细胞工程育种

（2）突变诱发
在植物细胞培养中自然突变的频率为10-5 — 10-8，使用诱变剂可使诱变频率提高到10-3 。 A、物理诱变剂。紫外线及各种射线， 可省去洗涤诱变剂的步骤。 B、化学诱变剂。处理后必须将诱变剂洗涤 去除。
（3）突变体的选择 A、正选择法 也称直接选择，原理是把大量 的细胞置于有选择剂培养基上，使正常细 胞不能生长，而各种抗选择条件的突变体 细胞能生长。如抗盐、除草剂突变体。 B、负选择法 也称富集法，采用某一非允许 条件培养基，使突变的细胞不能生长，而 野生型能生长，然后加入负选择剂，杀死 生长的细胞，不能生长的细胞保留下来。
（4）突变体的鉴定 诱变的细胞从选择培养基上转到非选择培 养基上后快速生长，然后转到分化培养基 上再生植株，可在再生植株上检查突变体 的表达，也可在后代的组织培养物上检测。
三、花药花粉培养 花药培养指将一定发育时期的花药接种 到人工培养基上，再给于特殊的培养条件 而产生植株的过程。分化来源于花药中未 成熟的花粉，常称为花粉植株，把花药培 养与花粉培养相提并论。但是花粉培养和 花药培养不完全相同，花药是植物体上的 器官，属器官培养，花粉是单细胞，属细 胞培养。
2、材料的预处理 目的是提高原生质体产量和代谢活力；逐步 降低植物细胞的水势；增强原生质体对高 渗透压的适应；使游离的原生质体更能适 应新的培养条件。 预处理方法： 预培养法、暗处理法、药物及添加物处理 法、萎蔫处理法、更新培养基法等。
3、原生质体的分离 A、机械分离法 B、酶分离法 在酶的作用下分解细胞壁，获得原生质体 的方法。目前，一般采用酶分离法。 常用的酶类有纤维素酶、半纤维素酶及果 胶酶。
C、聚乙二醇法 目前普遍采用的方法，在培养物中加入聚 乙二醇，以促使原生质体融合的方法； D、电融合法 用改变电场的方法诱导原生质体融合的方 法。
第一节
细胞工程的概念和原理
一、细胞工程的概念
以细胞为基本单位，按照人们的需要和设计， 在离体条件下进行培养、繁殖，使细胞的某些生 物学特性按人们的意愿发展或改变，从而改良品 种或创造新种、加速繁育生物个体，获得有用材 料的过程。
细胞工程的主要包括 花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、原生质体融合、 试管受精等。
主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。
2、选择外植体 外植体是用来诱发产生无性增殖系的植物器官或组织切段， 如芽、节茎等。选择综合考虑以下因素： ①大小适宜 组织块达到5-10mg（2万个细胞以上），才容易 成活。 ②适宜部位 同一外植体，不同部位其分化能力、分化条件及 分化类型都有相当大的差异。 ③新组织 胚和幼龄器官比老器官、老组织更容易脱分化，产 生大量愈伤组织。 ④不同物种相同部位的外植体，其细胞分化能力大不一样。 总之，外植体的选择要以幼嫩的器官或组织为宜。
（2）雄性不育系突变体 （3）营养缺陷型突变体 缺少某一种物质合成的酶，而不能在基 本培养基上生长。 （4）各种形态特征和生物学特性突变体 如马铃薯早熟、高产变异，小麦、水稻 株型、穗型变异等。
2、植物体细胞突变体的诱发和筛选技术 （1）材料的选择 A、较易再生植株 B、染色体数目稳定 C、生长速度相对较快
第十三章 细胞工程育种
第一节 第二节 细胞工程的概念与原理 细胞工程技术
生物技术 又称生物工程 是以生命科学为基础，利用生 物体的特性和功能，设计、构建具有预 期性状的新物种、新品种、新品系，以 及与工程原理相结合，进行加工生产， 为社会提供商品和服务的综合技术体系。
通常所说的细胞工程、基因工程、酶 工程、发酵工程、生化工程和蛋白质工 程等均属此范畴。 预测在2025年到2030年期间，生物技 术将取代信息技术成为世界经济社会发 展的引擎与火车头。 本章简要介绍细胞和组织培养在植物 育种的应用。 细胞工程是现代生物技术的基本技术
五、原生质体培养和体细胞杂交
原生质体培养 是将植物细胞去壁后，放在无 菌条件下，使其进一步生长发育的技术。 体细胞杂交 是在离体条件下将同一物种或不 同物种的原生质体融合，培养并获得再生 植株。
原生质体融合克服了植物种属间生殖障碍， 为新种质创新提供了一条有效途径。
