双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定
uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达
ｕＰＡ基因重组ＧＦＰ－腺相关病毒载体质粒的构建及其表达摘要：利用基因重组技术，用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得μPA cDNA，再克隆到质粒pAAv-IRES-hrGFP的多克隆位点，构建重组质粒pAA V-hrGFP-uPA，通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性，采用磷酸钙共沉淀法，以重组质粒pAAv-hrCFP-uPA和pAAv-RC、pHelper共转染AAv-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒；用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中，倒置荧光显微镜观察GFP的表达，用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达，结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒，病毒滴度达每mL4×1013病毒颗粒，60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒，感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白，为今后建立AA V－uPA 基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础。
关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA 激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AA V)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。
GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达
第26卷第4期2005年8月西安交通大学学报(医学版)J o u r n a l o fX i'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l.26N o.4A u g.2005G F P重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在N I H3T3细胞中的表达邢俊平1,2,杨宇3,王全颖4,杨广笑4,邱曙东2(1.西安交通大学第一医院泌尿外科;2.西安交通大学生殖医学研究中心,陕西西安710061;3.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春130021;4.西安华广生物工程公司分子生物学实验室,陕西西安710025)摘要:目的构建以绿色荧光蛋白(G F P)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。
方法采用D N A重组技术将G F P基因片段亚克隆到p s s H G C MV载体的E c o RⅠ和B a m HⅠ位点,构建表达G F P重组腺相关病毒载体p s s H G C MV-G F P。
以此载体转染143细胞进行G F P重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。
用地高辛标记的C MV p o l y A片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。
采用氯化钙法体外转染培养的N I H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。
结果成功构建了G F P重组腺相关病毒载体和报告病毒-V s s C MV-G F P,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/m L。
重组腺相关病毒V s s C MV-G F P感染N I H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。
结论V s s C MV-G F P对真核细胞具有感染能力,并且G F P可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。
多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定
多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。
方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。
结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。
结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【Abstract】Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells．Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．【Key words】Multi-drug resistance gene (MDR1)；Adenovirus vector；Transfection多药耐药性（multidrug resistance，MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。
携带HGF基因的重组腺病毒表达载体的构建
ｒｔ［ ］ ａｃ Ｔｓｕ ｎ，１８ ４ （ ） ７ ａｓＪ ．Ｃ ｉ ｉ ｅＩｔ ９ ８， ３ ３ ：１９—１３ ｌ ｆ ｓ ８．
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５ ９． ４
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２ ８． ３
［ ］ 张婉虹 ， ５ 谢华．牡 蛎 肉水 提液延缓去 卵巢大 鼠脑 衰老的作用 ［］ Ｊ ．中国老年学杂 志， ０ ７， ７（ ：１３ ２ ０ ２ ７） ２９—１４ ． ２１
