碳点联合适配体构建荧光“关-开”癌胚抗原探针
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目前,CEA 的检测方法主要包括酶联免疫分析和电化学方法,灵敏度高,准确性好。然而免疫方法成 本高,抗体合成易受环境因素影响。电化学传感器方法存在电极修饰程 序 复 杂,易 受 假 阳 性 影 响 等 不 足。
基于荧光碳点(CDs)的荧光“开-关”效应,构建 CEA 检测方法简便,成本低,无需大型检测设备,在荧光探 针的构建方面表现出巨大潜力。荧 光 CDs是 一 种 至 少 在 一 维 空 间 内,尺 寸 小 于 10nm,能 稳 定 发 光 的 纳 米碳点,是目前最热门的碳纳米材料之一 。 [9] 与传统的 有 机 荧 光 染 料 相 比,CDs具 有 优 异 的 生 物 相 容 性, 化学及光稳定性且绿色环保性等诸多优点 。 [10,11] 本文采用水热法,制备单分散荧光 CDs。利用紫 外-可 见 光谱、荧光光谱、纳米粒径分析和红外光谱,对所制备的 CDs结构形貌、表面电荷、水化半径、荧光特性、表 面基团等特性进行了分析。CDs表面存在π 电子云,与适配体(Aptamers,Apts)之间由于π→π* 堆积 作 用 相互吸附,从而猝灭 CDs的荧光。当体系中出现 CEA 时,将适配体竞争性从 CDs表面解脱 附,体 系 的 荧
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第3期
张 益 霞 等 :碳 点 联 合 适 配 体 构 建 荧 光 “关-开 ”癌 胚 抗 原 探 针
第 37 卷
光得到恢复。本文基于此原理,构建一种荧光“关-开”探针体系,用于 CEA 快速分析。
1 实验部分
1.1 仪器及试剂 UV-4802紫外-可见分光光度计(上海龙尼柯仪器 有 限 公 司);NicoletiS5 傅 立 叶 变 换 红 外 光 谱 仪(美
系用于 CEA 快速检测。优化实验表明10μg/mLCDs和50μmol/L 适配体体系,荧光
猝灭效率达90%左右。体系的荧 光 恢 复 程 度 与 CEA 浓 度 之 间 存 在 线 性 相 关 性,线 性
响应范围为1ng/mL~500μg/mL,检测限为0.5ng/mL,检测时间低 于 30 min,是 一
2.3 CDs的 Zeta电位和 FTIR 分析 对 CDs溶液进行 Zeta电位测试和 FTIR 光谱分析,结果如图3所示。Zeta电位分析结果见图3(a),
表面电位为-9.96mV,较窄单峰峰形 且 呈 现 正 态 分 布,表 明 CDs在 溶 液 中 分 散 性 良 好。 红 外 光 谱 分 析 结果如图3(b)所 示。 位 于 1370~1460cm-1的 吸 收 峰 是 -COO- 的 特 征 峰[19],在 1564cm-1和 1120 cm-1处的尖峰是由于-NH 的弯曲振动和 C-NH-C 的 不 对 称 伸 缩 振 动[20],2810~2940cm-1范 围 出 现的弱吸收峰是由于 C-H 的伸缩振动,3274cm-1是 O-H 伸 缩 振 动 吸 收 峰 。 [21] 以 上 结 果 表 明 所 制 备 的 CDs表面有-COO- 、-NH2、-OH 等亲水性基团,在溶液中有良好的分散性。
光谱分析表明 CDs表 面 带 有 -COO- 、-NH2、-OH 等 亲 水 性 基 团,分 散 性 和 水 溶 性
良好。癌胚抗原(CEA)-适配体 能 显 著 猝 灭 CDs荧 光,加 入 CEA 后,由 于 适 配 体 被 竞
争性从 CDs表面解离,使 CDs的荧光得到恢复。基于此,构建一种荧光“关-开”探针体
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第3期
分析科学学报
第 37 卷
