大孔吸附树脂纯化山楂叶总黄酮

大孔吸附树脂纯化山楂叶总黄酮
吴华;奚玉石;张守勤;梁清
【摘要】研究D101大孔吸附树脂分离纯化山楂叶总黄酮的工艺条件以及参数, 为山楂叶总黄酮的工业化生产提供参考.通过静态和动态试验相结合,对D101大孔树脂吸附纯化山楂叶总黄酮性能考察, 以吸附和洗脱性能参数为考察指标综合评价,证明D101大孔吸附树脂对山楂叶总黄酮有良好的吸附分离效果,适于山楂叶总黄酮的纯化.结果表明:树脂对山楂叶总黄酮的饱和吸附量为78mg/g ,山楂叶总黄酮主要集中在10%～70%乙醇洗脱液中;山楂叶提取物上D101树脂柱床,以水、10%乙醇洗脱后以70%乙醇洗脱,最终产品中山楂叶总黄酮纯度达82%,总黄酮收率达98%,说明采用D101大孔树脂分离纯山楂叶黄酮可行.
【期刊名称】《农机化研究》
【年(卷),期】2008(000)011
【总页数】4页(P139-142)
【关键词】山楂叶;黄酮类化合物;大孔吸附树脂;分离纯化
【作者】吴华;奚玉石;张守勤;梁清
【作者单位】吉林大学,生物与农业工程学院,长春,130022;吉林大学,生物与农业工程学院,长春,130022;吉林大学,生物与农业工程学院,长春,130022;吉林大学,生物与农业工程学院,长春,130022
【正文语种】中文
【中图分类】S661.5;R284.2
0 引言
山楂叶为蔷薇科植物山里红(Crataegus Pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br.) 或山楂(Crataegus Pinnatifida Bge)的干燥叶，近几年来对山楂叶成分的研究主要集中在山楂叶黄酮上。

其中，金丝桃苷、芦丁、槲皮素、牡荆素鼠李糖苷等黄酮类化合物是山楂叶主要有效部位。

山楂叶黄酮不但具有抗氧化、抗癌、利尿的作用，而且具有对心肌缺血起保护作用和防治冠心病等心血管病的作用[1-2]。

目前，总黄酮的提取分离方法有煎煮法、超声循环提取[3]、酶法[4]、微波辅助萃取、醇提水沉加溶剂萃取法、聚酰胺分离法、树脂吸附法等[5-6]。

超高压提取技术[7-8]是一种新兴的天然药物有效成分提取技术，它是利用100MPa以上的流体静压力作用于料液上，经过短时间提取后迅速卸压，然后再进行分离纯化的一种提取技术,具有提取时间短、能耗低、操作简单、提取率高等优势。

本试验采用超高压提取山楂叶总黄酮，对D101大孔吸附树脂分离山楂叶总黄酮工艺进行了考察。

1 仪器和材料
DL700超高压等静压机(上海大隆机器厂)，日本岛津LC20A高效液相色谱仪，UV757CRT紫外可见光分光光度计(上海分析仪器厂)，MV110电子天平(上海天平仪器厂)。

D101大孔树脂(天津市海光化工有效公司)；山楂叶由长春三九药业提供，产地河北；芦丁对照品(中国药品与生物制品检定所)；乙醇为分析纯。

2 方法及结果
2.1 山楂叶总黄酮的测定
以芦丁为标准品，用比色法测定总黄酮含量。

精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置于50mL量瓶中，加乙醇适量，于30℃水浴锅中加热，使之溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。

精密量取20mL，置50mL量瓶中，加水至刻
度，摇匀，即得。

精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加4%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min；以相应试剂为空白，在500nm的波长处测吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

回归方程为：C =0.077×ABS ，R2=0.9998，表明山楂叶黄酮在8～48μg/mL与吸光度线性关系良好。

2.2 样品溶液的制备
称取山楂叶粉末500g，装入塑料袋中，加入50%乙醇2 500 mL，混匀，压力为300MPa，提取时间为10s；取出，过滤，取续滤液，减压浓缩至无醇味，即得样品溶液(溶液中黄酮浓度9.625mg/mL)。