一、原生质体的分离与培养 （一）原生质体的分离 1、制备原生质的材料 A、自然条件下生长的植株 常用的是叶肉细胞， 因来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，便 于在融合中识别。 B、无菌幼苗 无需消毒，实验结果容易重复。 C、外植体来源的愈伤组织、体细胞胚及悬浮 培养细胞 可常年供应，易于控制新生细胞的 年龄，处理时操作方便。
4、原生质体的纯化 去除未消化的细胞和细胞团，破碎细胞，维 官束组织等。 A、过滤—离心法 原生质体通过40—100µm滤膜 滤器过滤，滤液低速离心5min，原生质体下沉， 吸去上清液，在悬浮于同等渗透压的原生质体 液体培养基中。 B、漂浮法 根据原生质体、细胞、细胞碎片的 相对密度不同而设计的，关键是蔗糖或山梨醇 的浓度与离心速度。
二、细胞工程在植物育种上的意义 1、种质资源保护 2、优良品种快速繁殖 3、诱发和离体筛选突变 4、克服远缘杂交困难 5、克服种子发育中的障碍 6、单倍体育种的技术环节 7、生产次生代谢产物（发酵工程、酶工程） 8、基因工程的基础技术
三、细胞工程的基本原理
植物细胞全能性是细胞和组织培养的理论基础。 细胞是生物体结构和生命活动的基本单位，是 细胞工程操作的主要对象。 细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传 物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物 体的能力。 植物离体的体细胞或性细胞，在离体培养条件 下能被诱导发生器官分化和再生植株，而且再生 植株具有一套与母体植株基本相同的遗传信息。 同样，如果已经突变的细胞组织，其再生植株则 具有与已变细胞组织相同的遗传信息。
生长调 节物质
生长素
IAA、NAA、2,4-D、IBA
细胞分裂 天然： 6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤） 素 人工：ZT（玉米素）、2-iP 赤霉素 GA3
成份不 定物质
琼脂
椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥
从海藻中ห้องสมุดไป่ตู้取的一种高分子碳水化合物
MS培养基适用范围较广 米勒培养基（Miller）适用于大豆愈伤组织培 养和花药培养 尼许培养基（Nitsch)适用于花药培养 改良White培养基（怀特）适用于壮苗培养 N6培养基适用于单子叶植物花药培养 B5培养基适用于豆科、十字花科植物
原生质体的融合，不是没有亲缘界限的，亲 缘关系过远的亲本融合则不利于取得圆满 的结果，特别是以育种为目的融合来说尤 为不利。 总之，选择那些既容易融合，又利于杂种筛 选，还能形成稳定的遗传重组体，并能再 生成植株的原生质体融合，才能获得有效 的结果。
2、融合方法 A、多聚化合物法 在培养物中加入多聚—L— 鸟氨酸、多聚—L—赖氨酸、葡萄糖硫酸盐 等多聚化合物，以促进原生质体融合的方 法。多聚化合物能改变原生质体表面的物 理特性，增强原生质体的内吞饱饮作用。 B、高PH高Ca2+法 将须融合的原生质体防在 高PH高Ca2+条件下融合的方法。
培养步骤： 1、取成熟度适中的花蕾或幼穗 单核靠边期 2、花药消毒 3、无菌接种 取出花药，平放在培养基上 4、花药培养 诱导阶段、分化阶段 5、培养条件 28℃下光照（12-18h，500010000lx)和22℃黑暗的周期性交替的条件 下进行。
四、离体胚的培养
植物的胚培养主要有两种培养方式：一种 是以幼胚为外植体诱导愈伤组织細胞，通 过器官发生或胚胎发生产生再生植株； 另一种是使发育完全的胚直接萌发，获得 完整的植株。离体胚培养在植物育种中的 应用主要包括以下三个方面：
第二节 细胞工程技术
一、体细胞变异与突变体的筛选 （一）体细胞变异及其机制 植物组织细胞培养中DNA复制和细胞 分裂增生染色体行为脱离常规是导致 细胞及其再生株特征、特性变异的根 本原因。
第二节 细胞工程技术
一、植物组织培养 植物组织培养就是在无菌条件下利用人工培养基 对植物组织、器官及原生质体等进行培养。 1、选择培养基 不同物种，外植体有差异，组织培养基多种多样。 但它们都包含三大类组分：无机成分、有机成分、 生物调节物质。不同培养基区别主要是无机盐的 含量与种类，变化幅度最大的是生长调节物质， 使用时根据培养物的差异，精心选择。
2、培养方法
可分为固体培养法和液体培养法及派生出一 些不同形式的培养方法。 3、培养过程
