Westernblot实验技术PPT

待测蛋白状态 凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
ReducedDenatured
ReducedNative
OxidizedDenatured
OxidizedNative
还原，变 性
还原，不 变性
不还原， 变性
不还原， 不变性
含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
分子筛效应
AP-TEMED系统 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸铵（AP） 诱发剂：四甲基乙二胺（TEMED）
配胶温度：室温或37℃ 配胶试剂：
AP：现用现配或分装冻存 TEMED ：最后加,边加边晃 Tris-HCl: 上下胶pH勿混(上6.8/下8.8) 丙烯酰胺: 神经毒性
蛋白分子量 （ku） 4-40 10-43 12-60 20-80
25-200 57-212
凝胶浓度 （％） 20 15 12 10 8 5
检测；
WB常见问题
无信号(白板)或 弱信号(不是白板胜似白板) 高背景(黑板、几尽黑板) 非特异性条带（杂带） 脏带（操作）、补丁染色 表情条带（微笑、皱眉） 闹鬼（鬼带、鬼影） 拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带 其它
无信号/弱信号问题(白板)
1. 样品
样品中无目的蛋白或目的蛋白降解---- ①设立阳性对照②检查封闭液 是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制剂
封闭问题
定义:
使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂 的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜 上的非特异性位点
举例:
① non-fat milk(脱脂奶粉 ② BSA（胎牛血清） ③ casein（酪蛋白） ④ Tween-20（吐温-20） ⑤ gelatin(明胶) ⑥ 商业化的封闭试剂
封闭
封闭问题
注意事项:
抗磷酸化抗体不能用酪蛋白或含磷
酸酶的封闭液.
E
兔源二抗(抗牛Fc段)
生物素、刀豆蛋白交联二抗不用脱脂 牛奶 同种封闭液的批间差异
兔 兔牛牛
源
源
二
一
兔E HRP
完全溶解、过滤去除难溶颗粒 牛、羊、马源的一抗尽量不用BSA或
抗 胎牛血清
抗
脱脂奶粉
牛
人源目的蛋白 固相载体
抗体问题
一抗：
HRP
鼠 鼠
兔E
源
兔源二抗(抗鼠Fc段)
一
抗
人源目的蛋白
固相载体
蛋白样品提取问题
明确蛋白样品的来源（组织； 细胞；体液）
蛋白位置 全细胞
推荐buffer NP-40 or RIPA
选择适当的裂解方式（研磨； 超声；剪切；冻融等）
选择适当的裂解buffer（SDS； RIPA；NP-40；商品化试剂盒）
3. 还原样品: a) β-巯基乙醇：强还原剂---断开二硫键,破坏二三级结构 b) 二硫苏糖醇(DTT) :还原剂---断开二硫键,破坏二三级结构
蛋白样品处理问题
根据目的蛋白的状态确定电泳条件：
抗体识别蛋白的空间型抗原表位时，不可加热及SDS变性 抗体识别蛋白的氧化状态时，就不可加还原剂（ β-巯基乙醇或DTT）
丽春红S染色法：带负电丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合,从而形成 红色条带. 透视法：①干燥PVDF膜后，20%甲醇浸湿；②蛋白区透明③方便、可逆、蛋白不损、无需染料
转膜问题
转膜方式：
A. 电泳转移(半干转、湿转)
B. 虹吸转移
转膜电压： 10~25V（半干转）
转膜电流： 1~2mA/cm2，10% gel
加入合适的蛋白酶抑制剂 （Aprotinin ；PMSF； leupeptin ; pepstantinA; PIC; EDTA；EGTA）
胞浆（可溶性蛋 白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合 Tris-Triton 蛋白）
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白 提取试剂盒
线粒体蛋白
普通蛋白WB、糖蛋白检 测、蛋白质测序、氨基 酸分析
显色法、化学发光、荧光、 显色、化学发光、放射性 放射性
普通蛋白WB、氨基酸分 析。0.1um膜适用于 7kDa以下蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋 白、糖蛋白、蛋白多糖、 核酸检测常用
价格
高
较低
低
PVDF膜的选择问题
转膜缓冲液问题 最好现用现配!