［ ］ ＷＲ Ｎ Ｋ ， Ｉ Ｔ Ｏ ６ Ｏ Ｓ Ｉ Ｊ Ｃ Ｎ Ｒ Ｎ Ｍ，Ｄ ＮＬＭ．Ｔｍｐｒ ｌｔ ｎｈｐ Ｔ ＡＮ ｅ ｏａ ｒ ａｏｓｉ ｌｅ ｉ
分开 ， 其参 与糖 盐代 谢 ， 降低 血 清磷 脂 和胆 固醇 的含 量， 改善脂质代 谢 ， 增加 肌糖元 的蓄积 ， 减少 钾 、 、 磷 硫 随尿排出 ， 阻止 骨 中钙 、 溶解 ， 磷 并促 进钙 、 沉积 ， 磷 加 速骨钙化 和骨细胞 间质形成 ， 促进 骨 的生长 。临床 上可用 于骨质疏松症 的辅助治疗 ， 促进骨质形成 ， 改变
人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
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பைடு நூலகம்
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表达双功能融合蛋白（sCAR-EGF）腺病毒载体的构建及其活性检测
表达双功能融合蛋白（sCAR-EGF）腺病毒载体的构建及其活性检测表达双功能融合蛋白(sCAR-EGF)腺病毒载体的构建及其活性检测为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie virus-Adenovirus Receptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermal growth factor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315.利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF.经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF 融合基因片段,Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白.体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR 的肿瘤的靶向性基因治疗提供了新的手段.作者：任鹏康王丰李惠明李宗海黄倩 REN Peng-Kang WANG Feng LI Hui-Ming LI Zong-Hai HUANG Qian 作者单位：任鹏康,REN Peng-Kang(上海市第一人民医院中心实验室,上海,200080) 王丰,李惠明,黄倩,WANG Feng,LI Hui-Ming,HUANG Qian(上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080)李宗海,LI Zong-Hai(上海交通大学肿瘤研究所癌基因及相关基因研究国家重点实验室,上海,200032)刊名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(5) 分类号：Q81 关键词：腺病毒表皮生长因子受体基因治疗柯萨奇病毒-腺病毒受体。
通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究
通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究郑国玺，韦俊荣，祝康，侯瑾，施典羽，朱嘹亮，杨广笑，王全颖【关键词】重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因医治；NIH3T3摘要：目的构建基因医治通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。
方式利用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV。
在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后，利用pSSHGCMVGFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。
应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观看GFP表达。
结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL，浓缩后可达2×1013cfu/mL，说明成功地构建了重组AAV载体。
插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。
感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。
结论构建的重组AAV通用载体pSSHGCMV 可转染外源基因，这为进一步的基因医治奠定了基础。
关键词：重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因医治；NIH3T3Construction of a gengeral adenoassociated virus vector and GFP expression in rat NIH3T3 transduced by the rAAV vectorABSTRACT: Objective To construct a universal adenoassociated virus (AAV) vector and to detect the ability of the rAAV vector to transfer gene into the target cell. Methods By using recombinant technique, the gene elements of AAV Rep and Cap genes between ITRs of pSSV9int- plasmid were replaced by expressing cassette in pACCMVpLpA plasmid, a recombinant adenovirus shuttle vector. The expressing cassette included a CMV promoter, a multicloning sites (MCS) and a polyA signal. The new plasmid constructed was named pSSVHGCMV, which was a universal adenoassociated virus (AAV) vector. After GFP report