东乡普通野生稻（OryzarufipogonGriff）原位保存群体的遗传分化和保护策略研究

中国农业科学 2007,40(6):1085-1093
Scientia Agricultura Sinica
东乡普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)原位保存群体的遗
传分化和保护策略研究
杨庆文1，余丽琴2，张万霞1 ，时津霞1，任军方1，苗 晗1
（1中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2江西省农业科学院水稻研究所，南昌 330200）
摘要：【目的】东乡野生稻是世界上分布最北的普通野生稻居群，研究其遗传分化不仅能够阐明居群的起源、演化规律，而且可为其保护提供理论依据。

【方法】利用SSR（简单序列重复）分子标记对江西东乡普通野生稻仅存的2个原位保护居群进行了30个位点的遗传多样性分析和遗传分化研究。

【结果】东乡野生稻2个居群内和居群间的遗传多样性指数分别为0.4120和0.0564，居群间遗传分化系数仅为0.1219，即87%以上的遗传变异存在于居群内。

POPGENE聚类分析结果也显示，东乡野生稻的2个居群实际属于一个大群体，水桃树居群可看作庵家山居群的一个分支。

利用同样方法对庵家山居群人为隔离的3个小群体进行的研究结果表明，虽然3个小群体间遗传分化系数也很低（0.0975），仍然属于同一居群，但人工隔离引起的小生境变化已使得3个群体发生了遗传分化。

【结论】在建立东乡野生稻原生境保护点时，一方面，应以有效保护庵家山居群为重点，另一方面，对庵家山居群的保护应充分考虑原居群的生态环境，拆除原有围墙，进行生态恢复。

关键词：普通野生稻；SSR；遗传多样性；原生境保护
The Genetic Differentiation of Dongxiang Wild Rice (Oryza rufipogon Griff.) and Its Implications for In-Situ Conservation YANG Qing-wen1, YU Li-qin2, ZHANG Wan-xia1, SHI Jin-xia1, REN Jun-fang, MIAO Han1
(1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Institute of Rice Research, Jiangxi Academy
of Agricultural Sciences, Nanchang 330200)
Abstract: 【Objective】Dongxiang wild rice (Oryza rufipogon Griff.) distributes at 28°14′N in Dongxiang County, Jiangxi Province, where is recognized to be the northernmost habitats for O. rufipogon populations in China, as well as in the World. Studies on the genetic differentiation could not only reveal the principle of origination and evolution of the populations, but also provide theoretical evidence of their conservation. 【Method】To analyze the genetic differentiation of the populations, 30 pairs of SSR primers were used to amplify the selected samples and POPGENE ver1.31 statistic software was applied to cluster the SSR data,. 【Result】The results indicated that the genetic diversity indices within and between populations were 0.4120 (H S) and 0.0564 (D ST) respectively, and the coefficient of genetic differentiation (G ST) was 0.1219, meaning that the genetic variability between populations was low. The cluster analysis also showed that Shuitaoshu population is one branch of Anjiashan population, inferring that the two natural populations were once from a large population. For Anjiashan population, three sub-populations were formed because of the construction of the in-situ facilities (brick walls) in 1985. The same methods were also applied to analyze the genetic diversity of the sub-populations in Anjiashan population. The results showed that the coefficient of genetic differentiation (G ST) was only 0.0975, the sub-populations still belonged to the same population but gene differentiation actually happened. Though the brick walls have played significant roles for the conservation of wild rice in Dongxiang, it caused the genetic differentiation among three sub-populations. 【Conclusion】Two aspects should be considered during designing in-situ conservation strategies for Dongxiang wild rice: (i) Anjiashan population should be effectively conserved first, and (ii) the brick wall built in 1985 should be removed and the original
收稿日期：2006-05-09；接受日期：2006-09-05
基金项目：国家财政专项“农业野生植物保护与可持续利用”资助
作者简介：杨庆文（1964-），男，湖北广水人，研究员，博士，研究方向为野生稻的保护生物学。

