蛋白组学二维电泳讲课文档
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1、考马氏亮蓝与蛋白质反应机理 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷
衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在 464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内 （15-20 μg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可 在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下， 这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 2、考染机理
蛋白组学二维电泳
优选蛋白组学二维电泳
蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250 (CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射 性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺 黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
（一）考染（考马氏亮蓝染色）
2、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下
来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上，从而 导致半透明背景上的空白区域，这就是负染过程。
人肝癌细胞系MHCC97的部分双向凝胶电泳锌染图谱
锌染程序
(1) 水洗1 min； (2) 0.2 mol/L 咪唑、0.1% SDS溶液10 min； (3) 0.2 mol/L 氯化锌1 min； (4) 水洗5 sec三遍；
+++
++++ ++++
二维电泳的图象分析
图象分析Biblioteka Baidu
对双向电泳图谱上的这些蛋白质点进行检测、 定量、比较、分析和归类
主要包括： 图象采集 图象分析：蛋白质点检测、背景消除、蛋白 点匹配、归一化处理、数据输出 数据库的建立
胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液 中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染 色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成。胶内 蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色。
Coommassie Brilliant Blue G-250
3、考染程序
考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换 成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧 链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化。 （1）固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至 少1h，可过夜。 （2）染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成： 45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考马氏亮蓝G-250，混均过滤。 （3）脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温 度可加快脱色。脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸。 （4）保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一 个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步 脱色后贮于-80 ℃。
碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银 氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件 下用福尔马林将银氨还原成金属银。
2、特点
（1）酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染 色灵敏度稍高，碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易 控制。
（2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。
（3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽 谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。
3、程序
1. 分析型银染（不能用于质谱鉴定） (1) 水洗胶5 min； (2) 40%乙醇，10%乙酸固定1 hr； (3) 5%乙醇，5%乙酸固定过夜； (4) 水洗20 min两遍； (5) 5%戊二醛 1hr； (6) 水洗30 min四遍； (7) 250mL新鲜配制的银氨液(1mL NaOH 与5mL 饱和氨水混合再 加10mL 20%AgNO3)/胶45 min； (8) 水洗3 min三遍； (9) 1.5mL 1%柠檬酸、125μL 37%甲醛/胶显色； (10) 5%乙酸停显10min； (11) 水洗10 min三遍。
基于钌的金属螯合染料 检测灵敏度0.5－1ng 染色速度快，15min可完
成 线性动态范围广 需要紫外或激光检测系
统 和质谱检测兼容
总结
染色方法 灵敏度 线性范围 与质谱兼容性 费用 硬件要求
考染
10ng 3
++
++
银染
200pg 7
+
++
负染
15ng 3
++
++
荧光标记 250pg 104
2、特点 （1）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。 （2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶 解性，导致质谱鉴定出现偏差。 （3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能基团数 不一样，灵敏度变化不一样。
二维电泳荧光检测
Red Cy3 Green Cy5
（五）SYPRO Ruby荧光染色
（四）荧光染色（Cy3和Cy5）
1、原理： 利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光， 通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分 别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上 进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张 有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。
2. 快速银染（和质谱鉴定相匹配）
（三）负染
1、特点 （1）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率，常用有 铜染、锌-咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背 景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被 检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。 （2）显色过程仅需5-15min （3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子就 可转移出蛋白质。 （4）灵敏度15ng
4、考染特点
（1）可以获得无背景或低背景的图谱； （2）染色过程需24-48h，所需时间较长； （3）灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。
（二）银染
1、原理：
碱性银氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸银（AgNO3）染 色法。
酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸 性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱 性环境下里用福尔马林还原成金属银。
衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在 464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内 （15-20 μg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可 在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下， 这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 2、考染机理
蛋白组学二维电泳
优选蛋白组学二维电泳
蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250 (CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射 性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺 黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
（一）考染（考马氏亮蓝染色）
2、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下
来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上，从而 导致半透明背景上的空白区域，这就是负染过程。
人肝癌细胞系MHCC97的部分双向凝胶电泳锌染图谱
锌染程序
(1) 水洗1 min； (2) 0.2 mol/L 咪唑、0.1% SDS溶液10 min； (3) 0.2 mol/L 氯化锌1 min； (4) 水洗5 sec三遍；
+++
++++ ++++
二维电泳的图象分析
图象分析Biblioteka Baidu
对双向电泳图谱上的这些蛋白质点进行检测、 定量、比较、分析和归类
主要包括： 图象采集 图象分析：蛋白质点检测、背景消除、蛋白 点匹配、归一化处理、数据输出 数据库的建立
胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液 中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染 色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成。胶内 蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色。
Coommassie Brilliant Blue G-250
3、考染程序
考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换 成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧 链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化。 （1）固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至 少1h，可过夜。 （2）染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成： 45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考马氏亮蓝G-250，混均过滤。 （3）脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温 度可加快脱色。脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸。 （4）保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一 个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步 脱色后贮于-80 ℃。
碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银 氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件 下用福尔马林将银氨还原成金属银。
2、特点
（1）酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染 色灵敏度稍高，碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易 控制。
（2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。
（3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽 谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。
3、程序
1. 分析型银染（不能用于质谱鉴定） (1) 水洗胶5 min； (2) 40%乙醇，10%乙酸固定1 hr； (3) 5%乙醇，5%乙酸固定过夜； (4) 水洗20 min两遍； (5) 5%戊二醛 1hr； (6) 水洗30 min四遍； (7) 250mL新鲜配制的银氨液(1mL NaOH 与5mL 饱和氨水混合再 加10mL 20%AgNO3)/胶45 min； (8) 水洗3 min三遍； (9) 1.5mL 1%柠檬酸、125μL 37%甲醛/胶显色； (10) 5%乙酸停显10min； (11) 水洗10 min三遍。
基于钌的金属螯合染料 检测灵敏度0.5－1ng 染色速度快，15min可完
成 线性动态范围广 需要紫外或激光检测系
统 和质谱检测兼容
总结
染色方法 灵敏度 线性范围 与质谱兼容性 费用 硬件要求
考染
10ng 3
++
++
银染
200pg 7
+
++
负染
15ng 3
++
++
荧光标记 250pg 104
2、特点 （1）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。 （2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶 解性，导致质谱鉴定出现偏差。 （3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能基团数 不一样，灵敏度变化不一样。
二维电泳荧光检测
Red Cy3 Green Cy5
（五）SYPRO Ruby荧光染色
（四）荧光染色（Cy3和Cy5）
1、原理： 利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光， 通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分 别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上 进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张 有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。
2. 快速银染（和质谱鉴定相匹配）
（三）负染
1、特点 （1）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率，常用有 铜染、锌-咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背 景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被 检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。 （2）显色过程仅需5-15min （3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子就 可转移出蛋白质。 （4）灵敏度15ng
4、考染特点
（1）可以获得无背景或低背景的图谱； （2）染色过程需24-48h，所需时间较长； （3）灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。
（二）银染
1、原理：
碱性银氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸银（AgNO3）染 色法。
酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸 性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱 性环境下里用福尔马林还原成金属银。