生移动的为倍频峰,倍 频 峰 发 射 波 长 是 激 发 波 长 的 二 倍,是 由 光 的 散 射 造 成 的。 本 文 基 于 CDs荧 光 峰 (410~485nm)进行 CEA 检测探针体系构建。荧光光谱测试结果显示随着激发波长从200nm 增加到300 nm,CDs荧光先增强后减弱,当激发光波长为245nm 时,CDs溶液在445nm 处出现最强荧光发射峰。紫外可见光谱分析结果见图2(b),CDs溶液在200~230nm 处存在吸收带,是由于 C=C 共轭体系的π→π* 跃迁 所产生[17],350nm 处的吸收峰是由于羧基等不饱和体系的n→π*跃迁所产生[18]。同时,图2(b)内插图显示 CDs溶液在可见光下呈亮黄色,而在紫外光照射下为明亮的蓝光,这与445nm 处发射光谱相一致。
收 稿 日 期 :2020-01-09
修 回 日 期 :2020-02-11
基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 项 目 (No.81602506);山 西 省 青 年 科 技 研 究 基 金 (No.201901D211084)
* 通讯作者:董川,男,博士,教授,研究方向为环保可降解色料研究.E-mail:dc@
第 37 卷 第 3 期 Vol.37 No.3
分析科学学报 JOURNAL OF ANALYTICALSCIENCE
DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2021.03.006
2021 年 6 月 June 2021
碳点联合适配体构建
2 结果与讨论
2.1 CDs和 Apts构建荧光“关-开”探针的机理 CDs的荧光性能稳定,其表面具备高密度π 电子云,能够吸收激发光能量,进而产生电子跃迁,发射较
强荧光,被广泛用于生物分子的定量检测 。 [13,14] 适配体加入 CDs溶液时,由于π-π 堆积 作 用,适 配 体 被 吸 附在 CDs的表面,从而猝灭了 CDs的荧光 。 [15,16] 当待检测目标 CEA 加入 体 系 中,由 于 CEA 和 适 配 体 之 间天然的生物高特异性识别和亲和力,这 种 作 用 远 大 于π-π 堆 积 作 用,从 而 将 适 配 体 从 CDs表 面 竞 争 性 解吸附,进而 CDs荧光得到恢复。本文基于荧光“关-开”效应,构建 CEA 探针体系,其原理如图1所示。
图1 CDs-Apts“关-开”体系检测 CEA 的原理图 Fig.1 SchematicdiagramofCDs-Apts"off-on"systemfordetectingCEA
2.2 CDs荧光和紫外-可见光谱特性 从 图 2(a)可 见 ,CDs荧 光 光 谱 为 双 峰 形 式 ,不 随 激 发 波 长 变 化 而 移 动 的 为 荧 光 峰 ,随 激 发 波 长 变 化 发
能 够 在 早 期 预 警 和 诊 断 肺 癌 的 方 法 。 癌 胚 抗 原 (CarcinoembryonicAntigen,CEA)是 一 类 广 谱 性 癌 症 标 志 物,属于细胞表面糖蛋白家族,分子量为180~200kDa,于1965年首次在人 结 肠 癌 组 织 中 发 现 。 [3,4] 在 健 康成人体内 CEA 水平通常为0~5ng/mL 左右,当人 体 组 织 出 现 癌 变 后,血 液 中 CEA 含 量 开 始 升 高,一 般高于20ng/mL。研究表 明 不 同 类 型 癌 症 患 者,血 液 CEA 检 测 阳 性 率 均 达 到 了 显 著 水 平 。 [5,6] 同 时, CEA 还可与其他肿瘤标志物联合检测,作为癌症诊断依据,提高对肿瘤的 确 诊 正 确 率 。 [7] 除 此 之 外,血 清 CEA 水平对肿瘤复发的敏感性达80% 以 上,早 于 临 床 和 病 理 检 查[8]。 因 此,血 清 CEA 水 平 被 临 床 用 于 癌症患者术后疗效的追踪。可见,血液中的 CEA 水平可以用于癌症的预警、诊断以及疗效监测。
(1.太原理工大学生物医学工程学院,山西太原 030024; 2.山西大学环境科学研究所,山西太原 030006)