TEMED促使AP形成氧自由基，进而催 化Acr单体为长链，Bis再使长链彼此 联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶 （PAG）。注：O2为终止剂
氧自由基
聚丙烯酰胺凝胶
凝胶浓度，凝胶孔径↓，机械强度
“两胶三缓冲”
sample SDS-PAGE
-
浓
缩
Tris/HCl pH 6.8
胶
分 离
Tris/HCl pH 8.8
glycineproteinCl-
重点理解：先导快离子后方----离子强度 ----低电导区 ---电场强度 ， 使glycine和protein加速移动。
HCl全部解离成Cl-，迁移最快，走在最前----“先导离子”
分 离 胶
pH 8.8
+
蛋白样品受“夹板气”，被“压缩”，达“稳态”
protein-
滤纸
膜 胶
-
滤纸
胶
虹
膜
吸 转
+ 滤纸
移
转膜问题
转膜时间
A. 根据蛋白分子量、胶浓度、具体情况决定。 B. 检测多个蛋白时，需进行切胶，分别转膜。
小分子蛋白的 “流穿”问题
使用0.2μm的PVDF转印膜（PSQ，呈淡蓝色） 转移缓冲液中适当增加甲醇（防止平衡时小分子流失） 转移缓冲液中适当减少SDS（防止SDS抑制膜与蛋白的结合） 降低凝胶的平衡时间（≤10min） 降低电泳转膜时间（＜25min） tricine-SDS-PAGE
✓ 忌不洁孔（多因上胶位置玻璃未洗净）、
✓ 忌不齐孔（因上样孔底部有气泡、碎胶、
未冲孔、不均匀缩胶、不正确拔梳）等
膜的选择问题
特点
灵敏度和分辨率 背景
蛋白结合能力
机械强度 溶剂抗性 使用前是否需要浸润
PVDF膜
高 低 100-%甲醇润湿!!!
电泳三离子： glycine-
Cl-
Protien---
“--消- 除电S荷D差S 、构-像- 差--”--
-
-
-
带负电的蛋白胶束
压缩,分离效应
电泳三离子： glycine- Cl- Protien-
-
pH 6.8
浓 缩 胶
SDS-PAGE
甘氨酸仅有0.1～1%解离成Gly-，迁移最慢，走在最后--- “尾随离子”
根据目的蛋白的性质、种属选择合适一抗。 注意一抗的种属，单/多克隆及适用方法等。 根据说明书推荐或预实验优化最佳稀释比例。 加叠氮钠，４℃分装保存，忌反复冻融。
二抗：
Dot blot
根据一抗的来源种属以及Ig亚型（G、A、M等）选择合适二抗。
选择合适的标记物（HRP 、AP、 GOD、生物素、
荧光素、胶体金）
加或不加硫柳汞， ４℃分装保存，忌反复冻融。
根据说明书推荐或预实验（Dot blotting）优化最佳稀释比例。
对照问题
设置合适的对照组
阳性对照：明确表达目的蛋白，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达目的蛋白，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性及stripping效果 内参对照：检测实验体系是否正常工作、进行半定量分析 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的封闭及 stripping效果
夹心结构问题
夹心结构: 正—滤、膜、胶、滤—负
纤
大小： 滤纸>=膜>=胶
维
垫
注意事项: ①膜用甲醇预处理
②膜随时保持湿润（传统） ③尽量使用新滤纸 ④各层叠放次序正确
⑤不能有气泡
平衡问题：
①膜与胶泡于转膜缓冲液中 ②5~120min(蛋白分子愈小,时间愈短)
转膜效果问题
(A) 透视法, (B) 考马斯亮蓝染色 (C) 丽春红（可逆） (D) 酰胺黑 (E) CPTS 总蛋白染色.
