细胞外信号调节蛋白激酶5_/_凋亡调节蛋白信号途径在低温诱导心肌细胞损伤及凋亡中的调控作用

stimulation induced neonatal rat’s CMs damage and apoptosis.
Key words Hypothermal stimulation; Cardiomyocytes; Extracellular regulated protein kinase-5; Bcl-2 interacting
damage, while Bim siRNA played the role to against those effects in hypothermal stimulated CMs.
Conclusion: Our study revealed that ERK5/Bim pathway played the important regulative roll in hypothermal
evaluated by fluorescent labeling and flow cytometry.
Results: In hypothermal stimulated CMs, ERK5 siRNA could promote Bim protein expression, but Bim siRNA
结论：在低温干预下的心肌细胞中，下调 ERK5 可释放对 Bim 的表达抑制，加重凋亡、细胞内钙离子超载、ROS 爆发，造成更严重的线粒体膜电位破坏，而下调 Bim 则产生反向的保护作用。结果显示 ERK5 / Bim 途径在低温诱导 心肌细胞损伤中的重要调控作用。 关键词 低温刺激；心肌细胞；细胞外信号调节蛋白激酶 5; 凋亡调节蛋白 Bim
Abstract
Objective: To explore the regulative role of extracellular regulated protein kinase-5 (ERK5)/Bcl-2 interacting
mediator of cell death (Bim) pathway in hypothermal stimulation induced neonatal rat’s cardiomyocytes (CMs) damage
凋亡的机制涉及许多方面如线粒体膜通透性细胞内活性氧簇ros和钙离子水平等电位m破坏可导致电子传递链中断停止氧化磷酸化并增加细胞内活性氧从而促进细胞损伤酸化造成细胞的不可逆的损害讨了低温刺激诱导的心肌细胞损伤与线粒体途径细胞凋亡ros爆发以及细胞内钙超载的关联性
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中国循环杂志 2014 年 7 月 第 29 卷 第 7 期（总第 193 期）Chinese Circulation Journal，July，2014，Vol. 29 No.7（Serial No.193）
小干扰 RNA 干预：针对大鼠 Bim 的 siRNA 购 自 美 国 Sigma 公 司（ 参 考 序 列 编 号：NM_022612）。 大 鼠 ERK5 特 异 性 siRNA 设 计 序 列 如 下：＃ 1： 5'-CAGUCACUUGUGCCACCUATT-3' ＃ 2： 5'-GGAGGAAUUCUUAAACCAATT-3'; ＃ 3： 5'-GGCCCUGUAUCUCAGACUATT-3'（ 参 考 序 列 编 号：NM_002749）。胰蛋白酶消化心肌细胞，接种于 60 毫米规格平皿，培养 24 小时后转染 siRNA。使 用脂质体为转染介质，以非编码 siRNA 作为对照。 转染 48 小时后，用于低温刺激干预。
and apoptosis.
Methods: CMs were cultured for hypothermal stimulation and the specific siRNA was used to down-regulate the
ERK5 or Bim in CMs. The cell apoptosis was detected by flow cytometry, protein expression was examined by Western blot analysis, the intracellular Ca2+, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) were
基础与实验研究
细胞外信号调节蛋白激酶 5 / 凋亡调节蛋白信号途径在低温诱导 心肌细胞损伤及凋亡中的调控作用
王耀晟， 程晓曙， 洪葵 ，吴宗贵， 李毅刚
摘要 目的：探讨低温刺激诱导心肌细胞损伤及凋亡，以及细胞外信号调节蛋白激酶 5（ERK5）/ 凋亡调节蛋白 Bim 途
径的调控作用。 方法：基于乳鼠原代心肌细胞，低温Bim
作者简介 : 王耀晟 主治医师 博士 主要从事心血管疾病分子生物学机制研究 Email: wangys360@ 163. com 通讯作者 : 王耀晟 中图分类号 : R54 文献标识码 : A 文章编号 : 1000-3614( 2014 ) 07-0540-05 doi: 10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.07.016
低 温 刺 激 干 预：低 温 刺 激 设 定 为：细 胞 置 于 35℃、5％ CO2 细胞培养箱，每天 8 小时，共干预 4 天（共计 32 小时的低温刺激 ）。低温刺激外的时间， 细胞置于正常培养条件下（37℃，5％ CO2）。对照组 设定为正常 37℃，5％ CO2 条件中全程培养 4 天。
实 验 分 组：对 照 组；低 温 刺 激 组；低 温 刺 激 加 非 编 码 siRNA 即 阴 性 对 照 组；低 温 刺 激 加 Bim siRNA 组（加 Bim 组 ）；低温刺激加 ERK5 siRNA 组（加 ERK5 组 ）；低温刺激加 ERK5 siRNA、Bim siRNA 共转染组（共转染组 ）。所有实验检测均重 复 3 次。
中国循环杂志 2014 年 7 月 第 29 卷 第 7 期（总第 193 期）Chinese Circulation Journal，July，2014，Vol. 29 No.7（Serial No.193）
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人体正常核心体温保持在 36.6~37.6 ℃，暴露 于极端寒冷时，体内核心温度稳态被破坏 [1]，刺激 交感神经，影响血管收缩，造成血压、心率波动， 诱导血小板活化、促进血栓形成 [2]。低温诱导心肌 损伤的细胞和分子生物学机制仍不完全清楚。体外 研究报告发现低温刺激加速心肌细胞（CMs）凋亡 [3]。 凋亡的机制涉及许多方面，如线粒体膜通透性、细 胞内活性氧簇（ROS）和钙离子水平等 [4]。线粒体膜 电位（ΔΨm）破坏可导致电子传递链中断，停止氧 化磷酸化，并增加细胞内活性氧，从而促进细胞损 伤 [5]。细胞内钙超载，也可导致异常线粒体氧化磷 酸化，造成细胞的不可逆的损害 [6]。故此本研究探 讨了低温刺激诱导的心肌细胞损伤与线粒体途径细 胞凋亡、ROS 爆发，以及细胞内钙超载的关联性。 凋亡调节蛋白 Bim 是 Bcl-2 家族中的促凋亡成员， 其在各个器官中广泛表达 [7]。在不同类型细胞中， Bim 的转录水平、亚细胞定位和磷酸化形式各不相 同 [8]。目前，Bim 在低温刺激引起心肌细胞凋亡中 的具体机制不明。研究发现 Bim 的上游存在调控物 质，可能与细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）传导通 路有关。抑制 ERK 可产生 Bim 的上调效应 [9]。而 同属丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）亚家族成员的 ERK5 是否参与其中，少见报道。本研究着重探讨 ERK5 / Bim 途径在低温诱导心肌细胞损伤及凋亡中 的调控作用。
mediator of cell death

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:540.)