摘 要:以 柠 檬 酸 和 聚 乙 烯 亚 胺 为 原 料,通 过 水 热 法 制 备 荧 光 碳 点 (Carbon Dots,
CDs)。该 CDs发射蓝色荧光,激发波长为245nm 时,445nm 处 荧 光 强 度 最 强。红 外
国,赛默飞科技有限公司);FLS980-STM 稳态/瞬态荧光光谱仪(爱丁堡仪器有限公司);NICOMP380系 列 纳 米 粒 径 与 电 位 分 析 仪 (上 海 奥 法 美 嘉 生 物 科 技 有 限 公 司 )。
柠檬酸,癌胚 抗 原 (CEA),聚 乙 烯 亚 胺 (Polyethyleneimine,PEI),5-ATACCAGCTTATTCAATT-3 癌 胚 抗 原 适 配 体 (CEA-Apts),均 购 于 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 。 实 验 用 水 为 超 纯 水 。 1.2 实验方法 1.2.1 CDs制备与表征 依据文献方法[12],以柠檬酸和聚乙 烯 亚 胺 为 前 驱 体,高 温 热 解 法 制 备 CDs。 称 取0.2g柠檬酸和0.36gPEI于洁净的烧杯中,加入15 mL 超纯水,超声分散30 min。将溶液 转 移 至 反 应釜中,置 于 马 弗 炉 中 200 ℃ 反 应 5h。 取 出,室 温 下 自 然 冷 却,得 到 CDs初 始 溶 液,接 着 将 该 溶 液 在 10000r/min转速下,离心30min,收集上清液,过夜透析处理,得到提纯后的 CDs溶液,4℃ 保存,备用。 对纯化后 CDs原溶液进行梯度稀释,采用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪,在200~800nm 波长范围 内,对 CDs溶液紫外和荧光特性进行分析。通 过 检 测 荧 光 强 度 ,获 得 最 佳 CDs浓 度 。Zeta电 位 分 析 仪 对 CDs的 水 化 粒 径 和 表 面 电 位 进 行 表 征 。 红 外 光 谱 对 CDs表 面 基 团 进 行 分 析 ,扫 描 波 长 范 围 为 400~ 4000cm-1。 1.2.2 构建 CDs-Apts荧光“关-开”探针体系 适配体为一条含有18个碱基的 DNA 单链,由于链内碱基 随机配对,适配体在溶液中出现局部茎 环 结 构,不 利 于 其 与 CDs结 合,进 而 影 响 探 针 体 系 的 检 测 灵 敏 度。 实验将适配体溶液加热至100℃维持10s,以打开链内配对碱基,同时添加适量 TCIP,阻止链内 S-S的 形 成 ,保 持 适 配 体 的 单 链 性 。 不 同 浓 度 适 配 体 与 10μg/mLCDs溶 液 充 分 混 匀 ,孵 育 30 min。 对 体 系 的 荧 光强度进行分析,选择最佳适配体浓度。在此 基 础 上,选 取 3 个 不 同 浓 度 的 CDs溶 液。 将 50μmol/L 的 适配体分别加入不同浓度 的 CDs溶 液 中,充 分 混 匀,得 到 CDs-Apts溶 液,进 行 紫 外-可 见 和 荧 光 特 性 分 析,选取最佳配比 CDs-Apts溶液体系。
种快速、简便检测 CEA 的方法。
关 键 词 :碳 点 ;适 配 体 ;荧 光 “开-关 ”;癌 胚 抗 原
中图分类号:O657.39
文献标识码:A
文章编号:1006-6144(2021)03-307-05
癌症是仅次于心血管疾病的第二大致死疾病 。 [1,2] 前5 位 癌 症 发 病 率 中 肺 癌 的 发 病 率 和 死 亡 率 都 位 于首位,临床确诊肺癌主要手段是胸部 CT 和组织 病 理,但 由 于 检 测 设 备 分 辨 率 和 技 术 所 限,较 难 观 察 到 位置隐蔽的深部癌变组织,且活检取样点随机,易造成肿瘤漏诊。因 此,急 需 开 发 一 种 无 创、快 速、灵 敏 且