gene was inserted into MCS of the plasmid, the rAAV vector expressing GFP, pSSVHGCMVGFP plasmid, have been constructed and then it introduced into 293 cell by method of Ca3(PO4)2 using three plasmids of pSSVHGCMVGFP, pGF140 and pAAV/Ad. After the cell was transfected for 72h, the rAAV was harvestd and the titrations of rAAV stocks and rAAV concentrated were detected by dotblot test using digGFP probe. The GFP expression in ratNIH3T3 was observed by fluorescence microscop after the cell was infected for 24, 48 and 72h. Results Titration of rAAV stock produced using new rAAV vector and procedure ranged between 1×1011 and 2×1012 total practicles/mL, and it was increased 100 times in rAAV concentrated than it did in rAAV stock. The NIH3T3 infected rGFPAAV expressed significantly GFP fluorescence, which showed that rGFPAAV was infectious virions. Conclusion The rAAV vector constructed in this paper, pSSHGCMV plasmid, can transfer exterior gene into the target cell using proceeding of recombinant AAV and it may be used in research of gene therapy.KEY WORDS: recombinate adenoassociated virus; vector; report gene; gene therapy; NIH3T3感音神经性耳聋是现今危害人类健康的重大疾病。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定
质 粒组成 。限制性 内切 酶 ，４Ｄ Ａ连 接酶 ， 粒 提 Ｔ Ｎ 质
有研究 发 现 ，Ｑ ｓ 与 肿瘤 细胞 的增 殖 与 迁 移 。 Ａ Ｐ参
２１ ０ １年 ３～６月 ， 们 通 过 实 验 成 功 构 建 了表 达 我
取试剂盒。兔抗人 Ａ Ｐ Ｑ ５多克隆抗体 ， 鼠抗人 Ｇ Ｐ Ａ— Ｄ Ｈ单克隆抗体及酶标抗鼠， 抗兔 Ｉ 。 ｇ Ｇ
ｓ ａｅ ａ ｈ ｅ ｔ ｉ ｓｖ ｃｏ ｓ ｃ ｎ ｔ ｃｅ ｕ ｃ ｓｆ ｌ ．Ｔ ｅ ｃ ｎ ｔｕ ｔｄ ｖｒ ｓｗｅ ｅ ｏ ｔｉ ｅ ｎ ｎｅ ｔｄ Ｓ Ｃ ９ １ ｔ ｔ ｄ ｔ ｔ ｅ ｌ ｎｉ ｒ ｅ ｔｒｗａ ｏ ｓｒ ｔｄ ｓ ｃ ｅ ｓｕ ｌ ｒ ｈ ｔ ｖｕ ｕ ｙ ｈ ｏ ｓｒ ｃｅ ｉ ｒ ｂ ａｎ ｄ ａ ｄ ｉ ｆｃｅ Ｇ ７ ０ ｕ
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１ ７
山东 医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 ４ ０１ １ ２期 １２２ ｐ Ｔ —Ｑ ５慢 病 毒 质粒 的构 建 及 鉴 定 ． ． ＷＰ ＳＡ Ｐ
对 扩增 出的 Ａ Ｐ Ｑ ５基 因全长 片段 以及 Ｐ Ｔ — Ｆ 用 ＷＰ ＳＧ Ｐ
ｃ ｓ ｆ ｌ ｏ ｓｒ ｃｅ ． ｅ ｓ ｌ ｃ ｎ ｔ ｔｄ ｕ ｙ ｕ Ｋｅ ｒ ｓ ａ ｕ ｐ ｆｎ ；Ｓ Ｃ ９ １ ｃ ｌ ；２ ３ ｅｌ ；ｌｎ ｉｉａ ｅ ｔｒ ｙ ｗｏ ｄ ： ｑ ａ ｏ ｓ Ｇ ７ ０ ｅｌ ｉ ｓ ９ Ｔｃｌ ｓ ｅ ｔ ｒ ｌ ｃｏ ｖ ｖ
１ １ 材 料 人 胚 肾 细 胞 ２ ３ 人 胃 癌 细 胞 株 ． ９ Ｔ，
基金项 目： 国家 自然科学基 金资助项 目（０ ０ ４ １ ； ３９ １２ ） 江苏省卫 生厅 开放课题基金资助项 目（ Ｋ ３ ０ ９３ 。 Ｘ ０ ２ ００ ） 通讯作者
大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建的开题报告
大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建的开题报告一、研究背景和意义FXYD家族蛋白是一类调节离子通道和转运蛋白质的本体蛋白，FXYD5是其中一员，也称为dysadherin或者prostate-associated androgen-regulated gene 1 (PAGE-1)。
FXYD5在多种癌症中的异常表达与患者的预后密切相关，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌等。
对于FXYD5的研究能够揭示其在肿瘤发生和发展中的作用，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。
重组腺病毒作为一种传统基因工程技术，因其高效性、低毒性、大载荷和广谱转染等特点，已成为研究FXYD5功能和机制的重要工具，同时也为临床基因治疗提供了新的方法和途径。
因此，本研究旨在克隆大鼠FXYD5基因，并构建重组腺病毒载体，从而为深入研究FXYD5的功能和机制提供工具和手段。
二、研究内容和方法1. 克隆大鼠FXYD5基因：从大鼠基因组中设计引物，扩增大鼠FXYD5基因，将其克隆至质粒载体中，利用测序进行基因确认。
2. 构建重组腺病毒载体：将FXYD5基因与重组腺病毒载体进行重组，在适当的细胞中进行病毒包装和扩增，最终得到高纯度的重组腺病毒载体。
3. 鉴定重组腺病毒：通过PCR和Western blotting等方法对重组腺病毒进行鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。
三、预期结果和意义1. 成功克隆大鼠FXYD5基因，为FXYD5功能和机制的研究提供了工具和手段。
