食品酶学本ppt课件

5、离子交换层析操作流程
①离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析； ②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过
滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。
离子交换柱层析主要操作过程： （1〕离子交换剂的处理与装柱 （2〕上柱 （3〕洗脱和收集 （4〕离子交换剂的再生
（1〕离子交换剂的处理与装柱
①预处理：浸泡与脱气
（4〕离子交换剂的再生
洗脱收集完毕后，为使离子交换剂再次使用，需要经过再生 处理。
①含杂质较少时，再生只要用酸、碱或盐进行转型即可； ②含杂质较多的情况下，再生时要先经过酸、碱浸泡清洗，
用水洗至中性，然后再转型，以备再次上柱进行交换。如此 循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。 如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的 防腐剂以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用0.02%的叠 氮钠作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是10ppm 的苯乙酸汞等。
Kd值的意义
Ve-Vo
Kd值的计算
Kd= Vi
3、凝胶种类：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
层析介质
常用凝胶过滤
4、影响凝胶过滤的因素： 5、凝胶过滤层析的应用：
1、凝胶过滤层析的原理
2、分配系数
为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数 Kd来量度。 Kd值是反映凝胶对溶质排阻程度的量。
Kd
Ve Vo Vi
在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的 Kd值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的 分离效果。
Vo和Vi 的测定
当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积 和外水体积中的分布是不一样的。
Vo ：溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔 内 ， 如 蓝 色 葡 聚 糖 〔blue dextran ， 分 子 量 约 2 000 000），而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积 Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kd=0)。
Kd
Ve Vo Vi
Ve：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组 分出现高峰时所用洗脱液体积〔mL）
Vo：外〔水〕体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积〔mL） Vi：内〔水〕体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积(mL)
（1〕Kd值的意义
Kd=0时 即Ve=Vo，该组分足够大，不能进入微孔，最先 流出。
③装柱
转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分 离效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹。装好 后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。
（2〕上柱
①样品液的控制：上柱时要注意酶液的pH值、温度和离子 强度等条件。
②上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。 当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽 快均匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进 行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和 为止。
存要防腐。葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附 作用。当离子强度大于0.05时吸附作用可丧失。 葡聚糖凝胶的操作流程
葡聚糖凝胶的操作流程
选择凝胶和溶胀：可根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗 中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸 过夜或沸水煮2hr〔速度快且可以杀菌）。
装柱：均匀、无纹路、无气泡〔兰色葡聚糖2000检验），用 缓冲液平衡。
上样和洗脱：体积不超过柱床体积的1/ 40。然后用缓冲液 洗脱，注意流速和操作压。
再生：稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生 长， 加0.02% NaN3〔使用时可能会抑制所要分离的酶）。
（2〕琼脂糖凝胶
构成： 由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖连接构成的糖链。本 身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳 定的网状结构。
Vi：溶液中的分子小于凝胶孔径下限者,（如T2O，tritium oxide，氧化氚，氚水〕能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的 洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kd=1)。也可从凝胶干、湿重差求得。
而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能 进 入 部 分 凝 胶 网 孔 中 ， 故 其 洗 脱 体 积 Ve 是 在 Vo 和 Vt 之 间 〔Kd在0～1之间）。
（1〕葡聚糖凝胶
构成： 以葡聚糖〔葡萄糖通过1，6糖苷键结合而成的线性 高分子〕为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交联剂聚合而成。 Sephadex：G值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的10 倍。如：G-25表示1g凝胶可吸收2.5ml水。
G值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离； G值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。 特点： 有良好的化学稳定性〔耐酸碱〕和热稳定性，室温保
常用离子交换介质
离子交换剂保存剂
4、离子交换剂的选择
离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性 酶在pH ＜pI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂； 酶在pH ＞pI的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂； 在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。
强弱离子交换剂的选择： 强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。 弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。 酶蛋白的pI为6- 9时，考虑用强型离子交换剂。 基质的选择： 分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。
2、吸附剂
硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例
一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附，而在
提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗脱出来。
3、吸附层析方法 枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，
①吸附剂可装在吸附柱可上吸进附行在吸氧化附铝柱上层，析再；用pH8～9的
②使酶把解吸吸附而剂洗加脱到出酶来液。中N在附，ap，3H再吸P6O在.附53p～溶后H8液9过.～5洗滤条1脱1件出；.5下中来的，性2，用% 蛋再硅白氯藻加酶化土可洗钠吸脱剂，