Tel：************；E-mail：****************
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ecosystem should be recovered for Anjiashan population.
Key words: Wild rice; SSR; Genetic differentiation; In-situ conservation
0 引言
【研究意义】普通野生稻（Oryza rufip o gon Griff.）是亚洲栽培稻（O. sativa L.）的祖先种，是水稻品种改良的重要种质资源。

中国南方8省（区）分布有普通野生稻，遗传多样性非常丰富。

但是，随着农村经济的发展以及城市化进程的加快，普通野生稻的生境遭到严重破坏，导致中国普通野生稻资源面临严重的威胁。

对野生稻天然居群进行遗传分化及多样性研究，对于阐明野生稻的濒危状况和濒危机制，研究栽培稻的起源与演化，制定野生稻种质资源保护策略都具有非常重要的意义。

【前人研究进展】近几十年来，国内外学者对野生稻的遗传多样性进行了广泛研究。

Morishima等[1～3]、Barbier[3,4]和周进等[5]、吴妙燊等[6]曾从形态性状和同工酶位点分别对泰国和中国的野生稻群体遗传结构进行过研究。

分子标记的建立和发展为野生稻遗传多样性的研究注入了新的活力，Ichikawa等[7]、Sano等[8]、Dally等[9]、Martin等[10]、Akimoto等[11]、高立志[12]、朱世华等[13]、Ge等[14]、Gao等[15]、Qian等[16]、Lu 等[17]都在DNA水平对野生稻种内遗传多样性进行了研究，揭示出野生稻种内丰富的遗传多样性。

东乡野生稻属普通野生稻，是迄今全世界分布最北的野生稻。

1978年发现时有3处9个居群，分布面积约3 ha[18]。

后来由于野生稻的生境遭受破坏，原始居群数从9个急剧下降到2个。

为了防止东乡普通野生稻的灭绝，中国水稻研究所和江西农科院水稻研究所于1985年对庵家山和水桃树2个保存相对较好的居群建立了高2 m的围墙，实施了原位保护[19]，保护面积分别为0.08 ha和0.02 ha。

目前，除已保护的2个居群外，其它7个居群均已消失。

但是，由于围墙紧靠野生稻密集分布区而建，几乎没有缓冲空间，围墙内的小生境经过近20年已经发生了巨大变化[20]，特别是庵家山居群，被围墙分割为相对独立的3个自然群落。

近年来，中国学者对东乡野生稻的遗传多样性也进行了大量研究。

王振山等[21]、谢建坤等[22]、黄英金等[23]、Song等[24]、Zhou等[25]、Gao[26]分别利用分子标记技术和等位酶分析方法对东乡野生稻进行了遗传多样性分析，一致认为东乡野生稻群体内存在较高的遗传变异。

【本研究切入点】前人对东乡野生稻的研究目前仅限于遗传多样性分析和遗传变异的描述，没有系统地研究居群之间的遗传分化问题，特别对于被围墙分割的群落之间是否已发生遗传分化还没有研究报道。

【拟解决的关键问题】本研究旨在运用SSR 分析江西东乡野生稻2个原位保护的居群之间以及居群内自然群落之间的遗传分化状况，为建立野生稻原生境保护点提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料
所有普通野生稻材料均采自江西省东乡县庵家山和水桃树2个野生稻原位保护点。

庵家山保护点按照围墙分割的相对独立的3个自然群落分别取样，以SE、NW和IN分别代表东南群落、西北群落和围墙内群落。

各群落取样编号为SE1～SE8，NW1～NW23和IN1～IN25，取样分布示意图见图1。

水桃树保护点取样编号为Z1～Z20。

每个取样点相距约5 m，分单株取嫩叶2～3片，硅胶干燥保存。

1.2 方法
1.2.1 DNA的提取按Rogers等[27]的CTAB法并稍有改进，利用紫外分光光度计测定浓度，0.8%琼脂糖检测DNA质量，用TE稀释至20 ng·μl-1备用。