2.3 药材上样量的确定
精密称定1g、2g、3g、4g、5g D101大孔树脂，置于6个50mL锥形瓶中, 精密吸取15mL(溶液中黄酮浓度9.625mg/mL)样品液，每隔5min振摇10s，持续2h；然后静置24h,使其达到饱和吸附,吸取上层液测定总黄酮浓度，最后折算为黄酮吸附量和黄酮吸附率(黄酮吸附量=[(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积]/树脂质量；黄酮吸附率=(初始浓度-吸附后浓度)/初始浓度)。

不同比例的总黄铜量与树脂静态吸附测定结果，如表1所示。

表1 不同比例的总黄酮量与树脂静态吸附测定结果Tab.1 Result of static adsorption by different ratio of total flavoniods/ resin黄酮量:树脂量/g:g吸附后浓度/mg·mL-1黄酮吸附量/mg·g-1黄酮吸附率
/%1:71.883116.1380.4361:141.04074.38889.1951:210.91243.65690.5251:28 0.86432.85491.0231:350.84021.96391.273
从表1中可以看出，总黄酮量与树脂量比值不同，黄酮吸附率也不同。

当黄酮量
与树脂量比值为1：14时，其最大静态吸附容量为74.338mg/g,树脂吸附率为89.195%，大孔树脂吸附总黄酮量基本达到饱和。

2.4 大孔吸附树脂的吸附动力学特征
吸附动力学特征反映的是随时间的延长，树脂对样品分子吸附量的变化趋势。

精密称定的4g D101大孔树脂中置100mL烧杯中, 加入30mL(溶液中黄酮浓度9.625mg/mL)样品液,然后静置24h,使其达到饱和吸附。

静置期间，每隔一定时间吸取上层液测定总黄酮浓度，折算成树脂吸附量。

绘制大孔树脂静态吸附动力学曲线，如图1所示。

图1 D101树脂对总黄酮静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption curve of D101 resin to total flavoniods
结果表明，D101大孔吸附树脂对山楂叶黄酮的吸附为快速平衡型，在0.5h内基本接近平衡，起始阶段吸附量都较大，到2h以后吸附量变化平缓。

因此，在实际应用中，应综合考虑生产周期等因素，上样后静态吸附2h即可。

2.5 乙醇浓度的选择
精密称取处理好的D101型大孔树脂1g(6份),分别置带塞锥形瓶中,加15mL样品液；充分吸附后,分离树脂,晾干,对应加入浓度分别为20%、30%、50%、60%、70%、90%的乙醇各20mL, 每隔5min振摇10s,持续2h；吸取上层液测定总黄酮浓度,测定洗脱液浓度,计算洗脱率。

不同浓度乙醇对总黄酮洗脱性能的影响，如表2所示。

表2 不同浓度乙醇对总黄酮洗脱性能的影响Tab.2 Eluting efficiency of different concentration of ethanol to total flavoniods乙醇浓度/%洗脱后浓度/ mg·(mL)-1洗脱量/mg洗脱率
/%200.2214.426.95300.79315.8624.96502.9258.5291.96602.94558.9092.557 02.99359.8694.16903.03160.0594.23
表2结果表明，20%、30%乙醇洗脱率较低,而乙醇浓度达到70%以上，洗脱率就不再明显增加。

所以，初步选定在以后试验中70%乙醇作为洗脱剂。

2.6 动态吸附试验
分别取两个树脂柱Ⅰ柱和Ⅱ柱，精密称取D101型大孔吸附树脂120g和50g，预处理后湿法上柱，上样山楂叶提取溶液，用水冲洗控制流速为3BV/h，然后用70%浓度的乙醇溶液进行洗脱,控制流速2BV/h,收集70%乙醇洗脱液,减压回收真空蒸干，烘至恒重后,检测计算总黄酮纯度。

动态吸附洗脱试验结果如表3所示。

表3 动态吸附洗脱试验结果Tab.3 Result of dynamical eluting experiment树
脂量/g上样总黄酮量/g收得总黄酮量/g总黄酮纯度/%黄酮吸附量/mg·g-1Ⅰ柱5.25.176.0741Ⅱ柱5.22.7269.6378
从表3中可以看出，Ⅱ柱的大孔树脂柱总黄酮的吸附百分比为98%，这说明上样
的山楂叶总黄酮完全被吸附在树脂上，树脂未达到饱和吸附；而Ⅰ柱总黄酮吸附的百分比为52%，吸附不完全。

