胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述

胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述
一、前言
胶原蛋白(collagen)是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白 约占人体总蛋白的三分之一,存在于细胞外间质 是具有三股螺旋结构的蛋白质家族[1]。

胶原是人体重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。

胶原是一个大的蛋白家族 至少有15个型别，各型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以Ⅰ型胶原分布最广含量最多
[2]。

胶原蛋白 或称胶原 是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维collagenous fibril可将其分为原纤维胶原蛋白fibrillar or fibril-forming collagen和非原纤维收原蛋白nonfibrillar or non fibril forming collagen两大类。

目前己发现的胶原蛋白类型己不下19种 原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI型胶原 在体内以胶原纤维的形式存在。

胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、软骨、韧带等器官的基本结构物质 使这些器官具有很高的抗张强度。

胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型胶原 其余均属于非原纤维胶原蛋白。

非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特征 即三股螺旋结构 但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按其超分了结构可进一步分类。

1.结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白（fibril associated collagens with interrupted triple helice FACIT）包括IX XII XIV XVI X XI型胶原。

2.形成网状结构的胶原蛋白，包括IV VIII X型胶原。

3.形成串珠状纤维beaded filament的胶原蛋白有VI型胶原。

4.形成固着原纤维anchoring fibril 的胶原蛋白有VII型胶原。

5.有跨膜区的胶原蛋白有XIII和XVII型胶原。

6.结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。

胶原不仅作为组织的支持物,而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响。

胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越，因此近20年来已被广泛用于临床 近年来 世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。

二、胶原蛋白的提取
胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族是细胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。

到目前为止已发现脊椎动物的胶原类型达十多种之多各型作用不一。

胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病。

在肿瘤的发生与转移中胶原的分布和类型也发生改受。

因此在提取时常将各型分别提取。

目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法。

在酸性条件下，I型和Ill型胶原沉淀的盐浓度临界点相近 在中性条件下III型和IV型胶原沉淀的盐浓度临界点又很接近。

因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间长，易发生胶原变性。

主要的提取方法分述如下：I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶原，在脏器纤维化病理过程中I型和II型胶原起着重要作用。

I型胶原是结缔组织间质中最主要的成分。

一般制品多以I型胶原为材料文献上I型胶原的提取一般采用多次超速高心的办法。

李成章、樊明文[3]。

从人胚骨中提取了I型胶原，用于胶原制品的制作。

采用胚胎骨组织来提取胶原，一般认为骨组织仅含有I 型胶原，选用骨组织作为提取原料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原，他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24，48h，取上清缓慢加入研磨精细的NaCl，终浓度为4mol/L，搅拌过夜离心35 000×g，20min，下同，去上清，其沉淀物加入0.5 mol/L HAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris-HCI终浓度为0.01mol/L，5mol/LNaOH调pH至7.4，NaCl终浓度为4mol/L，搅拌过夜，离心，去上清，沉淀以4 mol/L NaCI，0.05 mol/L Tris-HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析，平衡后NaCl浓度为1O离心去上清，沉淀物用0.5mol/LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所有液体及操作温度均为4℃。

为提高抽提纯度骨粉应越细越好，脱钙必须完全，采用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白
osteonectin，随之溶去。

有利于提高胶原的纯度，抽提的次数不应太少，否则纯度不够，抽提次数太多则易发生胶原变性。

他们所用抽提次数为3-4次，结果表明，所提胶原具有较高纯度，可用于胶原制品的制作。

秦定一、单英等参照Byers[10]等方法并略作改良分别从家兔和胎儿2种不同皮肤中提纯了III型前胶原肽[11]。

方法为，所有操作均在4℃进行 将皮肤切成约lmm2大小碎片，置于pH7.4，150 mmol/L Tris-HCI，20mmol/LEDTA、10mmol/L PHCH2SO2F、10mmol/L PMB溶液中匀浆，在4℃下提取48h。

2 000 r/min离心10min。

上清中加入W (硫酸铵)=20%。

离心15 000r/min 20min用上述提取液重溶沉淀加W（NaCl）=10%，30000r/min离心20min。

用pH7.6，200mmol/LNaCl、50mmol/L Tris-HCI溶液溶解沉淀即为III型胶原（Collagen Type III，C III）和III型前胶原（Procollagen Type III，PC III）粗提物。

将上粗提物充分透析后上DEAE-32纤维素柱层析 用pH7.5，2mol/L脲、20mmol/LNaCl、30mmol/LTris-HCI溶液平衡。

洗脱,以去除酸性糖蛋白。

为分离CIII与PCIII,再次经DEAE-32纤维素柱层析，用pH7.0，2mol/L脲 0.02mol/L NaCl、0.05mol/LTris-HCI溶液平衡、洗脱,待穿过峰结束，用0.02-0.2mol/L NaCl梯度洗脱，分别收集CIII与PCIII。

将PCIII溶于pH7.4，0.2mol/LNaCl、0.05mol/L Tris-HCl、0.005mol/LCaC12、2.5mmol/L PMB溶液加入细菌胶原酶37℃作用4h，置冰水终止酶反应。

酶消化产物在pH8.5，0.2mol/L碳酸氢胺溶液中透析平衡。

再经SephadexG 50凝胶过滤,分批加上酶消化产物进行洗脱，收集第一峰，超滤浓缩，置pH8.6，2mol/脲、0.05mol/LTris-HCl 缓冲液中透析。

过DEAE-52纤维素柱层析用0-0.35mmol/LNaCl梯度洗脱，收集主峰即为PIIIP。

柴明胜、陈金国、叶仲贤、朱炳钗[12]用人胎盘经胃蛋白酶消化，氯化钠分级盐析沉淀后进一步经过DEAE-52和CM-52柱层析纯化提取IV型胶原。

他们的方法为取人胎盘2只，剥离泡膜和结缔组织后剪碎，分别用蒸馏水和含蛋白酶抑制剂0.05mol/L,pH7.2Tris-HCI缓冲液漂洗使胎盘组织由红变白后制成匀浆。

再用该缓冲液在4℃洗提4h，离心后沉淀加入0.5mol/L 醋酸溶解，边搅拌边加入胃蛋白酶，在6℃提取24h。

离心收集上清液，逐渐加入氯化钠，使其浓度为1.2mol/L，然后搅拌过夜。

沉淀用0.lmol/L醋酸溶解后，用0.05mol/L Tris-HCI，PH7.4，0.2mol/L氯化钠透析过夜，去除沉淀后逐渐加入氯化钠使其浓度为2mol/L，所获沉淀即为IV-C粗品。

将粗品溶于0.05mol/LTris-HCI，PH8.6,2mol/L脲素0.2mol/L氯化钠缓冲液中，并用相同的缓冲液在4℃透析24h后，用DEAE-52层析。

收集穿过峰再用0.04mol/L醋酸钠，pH4.8，2mol/L脲素透析后用CM-52柱层析，经0-0.3mol/L氯化钠梯度洗提，第一峰即为IV.C纯品，透析除盐、冻干于20保存。

氨基酸分析表明甘氨酸含量占30%羟脯氨醚占13%两个链的分予量分别在95 000和70 000与Timpl报道相似，符合IV-C特征。