图1 东乡野生稻庵家山居群取样示意图
Fig. 1 Sketch map of the distribution of Anjiashan wild rice in Dongxiang
1.2.2 PCR反应采用仪器为PE公司5700序列测序仪，反应体系为每20 μl 反应体积中含有100
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mmol·L -1 Tris-HCl ，50 mmol·L -1 KCl ，1U Taq DNA 聚合酶，2.5 mmol·L -1 MgCl 2, 2.5 mmol·L -1 dNTPs ，4 μmol·L -1 SSR 引物，100 ng DNA 模板。

反应程序为：94 4 min ℃， 35个循环（94℃ 1 min ，-0.5℃/s 至退火温度，退火温度1 min ，+0.5℃/s 至72℃ 1 min ），72℃ 保温10 min 。

所用引物的退火温度范围为56～71℃。

扩增产物在变性6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，恒定电压2 500V ，电泳1 h ，按文献[28]方法银染后观察并照相，选择分布于水稻12条染色体且扩增效果较好的30对SSR 引物进行统计分析。

1.2.3 聚类分析 将每对SSR 引物检测结果作为一个
位点，每个多态带型作为一个等位变异，利用Yeh 等[29]的POPGENE ver.1.31计算软件进行聚类分析。

1.2.4 遗传多样性评价 遗传多样性评价采用Sun 等[30]和Nei [31, 32]提出的参数进行分析，主要参数及其表示方法如下：
多态位点比率P ，P=（多态位点数/检测位点数）×100%
平均等位基因数A ，A=∑n i
n /Ai 。

式中，A i 为第i 个多态位点的等位基因数，n 为所检测的位点总数。

多态位点的平均等位基因数Ap ，Ap=∑n i
np /Api 。

式中，Ap i 为第i 个多态位点的等位基因数，np 为所检测的多态位点的总数。

平均基因型数G ，G=∑n i
gi/n 。

其中gi 为某一位点的基因型数，n 为所检测的位点总数。

遗传多样性指数He ，He=∑n i
Hi/n ，Hi=1-∑mi j
p 2ij 。

其中P ij 表示第i 位点上，第j 个等位基因的频率，n 为检测位点的总数。

居群内的遗传多样性Hs ，Hs=1-1/n ∑n i
p 2ij 。

其中
Pij 表示第i 位点上，第j 个等位基因的频率，n 为检测的位点数。

总居群的遗传多样性H T ，H T = 1-∑m j
r 2j 。

式中，
m 表示该位点上的等位基因数，r j 表示该位点上第j 个等位基因在总居群中的平均频率。

居群间的遗传多样性D ST ，D ST = H T -Hs 遗传分化系数G ST ，G ST = ( H T -Hs)/ H T 。

其中H T
为总群体遗传多样性指数，Hs 为亚群体遗传多样性指数。

2 结果与分析
2.1 庵家山保护点野生稻的遗传分化关系
由于庵家山保护点的野生稻被围墙分割为相对独立的3个自然群落，所以本研究将其按照3个小群体进行分析。

30对引物中有23对表现为多态（SSR 扩增效果见图2），多态位点的比率P 为76.7%，在来自3个群体的56个样品中共检测出66个等位基因，基因型总数为160，每个位点检测的等位基因数在2～
6之间，平均等位基因数A 为2.2，多态位点平均等位基因数Ap 为2.9，平均基因型数G 为5.3。

IN 、NW
和SE 3个群体各自的遗传多样性指数分别为0.4704、
0.4144和0.3882，说明围墙内小群体（IN ）的遗传多样性最丰富，而围墙外西北小群体（NW ）和东南小群体（SE ）的遗传多样性相对较低，这与当时进行原位保护时的情况基本一致，因为进行原位保护时，所选择区域的野生稻遗传多样性应该比其它区域的多样性高。