图2 (a)200~300nm 激发下 CDs溶液荧光光谱:(b)CDs溶液紫外-可见光谱(插图为可见光和紫外光下 CDs溶液照片) Fig.2 (a)FluorescencespectrumofCDssolutionexcitedby200-300nm;(b)UV-VisspectrumofCDs(Theinsetsshowsthe picturesofCDssolutionundervisibleandUVlight)
基于荧光碳点(CDs)的荧光“开-关”效应,构建 CEA 检测方法简便,成本低,无需大型检测设备,在荧光探 针的构建方面表现出巨大潜力。荧 光 CDs是 一 种 至 少 在 一 维 空 间 内,尺 寸 小 于 10nm,能 稳 定 发 光 的 纳 米碳点,是目前最热门的碳纳米材料之一 。 [9] 与传统的 有 机 荧 光 染 料 相 比,CDs具 有 优 异 的 生 物 相 容 性, 化学及光稳定性且绿色环保性等诸多优点 。 [10,11] 本文采用水热法,制备单分散荧光 CDs。利用紫 外-可 见 光谱、荧光光谱、纳米粒径分析和红外光谱,对所制备的 CDs结构形貌、表面电荷、水化半径、荧光特性、表 面基团等特性进行了分析。CDs表面存在π 电子云,与适配体(Aptamers,Apts)之间由于π→π* 堆积 作 用 相互吸附,从而猝灭 CDs的荧光。当体系中出现 CEA 时,将适配体竞争性从 CDs表面解脱 附,体 系 的 荧
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张 益 霞 等 :碳 点 联 合 适 配 体 构 建 荧 光 “关-开 ”癌 胚 抗 原 探 针
第 37 卷
光得到恢复。本文基于此原理,构建一种荧光“关-开”探针体系,用于 CEA 快速分析。
1 实验部分
1.1 仪器及试剂 UV-4802紫外-可见分光光度计(上海龙尼柯仪器 有 限 公 司);NicoletiS5 傅 立 叶 变 换 红 外 光 谱 仪(美
系用于 CEA 快速检测。优化实验表明10μg/mLCDs和50μmol/L 适配体体系,荧光
猝灭效率达90%左右。体系的荧 光 恢 复 程 度 与 CEA 浓 度 之 间 存 在 线 性 相 关 性,线 性
响应范围为1ng/mL~500μg/mL,检测限为0.5ng/mL,检测时间低 于 30 min,是 一
2.3 CDs的 Zeta电位和 FTIR 分析 对 CDs溶液进行 Zeta电位测试和 FTIR 光谱分析,结果如图3所示。Zeta电位分析结果见图3(a),
表面电位为-9.96mV,较窄单峰峰形 且 呈 现 正 态 分 布,表 明 CDs在 溶 液 中 分 散 性 良 好。 红 外 光 谱 分 析 结果如图3(b)所 示。 位 于 1370~1460cm-1的 吸 收 峰 是 -COO- 的 特 征 峰[19],在 1564cm-1和 1120 cm-1处的尖峰是由于-NH 的弯曲振动和 C-NH-C 的 不 对 称 伸 缩 振 动[20],2810~2940cm-1范 围 出 现的弱吸收峰是由于 C-H 的伸缩振动,3274cm-1是 O-H 伸 缩 振 动 吸 收 峰 。 [21] 以 上 结 果 表 明 所 制 备 的 CDs表面有-COO- 、-NH2、-OH 等亲水性基团,在溶液中有良好的分散性。
光谱分析表明 CDs表 面 带 有 -COO- 、-NH2、-OH 等 亲 水 性 基 团,分 散 性 和 水 溶 性
良好。癌胚抗原(CEA)-适配体 能 显 著 猝 灭 CDs荧 光,加 入 CEA 后,由 于 适 配 体 被 竞
争性从 CDs表面解离,使 CDs的荧光得到恢复。基于此,构建一种荧光“关-开”探针体
308
第3期
分析科学学报
第 37 卷
生移动的为倍频峰,倍 频 峰 发 射 波 长 是 激 发 波 长 的 二 倍,是 由 光 的 散 射 造 成 的。 本 文 基 于 CDs荧 光 峰 (410~485nm)进行 CEA 检测探针体系构建。荧光光谱测试结果显示随着激发波长从200nm 增加到300 nm,CDs荧光先增强后减弱,当激发光波长为245nm 时,CDs溶液在445nm 处出现最强荧光发射峰。紫外可见光谱分析结果见图2(b),CDs溶液在200~230nm 处存在吸收带,是由于 C=C 共轭体系的π→π* 跃迁 所产生[17],350nm 处的吸收峰是由于羧基等不饱和体系的n→π*跃迁所产生[18]。同时,图2(b)内插图显示 CDs溶液在可见光下呈亮黄色,而在紫外光照射下为明亮的蓝光,这与445nm 处发射光谱相一致。
