蓖麻毒素的分离、提取及活性研究

蓖麻毒素的分离、提取及活性研究
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文作了明确的说明并表示谢意。

本学位论文成果是本人在四川Ｉ大学读书期间在侯太平教授指导下取得的，论文成果归四川Ｉ大学所有，特此声明。

警２００７＠ｚ衙４户ｊ／杉四川大学硕｝。

学位论文蓖麻毒素的分离、提取及活性研究农药学专业研究生：高杉指导教师：侯太平本研究以蓖麻毒素灭鼠为目的，以小白鼠活性实验为筛选指标，研究了从蓖麻种子中分离蓖麻毒蛋白的方法，实现了对蓖麻毒素的最优提取，并利用得到的蓖麻籽粗提物对小白鼠进行灭鼠试验，来模拟高原鼠兔的灭鼠效果评价。

最终在野外大面积应用实验中，取得了比较满意的效果。

以蓖麻籽为原料，通过选用不同物质做浸提剂，单独研究了各种浸提剂对蓖麻毒素的最佳提取方法，在综合对各浸提剂在其最佳提取条件下的提取蓖麻毒素的效果后，最终确定，０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液在对去皮蓖麻籽的质量体积比为ｌ：３（ｇ／ｍ１）时，浸提２４小时后，所得混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油
脂，以及离心所剩的渣滓，保留清液，在清液中加入（ＮＨ４）ｚＳ０４盐析剂到８０％饱和度，盐析２４小时，１００００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，再经透析，真空干燥后所得蓖麻毒素（粗毒）产率最高，同时该提取方法还兼顾到蛋白的稳定性及整个提取流程的经济性，正是要寻找的最佳工艺路线。

应用提取出的蓖麻毒素（粗毒）对小白鼠做活性实验，’结果表明，蓖麻毒素对小鼠腹腔注射的ＬＤ∞为７．９７１ｕｇ／ｋｇ，其主要药效成分为蓖麻毒素。

蓖麻毒素使小白鼠中毒后无明显异常反应，不容易造成拒食现象，能够提高灭鼠效率。

而小白鼠从腹腔注射后３０ｈ开始出现死亡，直到９６ｈ后均有死亡，说明本毒饵是高效、慢性灭鼠刻。

针对ＪｌＩ西北高原的主要害鼠一高原鼠兔，应用蓖麻毒素灭鼠剂进行了野外四川ｒ大学硕上学位论文防治实验，在大面积实验中，该粗毒以１％浓度配制毒饵对高原鼠兔的校正灭效为８５％以上。

小区实验的灭效在９０％左右。

通过连续半个月的观察，未发现鹰等天敌出现二次中毒现象，对受试绵羊也无明显影响，禁牧期后，未发现对牲畜造成危害。

这些都充分说明，蓖麻毒素灭鼠剂在应用中是具有安全保障的。

，上述研究结果说明，蓖麻毒素灭鼠剂作为一种新型的灭鼠剂，无二次中毒，对牛、羊等对非靶标生物未见明显危害，比较安全、无残毒，不造成环境污染。

不失为一种优良的安全无公害灭鼠剂。

关键词：蓖麻毒素；提
取分离；ＬＤｓｏ；高原鼠兔；灭洞率四ＪＩ『人学硕｝。

学位论立ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＢｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲａｗＴｏｘｉｎｏｆＲｉｃｉｏｕｓＭａｊｏｒ：ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅＧｒａｄｕａｔｅ：ＧＡＯＳｈａｎＴｕｔｏｒ：ＨＯＵＴａｉ—ｐｉｎｇＴｈｅｐａｐｅｒｍａｉｎｌｙｓｔｕｄｙｔｈｅｄｅｒａｔｉｚａ
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ａｃｕｒｚｏｎｉａｅ，ｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｒａｔｅｆｏｒＯｃｈｏｔｏｎａｃｕｒｚｏｎｉａｅ４【『ｑ川人学硕Ｉ：学位论文前言蓖麻（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎＹｓＬ．）属大戟科蓖麻属，是十大油料作物之一。