庵家山3个小群体的群体内遗传多样性指数、群体内间遗传多样性指数、遗传分化系数和遗传聚类图分别见表1和图3。

从表1可以看出，庵家山保护点的3个自然群落总的遗传多样性指数接近0.5，说明该居群的遗传多样性程度比较高，而群体内的遗传多样性指数远远大于群体间的遗传多样性指数，相差9倍多，而且遗传分化系数不到0.1，说明这3个自然群体遗传分化较小。

从每个位点的遗传分化系数可以看出，位于第一条染色体的RM129、第2条染色体的RM154和第9条染色体的RM242 3个位点在3个小群体间的分化非常明显。

图3中的聚类结果显示，所有材料在聚类图上当遗传相似系数约为0.73时，可以分为4大类，第I 类除NW-15外，均为SE 群体材料，第II 大类除SE-7外，均为NW 和IN 两个群体的材料，而第III 和第IV 大类除NW-6外，均来自IN 群体。

当遗传相似系数增加到约0.75时，第II 大类又可分为4组，第i 组分别来自于SE 、IN 和NW 3个群体；第ii 组和第iii 组除IN-19外，其余都来自NW 群体；第iv 组全部来自
IN 群体。

该聚类结果说明，虽然所有3个群体材料的遗传相似系数较高，群体之间没有明显的分界线，遗传分化不显著，但当遗传分化系数增加时，彼此间的遗传结构确实存在差别，特别是NW 和IN 群体之间更为明显，而即使在混合聚类的类群或小组中，来自同一群体材料彼此间的遗传相似系数也比群体间的遗
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传相似系数高。

所以，尽管3个小群体遗传分化并不
明显，但彼此间的遗传结构确实存在差别，这些遗传
分化可能是近20年来人为隔离造成的。

图2 水稻SSR引物在江西东乡野生稻群体中的扩增效果（以引物RM222为例）
Fig. 2 PCR amplified results of wild rice in Dongxiang, Jiangxi Province, with SSR primers in rice (Example of RM222)
表1 江西东乡庵家山保护点野生稻的遗传多样性
Table 1 Genetic diversity of wild rice in Anjiashan, Dongxiang County
引物Locus 染色体
Chromosome
等位基
因数
Alleles
总遗传多样性
Total gene
Diversity (H T)
居群内遗传多样性
Gene diversity
among population (D S)
居群间基因多样性
Gene diversity
among population (D ST)
遗传分化系数
Coefficient of gene
differentiation (G ST)
RM104 1 2 0.1327 0.1268 0.0059 0.0086 RM129 1 3 0.4705 0.3180 0.1525 0.2319 RM250 2 3 0.6601 0.5885 0.0716 0.1038 RM240 2 4 0.5716 0.5251 0.0465 0.0813 RM154 2 3 0.4801 0.3412 0.1389 0.4388 RM16 3 3 0.6204 0.6048 0.0156 0.0438 RM282 3 2 0.4998 0.4974 0.0024 0.0035 RM161 5 2 0.4641 0.3629 0.1012 0.1345 RM305 5 2 0.5000 0.5000 0.0000 0.0000 RM159 5 1 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 RM314 6 2 0.4228 0.3628 0.0600 0.1358 RM172 7 2 0.5000 0.5000 0.0000 0.0000 RM118 7 2 0.2320 0.1608 0.0712 0.1625 RM125 7 5 0.7004 0.6753 0.0251 0.0128 RM331 8 6 0.5906 0.4659 0.1247 0.1608 RM332 8 5 0.6511 0.6584 -0.0073 0.0074 RM321 9 2 0.5000 0.5000 0.0000 0.0000 RM278 9 3 0.5719 0.5039 0.0680 0.0715 RM242 9 4 0.4460 0.4193 0.0267 0.2228 RM222 10 2 0.2934 0.2467 0.0467 0.0408 RM167 11 2 0.4994 0.4304 0.0690 0.1341 RM229 11 3 0.6065 0.4702 0.1363 0.1952 RM247 12 3 0.4944 0.5018 -0.0074 0.0532
平均值Average 0.4743
0.4244 0.0499 0.0975
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图3 庵家山居群自然群体聚类分析树状图
Fig. 3 Dendrogram of sub-populations in Anjiashan population based on SSR data
2.2 庵家山和水桃树2个原位保护野生稻居群的遗
传分化
庵家山和水桃树2个保护点相距约5 km，而且有山坡阻隔，彼此间应该不存在基因交流。