2. 成功构建重组腺病毒载体，为进一步探究FXYD5在肿瘤发生和发展中的作用提供了新的思路和方法。
3. 通过鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。
重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定
成 功构建携 带 ｈ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ １ ６ ５基 因重组腺 病毒 载体
Ａ ｄ ５一 ｈ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ １ ６ ５一Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ并 获得 高滴度病毒颗粒 ， 为ｈ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ １ ６ ５基 因功能研究 以及 细胞移植 、 基 因治疗提供 有效
［ 关键词 ］ 人血管 内皮细胞 ； 基 因治疗 ； 牙周组织再生； ５型复制缺 陷型腺病毒 ［ 中图分 类号 ］ Ｒ ３ １ ８ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号］ ２ ０ ９ ５—１ ４ ３ ４ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ７ ． ０ ０ ２
［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｉ ｓ ｔ ｏ ｍａ ｄ ｅ ａ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｃ ａ ｒ ｒ ｙ ｉ ｎ ｇ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ
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重 组腺 病 毒载 体 Ａ ｄ ５一ｈ Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ １ ６ ５一Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ的构 建 与鉴定
一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用[发明专利]
![一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cbc49102551810a6f42486b6.png)
专利名称：一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用
专利类型：发明专利
发明人：郜发宝,王一帆,刘婷
申请号：CN201210108130.8
申请日：20120413
公开号：CN103160539A
公开日：
20130619
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种重组腺病毒载体，含有人转铁蛋白受体基因和萤火虫荧光素酶基因，能在真核细胞中同时表达转铁蛋白受体蛋白和荧光素酶蛋白。
其构建方法，其特征在于依次为以下步骤：(1)用PCR方法扩增人转铁蛋白受体基因；(2)将步骤(1)扩增的人转铁蛋白受体基因片段插入到含有萤火虫荧光素酶基因片段的穿梭载体上，获得重组穿梭载体，并进行测序分析；(3)将验证正确后的重组穿梭载体连接到骨架载体上，得到重组腺病毒质粒；(4)对所述重组腺病毒质粒进行XhoI酶切鉴定；(5)用人胚肾细胞系HEK293细胞包装所述重组腺病毒质粒，获得重组腺病毒载体。
实验表明，所述重组腺病毒载体可在磁共振和光学双模态成像中作为肿瘤示踪剂应用。
申请人：郜发宝
地址：610041 四川省成都市二环路南四段19号檀香山3-3-1004
国籍：CN
代理机构：成都科海专利事务有限责任公司
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表达双功能融合蛋白(sCAR-EGF)腺病毒载体的构建及其活性检测
（ $&-5>;） 购自 S%03% !+,T 公司。 E1P 司， 789 的抗体 标记的山羊抗小鼠二抗 （ $&-5OO;） 和山羊抗兔二抗 为 S%03% !+,T 公司产品， 逆转录试剂盒为 （$&-5OO:） ?@I 9)+B)03%$ 公司产品。高保真 2N, 酶为 S3+%3%Q)0) 公司产品。人 789 定量 7LIS. 检测试剂盒购自上 海森 雄 科 技 实 业 有 限 公 司。 L,&(N)+%$) %$$%A $A$3)B 购自 P+"B)Q% 公司。 腺病毒包装细胞 .D-5U6 购 ! #! # $ 细胞株及病毒： 自 S3+%3%Q)0) 公司， 人肝癌细胞系 S??!->>54，人视 网膜母细胞瘤细胞系 EVK-1=:: ， 人慢性髓性粒细胞 白血病细胞系 H-;<5， 人肺癌细胞系 .;:U 等细胞购 自中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院细 胞库， 人卵巢癌细胞系 SHKW-6 由上海交通大学肿 瘤研究所惠赠。 .;:U 细胞采用含 4OX 胎牛血清的 D?7?-945 培 养 基 培 养。 .D-5U6 细 胞， S??!->>54 和 SHKW-6 细 胞 均 采 用 含 4OX 新 生 小 牛 血 清 的 D?7? 培养基培养。EVK-1=:: 和 H-;<5 用含 4OX 新 生小 牛 血 清 的 1P?I-4<:O 培 养 基 培 养。 表 达 F,&(N)+%$) 的腺病毒 ./;-!?W-F,& 由本实验室构建并 保存。 !"$ !"$"! 方法 全长和胞外段 !.1 编码基因的克隆： 采用 抽取 细胞的总 ， 然后由 C+(T"F .D-5U6 1M. 9)+B)03%$ 逆转录制备 &DM.。以此 &DM. 为模板分别用引物 （下 N!.1-9： ;!!!8!!C.!!C8!.8!!8-6Y 划 线 为 !"# 1 " 切 点 ） 和 N!.1-1： ;Y-8! （下划线为 C!C.8.8.8.!.C.C88.88!C!C.C.!-6Y 采用适 $%& "切点） P!1 扩增全长的 !.1 的 &DM.， 当的 限 制 性 内 切 酶 消 化 P!1 产 物 后 插 入 质 粒 （[） 中， 得到质粒 2&DM.6Z4 \ N!.1。用 2&DM.6Z4 引物 $!.1-9： ;!!!8!!C.!!C8!.8!!8-6Y （ 下 划 线 为 !"# 1 " 切 点 ）和 $!.1-1 ：;Y!888.C!!.8!C8..88.888.!..!-6Y（ 下 划线 为 ’&( E " 切 点） 从 质 粒 2&DM.6Z4-N!.1 中 产物经 P!1 扩增出编码 !.1 基因的胞外段 &DM.， 限制性内切酶消化后插入腺病毒穿梭质粒 2D!64; 中得到重组质粒 2D!64;-$!.1。进一步用 !"# 1"， ’&( E"酶切和测序进行鉴定。 !"$"$ 融合基因 $!.1-789 的克隆和鉴定：采用引 物 789-9： ;Y-!888.C!!88C88C88!88CC!C （下划线为 ’&( E" 切点） 和 789-1： !!8-6Y ;Y-