Sepharose：数字表示琼脂糖含量〔2B表示含量为 2%），数字越大含量越高，但筛孔越小。
特点：孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。
Sepharose-CL型 ：是琼脂糖在强碱性条件下与1,3-二溴 异丙醇生成的交联型琼脂糖。孔径与同浓度未交联琼脂糖相 同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在0-40℃ 、 pH3-14间使用。
反离子
基质 电荷基团
3、离子交换剂的种类
4、离子交换剂的选择
5、离子交换层析的操作流程
6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、 分辨率高、测定蛋白质的等电点。
离子交换原理图
3、离子交换剂的种类
基质
疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离 小分子物质。大孔树脂可用于酶 。（离子交换树脂）
（三〕凝胶过滤层析
1、原理：依据分子筛效应，按分子的大小和形状来分离样 品。当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔 径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部 而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程 相对较短。
2、分配系数〔Kd）：反映凝胶对溶质排阻程度的量。
亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。 （离子交换纤维素、离子交换凝胶）
阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+）， 电荷基团 与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型
阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-）， 与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型
常用的离子交换介〔基〕质 离子交换剂保存剂
第三章 酶的分离纯化
概述 第一节 起始材料的选择 第二节 细胞破碎 第三节 酶的提取 第四节 分离方法 第五节 酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价 复习题
分离方法分述
一、离心分离法 二、过滤与膜分离 三、沉淀分离法 四、层析分离法 五、电泳分离法 六、酶的结晶 七、浓缩与干燥
四、层析分离法
亲水性离子交换剂
离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲 水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是 目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有 DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC〔羧甲基纤维素〕等。
离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引 入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和 分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化 方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE 聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE〔磺酸乙基〕 葡聚糖凝胶、SP〔磺酸丙基〕葡聚糖凝胶等。
将干燥的离子交换剂用水浸泡2h以上，充分吸水膨胀后， 减压抽除气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清。再先后用4 倍体积左右的2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠浸泡各4h， 再用无离子水洗至中性。
②转型
经上述处理后的离子交换剂需经转型，使离子交换剂所带 的可交换离子转变为适当的离子型。如阳离子交换剂用 NaOH处理，转为Na+型；用HCl处理，转为H+型。阴 离子交换剂用NaOH处理成OH-型；用HCl处理成Cl-型等。 交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。
②洗脱目标物
用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力 自小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到分离目 的。
若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分离效 果。为此，可采用连续或阶梯式的梯度洗脱法。即采用按 一定规律改变pH值〔pH值梯度〕或盐浓度〔浓度梯度〕的 洗脱液进行洗脱。连续梯度洗脱液可按预先设计的梯度范 围，在梯度混合器中配置。而阶梯式梯度洗脱液则分别配 置几种不同pH值或不同盐浓度的缓冲液，使用时按设计好 次序依次洗脱。
③流速的控制：要控制好流速。流速太快，分离效果不好； 流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太 细，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太 慢时，为加快离子交换层析速度，可采用在柱进口适当加 压或在出口适当减压的方法。
（3〕洗脱和收集
①洗未吸附物
上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附的物 质洗出。
原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程 度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组 分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。
吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物 中的各组分分离的方法。
离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电 引力的不同来进行物质分离的。
（3〕聚丙烯酰胺凝胶
构成：人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯 酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联 剂浓度可改变凝胶孔径。
Kd=1时 即Ve=Vo+Vi，该组分可进入全部的微孔，最后 流出。
Kd0可<定Kd量<地1衡K量d各小组的分先的流流出出，顺K序d，大也的是后判流断出分。离效果的参数。 当Kd差异大时，分离效果好， 差异小时，分离效果差。
Ve-Vo Kd=
Vi
（2〕Kd值的计算
Ve、Vo和Vi与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱 量的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的凝 胶柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在 使用于酶液分离之前，通过试验，测定该层析柱的Vo和Vi （图例） ， 并对某些已知组分的Ve进行测定，从而计算出 其Kd值。
凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以 各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进 行分离的技术。
亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和 力，使生物分子分离纯化的技术。
（一〕吸附层析法
1、概念
吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混 合物中的各组分分离的方法。图
4、特点与应用
溶液中洗脱出来。
设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具
有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛
应用的层析分离技术。
吸附层析法图
（二〕离子交换层静电引力 的不同来进行物质分离。
2、离子交换剂的构成：基质、功能基团〔电荷基团）、反离 子。羧甲基纤维素〔CM-纤维素）：纤维素-O-CH2-COONa