收 稿 日 期 :2020-01-09
修 回 日 期 :2020-02-11
基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 项 目 (No.81602506);山 西 省 青 年 科 技 研 究 基 金 (No.201901D211084)
* 通讯作者:董川,男,博士,教授,研究方向为环保可降解色料研究.E-mail:dc@
第 37 卷 第 3 期 Vol.37 No.3
分析科学学报 JOURNAL OF ANALYTICALSCIENCE
DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2021.03.006
2021 年 6 月 June 2021
碳点联合适配体构建
2 结果与讨论
2.1 CDs和 Apts构建荧光“关-开”探针的机理 CDs的荧光性能稳定,其表面具备高密度π 电子云,能够吸收激发光能量,进而产生电子跃迁,发射较
强荧光,被广泛用于生物分子的定量检测 。 [13,14] 适配体加入 CDs溶液时,由于π-π 堆积 作 用,适 配 体 被 吸 附在 CDs的表面,从而猝灭了 CDs的荧光 。 [15,16] 当待检测目标 CEA 加入 体 系 中,由 于 CEA 和 适 配 体 之 间天然的生物高特异性识别和亲和力,这 种 作 用 远 大 于π-π 堆 积 作 用,从 而 将 适 配 体 从 CDs表 面 竞 争 性 解吸附,进而 CDs荧光得到恢复。本文基于荧光“关-开”效应,构建 CEA 探针体系,其原理如图1所示。
图1 CDs-Apts“关-开”体系检测 CEA 的原理图 Fig.1 SchematicdiagramofCDs-Apts"off-on"systemfordetectingCEA
2.2 CDs荧光和紫外-可见光谱特性 从 图 2(a)可 见 ,CDs荧 光 光 谱 为 双 峰 形 式 ,不 随 激 发 波 长 变 化 而 移 动 的 为 荧 光 峰 ,随 激 发 波 长 变 化 发
能 够 在 早 期 预 警 和 诊 断 肺 癌 的 方 法 。 癌 胚 抗 原 (CarcinoembryonicAntigen,CEA)是 一 类 广 谱 性 癌 症 标 志 物,属于细胞表面糖蛋白家族,分子量为180~200kDa,于1965年首次在人 结 肠 癌 组 织 中 发 现 。 [3,4] 在 健 康成人体内 CEA 水平通常为0~5ng/mL 左右,当人 体 组 织 出 现 癌 变 后,血 液 中 CEA 含 量 开 始 升 高,一 般高于20ng/mL。研究表 明 不 同 类 型 癌 症 患 者,血 液 CEA 检 测 阳 性 率 均 达 到 了 显 著 水 平 。 [5,6] 同 时, CEA 还可与其他肿瘤标志物联合检测,作为癌症诊断依据,提高对肿瘤的 确 诊 正 确 率 。 [7] 除 此 之 外,血 清 CEA 水平对肿瘤复发的敏感性达80% 以 上,早 于 临 床 和 病 理 检 查[8]。 因 此,血 清 CEA 水 平 被 临 床 用 于 癌症患者术后疗效的追踪。可见,血液中的 CEA 水平可以用于癌症的预警、诊断以及疗效监测。
(1.太原理工大学生物医学工程学院,山西太原 030024; 2.山西大学环境科学研究所,山西太原 030006)
摘 要:以 柠 檬 酸 和 聚 乙 烯 亚 胺 为 原 料,通 过 水 热 法 制 备 荧 光 碳 点 (Carbon Dots,
CDs)。该 CDs发射蓝色荧光,激发波长为245nm 时,445nm 处 荧 光 强 度 最 强。红 外