将2个保护点分别作为2个居群进行分析，以A和Z分别代表庵家山和水桃树居群，居群A包含IN、NW和SE 3个自然群体。

2个居群的居群内遗传多样性指数、居群间遗传多样性指数、遗传分化系数和遗传聚类图分别见表2和图4。

从表2可以看出，居群A和Z的遗传结构类似于居群A中3个自然群体的遗传结构，居群内遗传多样性指数远远大于居群间的遗传多样性指数，相差8倍多，遗传分化系数也极低，说明这2个居群没有显著的遗传分化。

比较表1和表2还可以看出，位点RM129、RM154和RM242在庵家山和水桃树2个居群间的分化也非常明显，说明它们对野生稻的遗传分化具有重大影响。

图4中的聚类结果显示，当遗传相似系数约为0.73，除IN-21、IN-22外，所有材料可以分为两大类，第I类除Z-16材料来自Z居群外，均来自于庵家山（A）居群材料，而第II类包括了IN、NW小群体的部分材料和Z居群除Z-16外的所有材料，即Z居群所有材
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料与NW小群体和IN小群体的部分材料聚集在一起。

比较图3和图4的聚类结果可以看出，除了Z居群材料插入其中外，2个图的框架结构基本一致。

因此，该聚类结果说明：（1）水桃树居群在遗传结构上仅仅是庵家山居群的一部分，并且与NW小群体更为接近；（2）虽然由于水桃树居群对庵家山居群的聚类结果有一定的影响，但聚类图与庵家山居群的聚类图基本一致，只有少数材料的聚类位置稍有变化。

表2 江西东乡庵家山和水桃树2个原位保护野生稻居群的遗传多样性 Table 2 Genetic diversity of wild rice in A and Z populations in Dongxiang county
引物Locus 染色体
Chromosome
等位基
因数
alleles
总遗传多样性
Total gene
Diversity(H T)
居群内遗传多样性
Gene diversity
among population((D S))
居群间基因多样性
Gene diversity
among population (D ST)
遗传分化系数
Coefficient of gene
differentiation (G ST)
RM104 1 2 0.1244 0.1200 0.0044 0.0076 RM129 1 4 0.5624 0.3784 0.1840 0.3036 RM250 2 3 0.6642 0.5951 0.0691 0.1067 RM240 2 4 0.5549 0.5063 0.0486 0.0856 RM154 2 4 0.4092 0.2809 0.1284 0.4746 RM16 3 3 0.6026 0.5786 0.0240 0.0623 RM282 3 2 0.4996 0.4977 0.0019 0.0026 RM161 5 2 0.4826 0.3968 0.0858 0.1345 RM305 5 3 0.5066 0.5062 0.0004 0.0005 RM159 5 2 0.0263 0.0249 0.0014 0.0400 RM314 6 2 0.3648 0.2971 0.0678 0.1811 RM172 7 4 0.5260 0.5236 0.0025 0.0040 RM118 7 2 0.3279 0.2425 0.0855 0.1990 RM125 7 5 0.7519 0.6436 0.1083 0.1381 RM331 8 6 0.5920 0.4976 0.0944 0.1271 RM332 8 5 0.6214 0.6188 0.0026 0.0194 RM321 9 4 0.5132 0.5125 0.0007 0.0010 RM278 9 3 0.4842 0.3908 0.0935 0.1411 RM242 9 4 0.3533 0.3145 0.0389 0.2847 RM222 10 2 0.2311 0.1850 0.0461 0.0818 RM167 11 2 0.4986 0.4353 0.0633 0.1129 RM229 11 3 0.6226 0.4967 0.1259 0.1817 RM247 12 3 0.4530 0.4335 0.0196 0.1136
平均值Average 0.4684
0.4120 0.0564 0.1219
3 讨论
3.1 小生境变化对居群遗传结构的影响
江西省东乡县庵家山普通野生稻分布点1978年被发现时有野生稻约0.2 ha，1985年建立原位保护点时，由于经济条件所限，仅选择了其中野生稻分布比较集中的部分进行了围墙保护，但围墙外仍然散生着部分野生稻（陈大洲，个人通讯）。