线粒体
存在部位
线粒体 细胞核
确定内参不受实 验处理因素影响
细胞核
Stripping问题
适用于检测两种分子量接近的蛋白 适用于检测目的蛋白的特定修饰状态 50℃,150~200rpm,30min(需加β-巯基乙醇) 商品化温和的洗脱液(37 ℃,60rpm,10~30min) 若不换抗体,可不Stripping而直接封闭加抗体
不含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
不含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
含SDS 不含SDS 含SDS 不含SDS
配胶问题
： 胶类型的选择 PAGE、SDS-PAGE、tricineSDS-PAGE 、IEF、2D
胶的浓度选择：蛋白大小、数目、个人经
验
配胶时间：
忌即配即用（防凝固不均）； 忌长期冰箱放置（防SDS结晶）； 保存≤4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）
Western blot 实验技术
Western blot 原理
Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白 质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜， PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜 上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为 抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经 过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的
浓
高E
缩
分
胶
低E
离 胶
甘氨酸大量解离，迁移加快，走在蛋白前，跟着Cl-跑了。 样品蛋白在均一的电场强度和PH中“尽情”泳动 根据样品成员的分子大小，不同的迁移率，实现分离
（分子越小，跑得越快 ）
-glycineCl-
大分子 中分子 小分子
大致流程
提取与处理样品蛋白 电泳分离样品蛋白 转移蛋白至杂交膜 封闭非特异性位点 一抗孵育 洗涤 二抗孵育 洗涤 底物显色或曝光检测
NC膜
高 低 80-100ug/cm2
干的膜易脆 差
缓冲液润湿
尼龙膜
高 较高 >400ug/cm2
软而结实 差
缓冲液润湿
适用染色方法
胶体金、丽春红、酰胺黑、 胶体金、丽春红、酰胺黑、
印度墨汁、考马斯亮兰
印度墨汁
不能用阴离子染料
适用检测方法 适用范围
显色法、化学发光、荧光、 放射性、化学荧光、快 速免疫检测
RIPA or 线粒体 分离试剂盒
蛋白样品处理问题
1. 浓缩、纯化、脱盐:①离心；②超滤; ③透析; ④冻干。 2. 变性样品:
a) SDS：阴离子表面活性剂---- ①断开氢键；② 取消疏水作用 ； ③去除多肽折叠；④屏蔽蛋白电荷量。
b) 高温： ① 95~100℃,5~15min（大多数蛋白）； ② 70℃,5~10min（多次跨膜蛋白）
蛋白上样问题
上样的总蛋白量 根据蛋白表达丰度及研究目的调整适当的蛋白上
样量
（ ①20-70 ug 细胞/组织裂解液； ②100 ng
纯化蛋白；）
上样的总体积 1~30 ul(小板)； 1~５0 ul(大板）
各孔上样量一致 每孔上样量尽量保持一致，以防条带倾斜．
上样孔的选择
✓ 忌烂孔（因氧气进入）、
胶
( Acrylamide;bis;
SDS; AP; TEMED) +
[Tris-HCl pH6.8; 甘油； SDS；巯基乙醇；溴酚蓝] ✓上样缓冲液（Loading buffer）
✓电泳缓冲液（running buffer） [ tris-HCl; glycine;SDS ]
✓ 转膜缓冲液（transfer buffer） [ tris-HCl; glycine ]
内参问题
内参名称
beta-actin GAPDH Tubulin VCDA1/Porin COXIV Lamin B1
TBP
分子量大小
43kDa 30-40kDa
55kDa 31kDa 16kDa 66kDa 38kDa
适用范围
胞浆和全细胞 胞浆和全细胞
根据内参蛋白与 目的蛋白的分子大 小选择
胞浆和全细胞 根据内参蛋白的