培养条件满足要求，原生质体首先形成新细 胞壁，继而进行分裂，形成多细胞团。在 促进分化的条件下还能分化出芽、茎、根， 再生成完整的植株。
二、原生质体融合 （一）融合的基本方法 1、原生质体的选择 A、原生质体量多、活力强、遗传上一致； B、双亲至少有一方具有诱导原生质体再生成完 整植株的成熟技术； C、应带有可供融合后识别异核体的性状，如颜 色、核型等； D、在异核体发育中有能选择杂种的标记形状， 如营养突变体或对药物敏感等。
5、原生质体活力测定 一般对原生质体活力的检查，凭形态即可 识别。 把形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色 新鲜的原生质体放入略为降低渗透浓度的 溶液或培养基中，即可见到分离时缩小的 原生质体又恢复原态，那些正常膨大的都 是有活力的原生质体。
（二）原生质体培养 1、培养基及培养条件 培养基 不同植物的原生质体对营养的需求不 同，应根据试验来决定。 培养基的种类很多，效果较好的有KM培养基、 KM8P培养基、V—KM培养基等。 注意：植物激素、原生质体密度、光照和温 度、氮源种类等。
二、细胞变异体和突变体选择
（一）体细胞变异的机制： 1、细胞内DNA重复复制 2、三极或多极纺锤体的形成与非整倍体产生 3、染色体断裂与重组 4、类减数分裂现象
（二）体细胞突变体的筛选与利用 1、植物细胞突变体的类型 （1）抗性突变体 A、抗病突变体 B、抗除草剂突变体 C、抗抗生素突变体 D、抗氨基酸及类似物突变体 E、抗盐突变体 F、抗旱突变体
培养基的成分
无机盐 大量元素 C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl 和水 微量元素 Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na
水
蒸馏水、双蒸水或使用去离子水
有机化 糖 碳源和能源 合物 氨基酸类 有机氮源 维生素类 维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒 哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等
消毒时间（min） 消毒效果 5~30 5~30 5~15 很好 很好 好
溴水
硝酸银 氯化汞 抗生素
1~2
1 0.1~1 4~50mg/L
易
较难 较难 中
2~10
5~30 2~10 30~60
很好
好 最好 较好
无菌操作、无菌培养
4、诱导脱分化 外植体是已分化成各种器官的植物组织。 组织培养首先就是让这些组织细胞脱分化， 使细胞重新处于有丝分裂的分生状态，诱 导愈伤组织。因此，培养基中一般都添加 较高浓度的生长素类激素。具体做法是： 外植体消毒后，切成小短插入或平放在培 养基上即可。
3、对外植体进行消毒处理 一般程序 外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 无菌滤纸吸干 注意： ①消毒剂种类 不同外植体对试剂的敏感程 度不同 ②消毒试剂 幼嫩组织比老组织时间要短些 ③在超净工作台上进行。
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 过氧化氢
使用浓度（%） 消除难易 2 9~10 10~12 易 易 最易
培养基的配制
(1)水和药品 水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。 (2)母液的配置 为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配 制时按规定用量稀释混合。 (3)制备培养基 混合各成分母液
熔化琼脂
(4)培养基的消毒
搅拌混匀
调pH值
分装
灭菌
放置备用
（1）克服远缘杂交不育 （2）促进核果类植物胚的形成 核果类早熟品种与晚熟品种的区别是 胚发育不健全、生活力不强，而以早 熟品种为母本与晚熟品种杂交，很难 得到杂交后代。如果用幼胚离体培养 就能得到杂交后代。
（3）打破种子的休眠期 许多植物的种子存在明显的休眠期， 有些植物的休眠期很长。由于种子结 构而存在的休眠可以用常规方法消除， 而由于胚乳抑制物质所引起的休眠只 能通过胚的离体培养才能获得理想的 效果。