实际上，围墙内外的野生稻当时呈连续分布状态且处于同一生态系统，没有基因交流障碍。

可是，近20年来，由于围墙的阻隔，将该居群分割成了3个小群体，彼此间基因交流中断，加上围墙内温、光、水等环境条件的改变和围墙外修建蓄水堤坝引起的水位上升等小生境的变化必然引起各小群体基因型结构的变化，为了达到群体内新的遗传平衡，各小群体之间逐渐发生了遗传分化。

本研究结果也表明，尽管3个小群体之间的遗传分化系数很小（0.0975），而且围墙外西北部群体（NW）的部分材料是从围墙内群体（IN）移栽的（陈大洲，个人通讯），但在遗传聚类图上，除少数材料出现交叉外，3个小群体分别聚在一起。

由此可以断定，随着小生境的改变，庵家山野生稻居群各小群体之间确实发生了遗传分化，并且随着时间的推移，遗传分化的程度可能将越来越大。

因此，小环境的变化对整个居群遗传结构的影响短期内也许非常微小，但其长期影响是客观存在的。

3.2 东乡野生稻的保护策略
普通野生稻是世界公认的亚洲栽培稻的祖先，其丰富的遗传资源是水稻遗传育种雄厚的物质基础。

但
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图4 庵家山和水桃树2个居群的聚类分析树状图
Fig. 4 Dendrogram of Anjiashan and Shuitaoshu populations based on SSR data
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是，由于经济发展和过度开发利用，普通野生稻资源正以惊人的速度遭到破坏。

虽然东乡野生稻的保护工作在全国处于领先地位，但其特殊的地理位置和生态环境决定了在制定东乡野生稻保护策略时更应该注重其科学性。

东乡野生稻2个居群的遗传多样性研究结果表明，A和Z居群内的遗传多样性指数和居群间遗传多样性指数之间的显著差异说明这2个居群的遗传分化程度很低，而且水桃树居群（Z）在聚类图上完全可以看成是庵家山居群（A）的一个分支，说明2个居群属于一个大群体，这与谢建坤等利用SSLP研究的结果基本一致。

由此可以推测，尽管庵家山和水桃树两个居群相距较远，但曾经应该呈连续分布状态，后来可能因为人为干扰导致生境片断化，从而形成了两个独立的孤岛局部种群。

因此，在建立江西东乡野生稻原生境保护点时，一方面，从尽可能全面保护该地区普通野生稻的遗传多样性角度出发，应同时将2个居群进行保护，但是，如果受经济、社会等条件限制不能同时保护2个居群时，首先必须将庵家山居群进行有效保护；另一方面，对庵家山居群的保护应充分考虑原居群的生态环境，拆除原有围墙，开展生态恢复工程，新建隔离设施应远离野生稻分布的核心区，保证该居群原有的生态环境不受任何破坏。

4 结论
无论是生境片断化还是人为隔离，东乡野生稻仅存的2个原位保护群体之间以及庵家山群体被分割的3个小群体之间都出现了遗传分化，说明时间和空间的隔离对于野生稻的群体遗传结构都会产生一定程度的影响。

因此，在制定野生稻原生境保护策略时，不仅应以群体的遗传多样性数据为依据，而且应充分考虑其原有的生态环境，从而保证原生境保护的科学性。

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（责任编辑张淑兰，赵利辉）。