我国蓖麻种植面积约４７万公顷，蓖麻籽年产量３０万吨，居世界第２位。

蓖麻籽榨油后的饼粕富含多种氨基酸、矿物质，可作为牲畜的优良饲料，但蓖麻籽中含有的蓖麻碱、毒蛋白、变应原和血球凝集素等毒素对牲畜有较强的毒性，不能直接被利用。

因此，寻找有效提取蓖麻籽中的毒素的方法将会极大地提高蓖麻资源的综合利用程度，产生更大的经济和生态效应。

蓖麻毒蛋白（Ｒｉｃｉｎ）是蓖麻种子中的一种毒蛋白，含量占籽重的１％－５％。

在１８８７年，Ｄｉｘｓｏｎ首次证明了蓖麻籽的毒性是由一种蛋白引起的：１９世纪后叶，Ｓｔｉｌｉｍａｒｋ详细地研究了这种毒素蛋白，并建议命名为“Ｒｉｃｉｎ”。

此后，蓖麻毒蛋白的理化性质和生物学特性引起了许多生化学家的兴趣和关注。

研究表明，蓖麻毒蛋白对所有哺乳动物的有核细胞都有毒害作用，它通过抑制蛋白质合成来杀死癌细胞，这使它在医学上成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。

Ｒｉｃｉｎ是迄今为止天然药中最毒的蛋白之一，几乎对所有真核细胞都有毒性。

它以往主要用于治疗肿瘤的研究，在作为灭鼠剂应用上尚未见报道。

有资料显示，川西北高寒草场
鼠害分布面积达２７０万公顷，占可利用面积的２０．１％。

而高原鼠兔是川西北高原的主要害鼠之一，它们群栖穴居，具有强烈的挖掘活动和以植物为食的生态特征，使其作用集中表现在对植被和土壤的影响上。

尤其是由于它们营群居生活，在一定范围内大量集中，生物量特大，危害极为严重，是草原上的主要害鼠。

鼠兔大量存在，导致草场的退化，不但给当地畜牧业带来很大经济损失，更严重的是加速了草原的退化，引起土壤沙化，水土流失严重，草原生态系统收到严重的破坏。

若尔盖草原湿地是长江与黄河的分水岭，它是世界上最大的“固体高原水库”。

因为湿地受到破坏，若尔盖沙化严重。

有专家忧虑，如沙化问题不加治理，不到２０年，整个若尔盖草原将成为高原沙漠，引发的沙尘暴将“光顾”成都平原。

多年来有关鼠害防治，国内外普遍采取化学防治策略。

人们曾长期使用天列Ｊ１１人学硕士学位论文然物质如红海葱、马钱子碱等灭鼠，以后逐渐使用一些新单质和化合物如黄磷、氰化物、氟乙酸钠、氟乙酰胺等急性杀鼠剂。

在上世纪４０年代末，人们开始使用抗凝血剂（Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅｓ）用于灭鼠。

目前广泛使用第二代抗凝血剂有鼠德克、澳敌隆、大隆、杀它仗和硫敌隆等。

化学灭鼠剂在当前鼠害防治中被广泛制成毒饵，用于防治家栖和野栖鼠类，具有高效、省工、方便等优点，在目前的鼠害防治工作中，占有重要的地位，
尤其是当大面积发生鼠害时，化学防治是解决问题的主要手段。

但是剧毒化合物除可因误食引起中毒死亡，对人们社会生活造成危害外，还由于使用后污染到水源或长期残留于土壤中，对环境造成的污染将是长期的和极其严重的，将对人类的生存、健康带来巨大的危害。

很多剧毒急性灭鼠药是植物内吸性的，被其毒死的鼠和牲畜腐败后可被植物内吸，在植物体内能滞留数月乃至数年之久。

４２４可长达４年，氟乙酞胺能滞留５０天，其滞留期与植物的种类、部位和生长期有关。

目前，许多有机化合物灭鼠剂由于其药物残留性和剧毒性已被禁止生产傻用。

抗凝血灭鼠剂虽然效果好，但长期使用会产生抗药性。

而且，现在国内外研制的第二代抗凝血杀鼠剂普遍成本高，价格昂贵，给大量应用造成一定困难。

此外，合成化学灭鼠剂将消耗化工原料，使得可利用资源减少，不符合可持续发展战略要求。

近年来，随着有害生物综合治理（ＩＰＭ）理论的实施、可持续发展战略的发展和人们环境保护意识的逐渐加强以及各类急性化学灭鼠剂的
禁止使用，人们对灭鼠剂的要求也相应提高，研制新型的灭鼠药物以避免上述化学灭鼠剂的缺点成为当务之急。