重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定
重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定曾理;唐泽飞;李春鸣【摘要】目的构建携带有NM23的重组腺病毒载体并观察其对人胃癌细胞株BGC-823凋亡的影响.方法以质粒NM23-PIRES2-EGFP为模版,采用PCR扩增NM23基因,克隆至腺病毒载体pCMV-MCS-IRES-EGFP上,形成重组腺病毒载体pCMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鉴定及基因测序.将人胃癌细胞株BGC-823分为实验组(NM23-OE组,感染pCMV-NM23-IRES-EGFP)、空白组(Ctrl组),阴性对照组(NC组,感染pCMV-MCS-IRES-EGFP);Real Time PCR和Western Blot分别检测3组细胞中NM23mRNA和蛋白表达;流式细胞仪检测3组细胞凋亡率.结果经酶切鉴定和基因测序证实成功构建重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP;经扩增后,重组腺病毒的滴度为4.0×1010 ifu/mL;RT-PCR及Western blot结果显示,阴性对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05),而实验组的NM23的mRNA 和蛋白表达显著高于其他两组(P<0.05);实验组BGC-823细胞的凋亡率也显著高于其他两组(P<0.05).结论成功构建了过表达NM23的重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体,通过上调NM23基因的表达,可观察到胃癌细胞株BGC-823的凋亡水平有明显升高,为后续研究NM23基因对人胃腺癌细胞生物学功能的影响提供实验基础.%Objective To construct the re-combinant adenovirus vector carrying with gene NM23 and observe the influence on the apoptosis of human carcinoma of stomach cell line BGC-823.Methods The NM23 gene was amplified by PCR using plasmid NM23-PIRES2-EGFP as templateand cloned into adenovirus vector pCMV-MCS-IRES-EGFP.The recombinant adenovirus vector pCMV-NM23-IRES-EGFP was identified by restriction enzyme digestion and gene sequencing.The human gastric cancer cell lineBGC-823 was divided into experimental group (NM23-OE group,infected pCMV-NM23-IRES-EGFP),blank group (Ctrl group),negative control group (NC group,infected pCMV-MCS-IRES-EGFP).The mRNA and protein expressions of NM23 gene were detected by real Time PCR and western blot assay.The apoptosis was detected by flow cytometry.Results The recombinant adenovirus pCMV-NM23-IRES-EGFP was supported by restriction enzyme digestion and gene sequencing.After amplification,the titer of re-constructed ad enovirus was 4.0×1010 ifu/pared with the NC group,there was no significant difference between the Ctrl group and the NC group (P>0.05).The mRNA and protein expressions of NM23 gene in the NM23-OE group were higher than those in the other twogroups(P<0.05).The apoptosis rate of human gastric cancer cell line BGC-823 in the NM23-OE group was also higher than that in the other two groups (P<0.05).Conclusion The recombinant adenovirus pCMV-NM23-IRES-EGFP vector is successfully constructed.The expression of NM23 gene is significantly increased by up-regulating the expression of NM23 gene BGC-823.These data could provide an experimental basis for the subsequent study on the effect of NM23 gene on the biological function of human gastric adenocarcinoma cells.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2017(040)002【总页数】6页(P166-171)【关键词】NM23;载体;BGC-823;腺病毒;凋亡【作者】曾理;唐泽飞;李春鸣【作者单位】遵义医学院附属医院病理科,贵州遵义 563099;遵义医学院附属医院病理科,贵州遵义 563099;遵义医学院附属医院病理科,贵州遵义 563099【正文语种】中文【中图分类】R363临床医学研究NM23基因最早发现于1988年，是由美国国立癌症研究所的Steeg等[1]用消减杂交分离的方法从7个K-1735小鼠黑色素瘤细胞株中分离出来并克隆成功。