作者单位 : 200092 上海市，上海交通大学医学院附属新华医院 心内科（ 王耀晟、李毅刚）；南昌大学第二附属医院 心内科（程晓曙、洪葵）； 上海第二军医大学第二附属医院 心内科（吴宗贵）
could not influence ERK5, while attenuated p-ERK5 expression. ERK5 siRNA induced higher apoptosis rate, while Bim siRNA could decrease such effect. ERK5 siRNA increased the intracellular Ca2+ overloading, ROS activation and ΔΨm
羧基 -2', 7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（6-carboxyH2DCFHDA）、5, 5', 6, 6'- 四氯 - 1, 1, 3, 3'- 四乙基苯 并咪唑 - 硫杂羰花青碘化物（JC-1，美国 Invitrogen 公司 ）。
原代心肌细胞培养：乳鼠浸泡在 70％酒精内 麻醉处死。取心室组织温浴 PBS 溶液洗涤后剪碎， 以 0.25％胰蛋白酶在 37℃温浴消化 10 分钟。加入 含 10％胎牛血清 DMEM 终止消化。弃上清液后加 入 0.25％胰蛋白酶在 37℃温浴消化 15 分钟，收集 上 清 液。 上 述 消 化 步 骤 重 复 四 次。 收 集 所 有 上 清 液室温下 1500 转 / 分钟离心 10 分钟，细胞重悬后 以 5×104 cells/cm2 密 度 铺 皿 培 养， 加 入 0.1 ml/ L BrdU。 24 小时后换液备实验用。
The Regulative Role of ERK5/Bim Pathway in Hypothermal Stimulation Induced Neonatal Rat’s Cardiomyocytes Injury and Apoptosis
WANG Yao-sheng, CHENG Xiao-shu, HONG kui, WU Zong-gui, LI Yi-gang. Department of Cardiology, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai (200092), China Corresponding Author: WANG Yao-sheng, Email: wangys360@
1 材料与方法
实 验 动 物 与 材 料：2012-01 至 2012-12 选 择 新 生 1~2 天的 sprague dawley（SD）乳鼠（中国科学院 上海实验动物中心，合格证号 : 中科院动管会第 005 号 ）。改良 Eagle 培养基（ DMEM）、胎牛血清、胰 蛋白酶（美国 Gibco 公司 ），培养皿（ 美国 Corning 公司 ），5- 溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU，美国 Sigma 公 司 ），脂质体转染试剂盒（美国 Invitrogen 公司 ），蛋 白抽提试剂盒（武汉博士德公司 ）。羊抗鼠 Bim EL 抗体、ERK5 抗体、p-ERK5 抗体（北京爱迪博公司 ）， β- 肌动蛋白（β-actin 内参照 ）抗体和抗山羊活化 辣根过氧化物酶 -IgG 抗体（美国 Santa Cruz 公司 ）， 化学发光试剂盒（英国 Amersham 公司 ）。膜联蛋白 V- 荧光素 / 碘化丙啶（Annexin V-FITC / PI）细胞凋 亡检测试剂盒（美国 BD Pharmingen 公司 ）。钙离子 荧光（Fluo-3AM）探针（北京泛博生化公司 ）。 6 -
的表达；细胞凋亡使用流式细胞仪检测；各蛋白表达水平通过 Western blot 检测；细胞内钙离子、活性氧簇（ROS）水平、 线粒体膜电位（ΔΨm）通过荧光标记及流式细胞仪检测。
结果：在低温刺激下的心肌细胞中，ERK5 siRNA 可加剧 Bim 蛋白表达；Bim siRNA 不影响 ERK5，但减轻 p-ERK5 表达；ERK5 siRNA 导致更高的细胞凋亡率，Bim siRNA 则可减弱 ERK5 siRNA 的促凋亡作用；ERK5 siRNA 加重了细胞 内钙离子超载、ROS 激活、线粒体膜电位破坏，Bim siRNA 则可对抗上述损伤性作用。