国,赛默飞科技有限公司);FLS980-STM 稳态/瞬态荧光光谱仪(爱丁堡仪器有限公司);NICOMP380系 列 纳 米 粒 径 与 电 位 分 析 仪 (上 海 奥 法 美 嘉 生 物 科 技 有 限 公 司 )。
柠檬酸,癌胚 抗 原 (CEA),聚 乙 烯 亚 胺 (Polyethyleneimine,PEI),5-ATACCAGCTTATTCAATT-3 癌 胚 抗 原 适 配 体 (CEA-Apts),均 购 于 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 。 实 验 用 水 为 超 纯 水 。 1.2 实验方法 1.2.1 CDs制备与表征 依据文献方法[12],以柠檬酸和聚乙 烯 亚 胺 为 前 驱 体,高 温 热 解 法 制 备 CDs。 称 取0.2g柠檬酸和0.36gPEI于洁净的烧杯中,加入15 mL 超纯水,超声分散30 min。将溶液 转 移 至 反 应釜中,置 于 马 弗 炉 中 200 ℃ 反 应 5h。 取 出,室 温 下 自 然 冷 却,得 到 CDs初 始 溶 液,接 着 将 该 溶 液 在 10000r/min转速下,离心30min,收集上清液,过夜透析处理,得到提纯后的 CDs溶液,4℃ 保存,备用。 对纯化后 CDs原溶液进行梯度稀释,采用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪,在200~800nm 波长范围 内,对 CDs溶液紫外和荧光特性进行分析。通 过 检 测 荧 光 强 度 ,获 得 最 佳 CDs浓 度 。Zeta电 位 分 析 仪 对 CDs的 水 化 粒 径 和 表 面 电 位 进 行 表 征 。 红 外 光 谱 对 CDs表 面 基 团 进 行 分 析 ,扫 描 波 长 范 围 为 400~ 4000cm-1。 1.2.2 构建 CDs-Apts荧光“关-开”探针体系 适配体为一条含有18个碱基的 DNA 单链,由于链内碱基 随机配对,适配体在溶液中出现局部茎 环 结 构,不 利 于 其 与 CDs结 合,进 而 影 响 探 针 体 系 的 检 测 灵 敏 度。 实验将适配体溶液加热至100℃维持10s,以打开链内配对碱基,同时添加适量 TCIP,阻止链内 S-S的 形 成 ,保 持 适 配 体 的 单 链 性 。 不 同 浓 度 适 配 体 与 10μg/mLCDs溶 液 充 分 混 匀 ,孵 育 30 min。 对 体 系 的 荧 光强度进行分析,选择最佳适配体浓度。在此 基 础 上,选 取 3 个 不 同 浓 度 的 CDs溶 液。 将 50μmol/L 的 适配体分别加入不同浓度 的 CDs溶 液 中,充 分 混 匀,得 到 CDs-Apts溶 液,进 行 紫 外-可 见 和 荧 光 特 性 分 析,选取最佳配比 CDs-Apts溶液体系。
种快速、简便检测 CEA 的方法。
关 键 词 :碳 点 ;适 配 体 ;荧 光 “开-关 ”;癌 胚 抗 原
中图分类号:O657.39
文献标识码:A
文章编号:1006-6144(2021)03-307-05
癌症是仅次于心血管疾病的第二大致死疾病 。 [1,2] 前5 位 癌 症 发 病 率 中 肺 癌 的 发 病 率 和 死 亡 率 都 位 于首位,临床确诊肺癌主要手段是胸部 CT 和组织 病 理,但 由 于 检 测 设 备 分 辨 率 和 技 术 所 限,较 难 观 察 到 位置隐蔽的深部癌变组织,且活检取样点随机,易造成肿瘤漏诊。因 此,急 需 开 发 一 种 无 创、快 速、灵 敏 且
图2 (a)200~300nm 激发下 CDs溶液荧光光谱:(b)CDs溶液紫外-可见光谱(插图为可见光和紫外光下 CDs溶液照片) Fig.2 (a)FluorescencespectrumofCDssolutionexcitedby200-300nm;(b)UV-VisspectrumofCDs(Theinsetsshowsthe picturesofCDssolutionundervisibleandUVlight)