由此可见，Ⅱ柱吸附量已经达到饱和量，其饱和吸
附量为78mg/g，与静态吸附试验时所确定的饱和吸附量基本一致。

即D101型
大孔树脂动态吸附山楂叶总黄酮饱和吸附洗脱量为78mg/g。

2.7 乙醇洗脱量的确定
在试验中，70%乙醇洗脱过程中，每洗脱2BV乙醇溶液后留样1mL，共留样5次，测溶液中总黄酮浓度，试验结果如图2所示。

试验结果表明，用4BV的70%乙醇洗脱，树脂中的黄酮类物质已经基本洗脱完全。

图2 乙醇用量对山楂叶黄酮洗脱性能的影响Fig.2 Eluting efficiency volume of ethanol to total flavoniods
2.8 不同浓度乙醇洗脱对总黄酮纯度的影响
精密称取D101型大孔吸附树脂150g，预处理后湿法上柱，树脂柱体积为1
100mL；称取山楂叶130g，按照优化处理求得的高压提取参数处理，提取液过滤，减压浓缩至无醇味，浓缩液加水定容于500mL容量瓶备用，经检测黄酮类化合物浓度为2.397mg/mL。

上样山楂叶提取液480mL，用水洗脱，然后用10%、30%、50%、70%、95%
浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱,洗脱至洗脱液无色为止；收集不同浓度乙醇洗脱
液于烧杯中,每种洗脱液各留样5mL于试管中备用。

将烧杯中各浓度洗脱液浓缩干燥，检测结果如表4所示。

表4 不同浓度乙醇洗脱产物混合的结果Tab.4 Result of different concentration of ethanol elution mix乙醇浓度/%混合物总黄酮含量/%总黄酮收率/%10、30、50、70、9575.710010、30、50、7079.39930、50、70、9577.49930、50、7082.09830、5084.48850、7083.879
从表4可以看出，30%、50%、70%乙醇洗脱得黄酮的量占洗脱所得总黄酮的98%，占洗脱得总黄酮绝大部分，且3者混合物总黄酮纯度为82%，满足试验前
预想的分离产物总黄酮纯度超过80%的目的。

因此，10%乙醇洗脱得的洗脱液弃去，然后用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，并浓缩干燥，所得成品中总黄酮纯度可
达82%，总黄酮收率达98%。

3 结论
1) 采用D101大孔树脂分离纯化山楂叶黄酮是可行的。

D101树脂是一种球形非
极性苯乙烯吸附剂，适宜从水溶液中分离黄酮类成分。

吸附树脂粒可通过再生反复使用。

其动态吸附山楂叶总黄酮饱和吸附洗脱量为78mg/g，上样后，水洗脱完
全后，10%乙醇洗脱得的洗脱液弃去，然后用70%乙醇洗脱，4BV乙醇洗脱量，
收集洗脱液，并浓缩干燥，成品中总黄酮含量可达82%。

2) 吸附树脂用于山楂叶总黄酮的分离，省去了传统溶剂萃取法的繁琐工艺，仅吸附—洗脱一步工艺即可得到高含量的山楂叶总黄酮，且收率高、成本低、操作简
便，适于工业化规模生产。

【相关文献】
[1] 闵清，白育庭，吴基良.山楂叶总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的影响[J].中国药学杂志，2005，40(7)：515-519.
[2] 纪影实,张晓丹,李红.山楂叶总黄酮对脑缺血的保护作用[J].吉林大学学报医学
版,2005,31(6):879-882.
[3] 杨喜花，陈敏，朱蕾,等.超声循环提取沙棘叶中总黄酮的研究[J].农业机械学报, 2006，37(3)：166-168.
[4] 王晓，李林波，马小来，等.酶法提取山楂叶中总黄酮的研究[J].食品工业科技，2002，23(3)：37-39.
[5] 郭永学，李楠，郝长全.大孔吸附树脂纯化山楂叶总黄酮工艺研究[J].中成药，2006，28(1)：
23-26.
[6] 赵艳菊，王艳辉.大孔吸附树脂法纯化山楂黄酮的工艺研究[J].化学与生物工程，2006，23(5)：23-25.
[7] Zhang Shouqin, Zhu Junjie,Wang Changzheng.Novel high pressure extraction technology [J].Int J Pharm，2004,278:471-474.
[8] Zhang Shouqin, Xi Jun, Wang Changzheng. High hydrostatic pressure extraction of falvonoids from propolis[J].J Chem Technol Biotechnol，2005,80：50-54.。