植物源药物具有天然来源、与环境相容性好；药源丰富、经济简便成本低廉；活性物质易代谢残留量小、对环境无污染和靶动物不易产生抗性等优点，因而成为人们关注的重点和新型农药发展的趋势。

作为草原病虫害防治专业实验室，川西北
高原的鼠害是我们一直关注的。

为有效控制鼠害，本实验室尝试从有毒植物中筛选灭鼠的有效成分。

国内已有直接用蓖麻籽和它的根、茎、叶制成植物杀虫剂，应用于实践中取得了很好的效果。

而蓖麻毒蛋白对所有哺乳动物的有核细胞都有毒害作用，这使它在医学上成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。

它以往主要用于治疗肿瘤的研究，在作为灭鼠剂应用上尚未见报道。

基于国内外对灭鼠荆的研究和人们对理想灭６四川大学顾Ｌ学位论文鼠剂的要求，本实验室从高原鼠兔的生物生态学习性和植物学、农药学、环境保护学等诸方面研究入手，提出了从蓖麻籽中提取分离蓖麻毒素，研制安全无公害灭鼠剂这一研究方向。

本研究以蓖麻毒素灭鼠为目的，以小白鼠活性实验为筛选指标，实现对蓖麻毒素的最优提取，并利用得到的蓖麻粗毒对小自鼠进行灭鼠试验，来模拟高原鼠兔的灭鼠效果评价。

最终在野外大面积应用实验中，取得了比较满意的效果，现将研究结果报告于后。

７删川人学硕卜≠位论文第一章．蓖麻毒素的提取与分离蓖麻毒素（Ｒｉｃｉｎ）系指蓖麻毒蛋白、蓖麻碱、蓖麻变应原和血球凝集素四种毒性物质，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大。

在药物研究中，蓖麻毒蛋白又称蓖麻毒素。

在英语中蓖麻毒素和蓖麻毒蛋白是同一词一“Ｒｉｃｉｎ”。

蓖麻毒素对入和哺乳动物有剧毒，几乎对所有真核细胞都有毒性。

一个毒素分子进入细胞内，就足以使整个细胞的蛋白质合成完
全停止而死亡。

蓖麻毒蛋白为白色粉末状或结晶形固体，无味。

不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲苯等有机溶剂，溶于酸性稀释液或盐类水溶液，在饱和硫酸铵溶液中，能沉淀析出。

与一般蛋白质相比，蓖麻毒蛋白对热、酸、碱比较稳定，湿热条件下很容易凝固变性，在水中煮沸或加压蒸汽处理即凝固变性，失去毒性，但干热条件下则失活很难，在半乳糖溶液中可保存数月而不失活。

为获得提取蓖麻毒蛋白的最佳方法，本实验参考Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等的方法，采用逐一改变实验条件的方法，在不同浸提剂的种类，剂量，抽提时间，不同盐析剂的种类，盐析浓度等情况下，对蓖麻毒蛋白的粗提条件进行了研究与比较分析。

从而优选出具有最高杀鼠效果的蓖麻毒蛋白提取方法。

１．材料与方法１．１实验材料供试蓖麻籽为市售。

蓖麻籽去壳后储存于４。

Ｃ冰箱中备用。

供试用小白鼠为昆明种，由四川大学华西啮齿类动物ＳＰＦ养殖中心提供。

１．２主要仪器与药品Ａ－８８型组织粉碎匀浆机：江苏省金坛市医疗仪器厂Ｊ－２５Ｉ高速冷冻离心机：美国贝克曼公司１００００ｒｐｍＪ－６Ｂ高速冷冻离心机：美国贝克曼公司４０００ｒｐｍＰＵ一１８００型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器公司四ＪＩＩ大学硕ｊ擘位论文ＤＺＦ－１Ｂ真空干燥箱：北京金紫光科技发展有限公司生产电子计数天平：常熟市金阳天平仪器有限公司生产ＢＰ３１０Ｐ电子
分析天平：德国赛多利斯公司生产Ｒ２０５Ｂ旋转蒸发器：上海申胜生物技术有限公司生产ＤＳＸ－２８０Ｄ手提式高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂生产３Ｊ一１精密增力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司生产（ＮＨ４）２Ｓ０４、Ｎａ２Ｓ０４、ＭｇＳ０４等试剂均为国产分析纯，透析袋，蒸馏水，均购于四川Ｉ大学设备处。