重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定
重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定王长昇;林建华;吴朝阳【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2009(013)020【摘要】背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF 为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.【总页数】5页(P3947-3951)【作者】王长昇;林建华;吴朝阳【作者单位】福建医科大学附属第一医院骨科,福建省福州市,350005;福建医科大学附属第一医院骨科,福建省福州市,350005;福建医科大学附属第一医院骨科,福建省福州市,350005【正文语种】中文【中图分类】R349.33【相关文献】1.大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德;2.重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的构建及体外转染大鼠间充质干细胞后基因表达[J], 王长昇;林建华;吴朝阳;张立群3.大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德4.抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郑涛;杨简;刘晓雯;杨英;李奇;杨俊5.抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郑涛;杨简;刘晓雯;杨英;李奇;杨俊;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定
GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿【摘要】目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法将目的基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid 正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.%Objective To construct a novel enhanced green fluorescent protein (EGFP) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) recombinant baculovirus. Methods The target gene(EGFP and GDNF) was cloned into baculovirus transfer vector pFastBacDual, pFB-EGFP-GDNF was constructed and restriction enzyme analysis was conducted. pFB-EGFP-GDNF was transposited with baculovirus shuttle vector (Bacmid) into DH10Bac competent cells, and recombination baculovirus vector Bacmid-EGFP-GDNF was constructed. The plasmid was extracted and PCR was performed for identification. Bacmid-EGFP-GDNF was transfected with Sf9 insect cell package virus by liposomal transfectionmethod. Immunofluorescent staining was employed to detect the expression of EGFP and GDNF protein in St9 cells. Results The target gene fragment was correctly cloned into pFastBaeDual vector, and recombinant Bacmid was constructed. Bacmid-EGFP-GDNF was successfully transfected, and higher virus titer was obtained. The coexpression of GDNF and EGFP protein in Sf9 cells was identified by immunofluorescent staining. Conclusion The recombinant baculovirus Bacmid-EGFP-GDNF can be successfully constructed, and the protein of EGFP and GDNF is coexpressed in St9 cells, which paves a way for the research of GDNF gene therapy.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(029)007【总页数】4页(P821-824)【关键词】胶质细胞源性神经营养因子;增强型绿色荧光蛋白;杆状病毒;蛋白表达【作者】陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿【作者单位】上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025【正文语种】中文【中图分类】Q78;R764感音神经性聋是影响人类生活质量主要的问题，基因治疗被认为是感音神经性聋最有希望的治疗方法之一。