~14天。