１．３实验方法在前期研究工作基础上，参考Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等的方法，，对提取条件进一步研究，以小白鼠的死亡率为指示，寻找提取蓖麻粗毒的最优途径。

具体方法如下：Ａ．蓖麻粗毒的提取：称取５０９脱壳蓖麻籽，加一定量的某种浸提剂浸泡，用匀浆机粉碎后匀浆置于低温环境下（４℃）搅拌若干小时，然后用４层纱布滤去残渣，取上清液离心（４０００ｒｐｍ／３０ｍｉｎ）。

弃去沉淀和上层蓖麻油，保留中间清液，在中间清液中加入某种盐析剂到一定浓度，使其充分溶解后，４℃环境下静置２４ｈ，然后以１００００ｒｐｍ／３０ｍｉｎ离心，收集沉淀，将沉淀溶解于蒸馏水中，透析２４ｈ，将透析所得于４０℃减压蒸馏，最后真空干燥可得蓖麻粗毒。

Ｂ．小鼠活性实验设计：１）对浸提后的混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，保留清液，提取离心所剩的渣滓，每种渣滓再用对应的浸提液浸泡２４小时后。

分别进行４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心取出油脂，保留清液，得到对应的粗毒溶液Ａ、Ｂ、
Ｃ…。

２）对盐析后的混合物１００００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，保留沉淀，取上清液ａ、ｂ、ｃ…。

以Ａ、Ｂ、Ｃ…和ａ、ｂ、ｃ…溶液做原药，分别取ｌｍｌ稀释１００、１０００、１００００倍…对小鼠进行腹腔注射（剂量为每鼠０．５ｍ１），每组每浓度用５只小鼠，并取１只小鼠做空白对照。

最终小鼠死亡率最低的那组即是粗毒提取效果最佳的。

９四川大学硕１ｊ学位论文１．３．１第一部分实验浸提剂的选择及浸提条件的摸索１．３．１．１不同浸提剂的选择分别称取５０９脱壳蓖麻籽，依次用１００Ｍ的水，１００Ｍ０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液（ＰＨ７．２）和１００ｍｌ５％的乙酸溶液进行匀浆，再静置于４”Ｃ环境中浸提２４小时。

对浸提后的混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，保留清液，提取离心所剩的渣滓，每种渣滓再用对应的浸提液浸泡２４小时后。

分别进行４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心取出油脂，保留清液，得到对应的粗毒溶液Ａ、Ｂ、Ｃ…。

按上述方法Ｂ作小鼠活性实验。

每组实验重复３次。

１．３．１．２浸提剂的最佳抽提时间的选择分别称取５０９脱壳蓖麻籽，用上述三种的浸提剂１００ｍｌ匀浆，于４”Ｃ浸提１２、２４、３６、４８小时。

对浸提后的混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，保留清液，提取离心所剩的渣滓，每种渣滓再用对应的浸提液浸泡２４小时后。

分别进行４０
００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心取出油脂，保留清液，得到对应的粗毒溶液ｈ、Ｂ、Ｃ…。

按上述方法Ｂ作小鼠活性实验。

每组实验重复３次。

１．３．１．３浸提剂的最佳抽提体积的选择分别称取５０９脱壳蓖麻籽，加入１００Ｍ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ的上述三种的浸提剂匀浆。

于４”Ｃ浸提至各种浸提剂对应具有最佳蓖麻粗毒浸提效果的时间。

对浸提后的混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，保留清液，提取离心所剩的渣滓，每种渣滓再用对应的浸提液浸泡２４小时后。

分别进行４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心取出油脂，保留清液，得到对应的粗毒溶液Ａ、Ｂ、Ｃ…。

