细胞融合的方法过程和影响因素

优点：
融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞
第二节 融合细胞的筛选
原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细 胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。
PEG是一种多聚化合物，商品名卡波蜡 Carbowax,分子量200－20000，靠醚键的联结 使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多 种。
聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合
原理：PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的 负电荷在Ca2＋的连接下，形成静电键，促使异 源的细胞膜间的粘着和结合，在高pH,高Ca2＋ 溶液的作用下，将Ca2＋和与质膜结合的PEG分
二、诱发细胞融合的方法 基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。
3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。
The chemical composition of membranes 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长
4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。
细胞融合的方法过程和影响因素
（优选）细胞融合的 方法过程和影响因素
一、 细胞融合的概念
细胞融合（cell fusion）：又称somatic hybridization or cell hybridization ，指在自然 条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性 方式融合形成一个杂合细胞的过程。 它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究 细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物 遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为 有效的手段。
3
注意事项
1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用 适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介 质。
2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度 和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。
融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电 场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷酸前体 A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成
T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体
HGPRT酶缺陷型细胞株 （长期培养系）
不能在HAT培养液中生长
融合细胞
最后，只有融合细胞在HAT 培养液中存活
亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉 素。
杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上 生长。
4 具有所需性状杂种细胞的筛选
HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗 性所建立的杂种筛选
HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤 （ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选 择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。
当病毒位于两个 细胞间时，病毒 表面spike上神经 氨酸酶降解细胞 膜上的糖蛋白， 使细胞膜局部聚 集在病毒周围， 在高pH和Ca2+条 件下局部细胞膜 发生融合。
2.化学融合剂促进细胞融合
1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促进细胞融合， Pontecorvo报 道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。
1.病毒促进细胞融合
病毒类融合剂是研究的最早的促融剂，一些 致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感 型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但 由于毒性大，应用上收到很大限制。 仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，诱导细胞融合
的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。
这一现象对你有何启示？
HVJ促融机制：
A. Membrane Lipids: The Fluid Part of the Model ❖Membrane lipids are amphipathic. ❖There are three major classes of lipids:
Phospholipids: Phosphoglyceride磷酸甘油酯and sphingolipids
A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0. 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。
contain the receptors needed to detect external signals.
The Fluid Mosaic Model, proposed in 1972 by Singer and Nicolson, had two key features, both implied in its name.
The chemical composition of membranes
1）亲本 2）同核体homokaryon ：同源细胞融合体，它们的基因型和表
现型完全一样。 3）异核体heterokaryon ：异源细胞的融合体，它们含有双亲细
胞核和细胞质物质。 4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸 腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞 为亲本之一。
HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。
含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧 啶的全合成途径。
基于HAT培养基的筛选系统
动物细胞融合的筛选方式：
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对 药物敏感性差异筛选杂种细胞。
亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不 敏感
亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不 敏感
杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基 上生长
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几 种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷 型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原 理可以筛选杂种细胞。
1）取出阳性孔内的细胞进行计数 细胞融合（cell fusion）：又称somatic hybridization or cell hybridization ，指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性 方式融合形成一个杂合细胞的过程。
次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷） 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。
DNA合成途径有两种:
主要途径由氨基酸和其他小分子化 合物合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤 和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制 FH2活性，阻断FH2到FH4合成。
需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸） 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷）
利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。
An Overview of membrane functions 直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
3 融合与细胞密度有关 细胞融合的方法过程和影响因素
融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；
体外生存能力有限，最终也将死亡
自发融合：受精过程，成肌细胞融合，巨噬细胞融合， 体外培养系统中的细胞融合
诱发融合
1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体，开创 动物细胞融合的暂新领域。
Singer and Nicolson’s Model of membrane structure: The fluid-mosaic model is the “central
蛋白分子 极性孔
Hydrophobic 疏水的 Hydrophilic 亲水的
细胞融合机理
细胞融合的关 键：脂双层的 接触靠近, 细 胞桥形成, 胞 质渗透－细胞 核融合。
寡糖 糖脂
胆固醇
磷脂
鳌合蛋白 疏水a螺旋
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养
5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。 Phospholipids:
regulate transport
processes. 原理：PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2＋的连接下，形成静电键，促使异源的细胞膜间的粘着和结合，在高pH,高
Ca2＋溶液的作用下，将Ca2＋和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种细胞膜上的正负电荷连接起来，
dogma” of membrane biology.
A. The core lipid bilayer exists in a fluid state, capable of dynamic movement.
B. Membrane proteins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees.
3）遗传缺陷的基因互补
病毒 可在显微镜下定向诱导细胞融合
Membrane Lipids: The Fluid Part of the Model
Serve as loci for specific functions. 不能在HAT培养液中生长
化学－PEG
电融合
contain the receptors needed to detect external signals. 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。
进而形成具有共同质膜的融合体。 1）取出阳性孔内的细胞进行计数
4. contain the receptors
needed to detect
external signals.
5. provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion
正常细胞
体外生存能力有限，最终也将死亡
Glycolipids Sterols ( is only found in animals)
An Overview of membrane functions
1. Define the boundaries of the cell and its organelles.
1 PEG融合的关键是作用时间 provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion
2. Serve as loci for
细胞融合的关键：脂双层的接触靠近, 细胞桥形成, 胞质渗透－细胞核融合。 Membrane lipids are amphipathic.
specific functions.
（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）
Glycolipids
3. provide for and
子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两
种细胞膜上的正负电荷连接起来，进而形成具
有共同质膜的融合体。
注意事项
1 PEG融合的关键是作用时间 2 PEG规格和纯度与融合效率有关 3 融合与细胞密度有关 4 融合液中加入少量CaCl2，即维持一定电导率，
对细胞也有保护作用
3.电融合技术（Electroporation）
亲本A：色氨酸缺陷型
亲本B：苏氨酸缺陷型
杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养 基上培养，而亲本细胞均会死亡。
3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的 培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感 突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此 筛选杂种细胞。
亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左 右生长。