按上述方法Ｂ作小鼠活性实验。

每组实验重复３次。

１．３．２第二部分实验盐析剂的选择及最佳盐析条件的摸索分别称取５０９脱壳蓖麻籽，加入适量的浸提剂匀浆，４℃浸提若干小时ａ所得混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，以及离心所剩的渣滓，保留清液，在清液中分别加入不同的盐析剂，每种盐析剂分别逐渐加到５０％、６０％０、７０％、１０四川大学硕Ｉ：学位论文８０％饱和度，盐析２４小时后，１００００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，观察现象，收集沉淀，然后对所得的每种上清液取ｌｍｌ，稀释１０００倍，做小鼠活性实验，最终小鼠未死亡或死亡最少的那组即是盐析效果最佳的。

１．３．３第三部分实验最佳浸提条件下各浸提剂的蓖麻粗
毒产率分别称取５０９脱壳蓖麻籽，各自加入适量的浸提剂匀浆，４”Ｃ浸提适宜时间。

所得混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，以及离心所剩的渣滓，保留清液，在清液中分别加入的盐析剂到最适宜浓度，盐析一定小时后，１００００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，观察现象，收集沉淀，沉淀溶解于蒸馏水中，透析２４ｈ，将透析所得４０℃减压蒸馏，最后真空干燥可得蓖麻粗毒。

从而可计算各自的产率。

２．结果与分析２．１．不同浸提剂灭鼠效果垂！：！篓签墼丕旦里堡型星握担旦堕旦盟丕匦垫墨浸提剂小鼠死亡时间（ｈ）２０２４３６４８７２９６总死亡率％稀１／１００１／５２／５３／５５／５１００水释１／１０００１／５２／５３／５６０
倍１／１００００２／５３／５６０数１／１０００００１／５２／５４０稀１／１００１／５３／５６００．２ｍｏｌ／Ｌ释１／１０００２／５３／５６０的磷酸缓，。

１首１／１００００１／５２／５４０冲液数１／１０００００２／５４０稀１／１００１／５２／５４／５５／５１００５％乙酸释１／１０００１／５２／５３／５４／５８０倍１／１００００１／５２／５３／５６０数１／１０００００１／５２／５３／５６０四川人学硕｝：学位论文注：本实验设３个重复，取平均值上述结果表明，相
同条件下，５％乙酸做浸提剂时，小白鼠死亡率最高，说明它对蓖麻毒素的浸出效率最低，导致渣滓里的蓖麻毒素含量相对较多，再次浸提出来才出现杀鼠率较高的现象。

水做浸提剂时，小白鼠最先出现死亡，同样说明其浸提效果不好，相比较而言，０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液的浸提效果是最好的。

２．２最佳浸提时间的选择由于选择三种不同的浸提剂，故按照浸提剂分组，组内进行实验最后综合对比得出结果。

同时最终只选择３个浓度梯度的药物做活性实验。

表１．２水做浸提剂浸提不同时间的灭鼠效果浸提时间小鼠死亡时间３０３６４２４８６０７２９６总步Ｅ亡率（ｈ）（ｈ）％稀１／１００１／５３／５４／５５／５１００１２释１／１０００１／５２／５３／５４／５５／５１００盔１／１００００１／５２／５３／５５／５１００稀１／１００１／５２／５３／５６０２４释１／１０００１／５
２／５３／５６０室１／１００００１／５２／５４０稀１／１００１／５２／５３／５６０３６
释１／１０００１／５２／５４０室１／１００００１／５２／５４０稀１／１００１／５２／５
３／５６０４８释１／１０００１／５２／５３／５６０室１／１００００１／５２／５４０注：本实验设３个重复，取平均值显然。

水做浸提剂时浸提３６小
时的杀鼠效果最低。

说明此时水已经把绝大１２婴型盔兰堡！：兰竺堡兰多数的蓖麻毒素浸提出来，导致渣滓里的蓖麻毒素含量很低，所以再次浸提后的杀鼠效果最低，从而说明３６小时是水的最佳浸提时间。

表１．３５％乙酸浸提剂浸提不同时间的灭鼠效果浸提时间小鼠死亡时间３０３６４２４８６０７２９６总死亡率（ｈ）（ｈ）％ .。