NaCl胁迫对水稻品种中花11幼苗根系生长发育的影响

NaCl胁迫对水稻品种中花11幼苗根系生长发育的影响
高林;陈春丽
【摘要】以水稻中花11幼苗为材料,探讨高浓度NaCl处理对其根系生长发育的影响.结果表明,200mmol/L NaCl胁迫下,幼苗胚根生长受到抑制,不定根数目减少,根毛数量减少长度变短；幼苗根系出现褐化,且根系木质素含量增加,根系过氧化物酶(POD)活力显著上升；半定量RT-PCR检测显示,盐胁迫应答基因OsCDPK7表达显著下降,P5 CS1表达上升,OsHKT1；5、OsNHX1在处理初期表达上升,其后随处理时间延长而下降.%With rice (Oryza Sativa L. subsp. japonica cv. zhonghua 11) seedlings as experimental material, analysed effects of high-concentration NaCl stress on their root growth and development. The results indicate that under 200 mmol/L NaCl treatment, roots became browning, main root growth was inhibited, adventitious root number and root hair amount was decreased; but the root lignin content and peroxidases ( POD) activities increased. Semi-quantitative RT-PCR showed OsCDPK 1 expression was inhibited in salt-treated seedlings, while P 5 CS 1 was upregulated, and the accumulation of OsHKT 1; 5 and OsNHX 1 transcripts increased in early treatment period,then downregulated.
【期刊名称】《种子》
【年(卷),期】2012(031)007
【总页数】6页(P7-12)
【关键词】水稻;盐胁迫;根生长发育;过氧化物酶;半定量RT-PCR;盐胁迫应答基因
【作者】高林;陈春丽
【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院,湖北武汉 430070;华中农业大学生命科学技术学院,湖北武汉 430070
【正文语种】中文
【中图分类】S511
土壤盐渍化是导致农作物产量降低的主要环境因子之一［1］。

水稻唯一的地下器官——根系具有吸收水分和养分的功能，也合成水稻生长所必需的重要物质，苗期根系形态建成对其以后的生长发育至关重要［2］，增强水稻根系对盐旱的耐受能力是水稻分子育种的一个重要方向。

中花11是遗传转化的重要材料［3］，揭示该品种幼苗根系在高盐胁迫下表现，将有助于为基因工程培育水稻耐盐品种提供早期筛选指标。

本试验以水稻中花11幼苗为材料，探讨NaCl胁迫对水稻根系形态和细胞结构的影响，并检测相关盐胁迫应答基因的表达水平，以期为耐盐转基因水稻筛选提供科学依据。

取粳稻品种中花11(Oryza Sativa L.subsp.japonica zhonghua 11)种子若干粒，剥去颖壳，37℃培养箱处理2 d。

将种子75%乙醇表面消毒1 min，0.1%升汞溶液灭菌20 min，无菌水清洗后转入含有1/2 MS培养基的无菌方形塑料透明培养皿中(13 cm×13 cm)，28℃黑暗处理2 d，移至16 h/8 h(光照/黑暗)条件下竖直培养。

待预培养的种子萌发4 d，各取主根长度相近的幼苗不少于30颗，分别移入含有200 mmol/L NaCl和不含NaCl 1/2 MS培养基的方皿，16 h/8 h(光照/黑暗)的光周期28℃竖直培养。

NaCl处理24 h，取方皿并以坐标纸为标尺，数码相机拍照，记录幼苗不定根数目及主根生长状况。

使用专业图像分析处理软件(Image-Pro Plus 6.0)的曲线测量工
具测量记录照片中水稻幼苗主根长度。

根长计算方法采用以下公式:根长
=V(1)×0.5 cm/V(2)，其中V(1)代表Value(1)，指曲线工具测量的主根长度像素值;V(2)代表Value(2)，指直线工具测量的0.5 cm长度标尺像素值。

试验重复3次，采用统计软件(SPSS Statistics)LSD test进行差异显著性分析。

分别取NaCl处理12 d的幼苗根和未处理对照组幼苗根各6～10条，体式显微镜(Olympus SZX 16)观察根毛变化情况，数码摄影系统(SPOT CCD)拍照记录。

间苯三酚染色方法［4］。

按照1.1方法进行NaCl处理，取处理12 d和对照组的幼苗各6株，1%间苯三酚染色液(1 g间苯三酚溶于70%乙醇)染色10 min，移去间苯三酚染色液，18%盐酸处理5 min，取根立即在体式显微镜(Olympus SZX 16)下观察，数码摄影系统(SPOT CCD)拍照记录。

木质素含量测定方法参考Lin［5］的方法，略有更改。

按照1.1方法进行NaCl处理，分别取处理12 d和对照组幼苗的根0.05 g，置于研钵中，加入95%乙醇，研磨。

匀浆3 000 g离心5 min。

沉淀以95%乙醇冲洗3次，乙醇-己烷(1∶2，V/V)混合液冲洗2次，自然风干。

取沉淀溶于1 mL溴乙酰-乙酸(1∶3，V/V)溶液中，70℃恒温水浴30 min。

自然冷却至室温，加入0.9 mL 2 mol/L NaOH和0.1 mL 7.5 mol/L盐酸羟胺，再加入乙酸至10 mL，3 000 r/min离心5 min。

取上清液于紫外分光光度计(岛津UV1750)280 nm下测定吸光值。

以每克鲜样在280 nm下的吸光值表示木质素含量，单位为A280/g(FW)。

在1.1描述的培养条件下，分别取200 mmol/L NaCl处理12 d和对照根尖各6～10条，采用包埋剂(Tissue-Tek)包埋，冰冻切片机(Leica CM 1900)切片，切片厚度20 μm，正置显微镜(Olympus BX61)观察，数码摄影系统(SPOT CCD)拍照记录。

POD酶活性测定方法参考Luo［6］的方法。

按照1.1方法进行NaCl处理水稻幼苗，取处理4 d和未处理对照组的幼苗根各0.05 g，经液氮速冻后存入－80℃环
境，用于提取POD酶液。

取样品置入含液氮研钵，迅速研磨，加入2 mL预冷PBS缓冲液(pH=7.8)。

将研钵置于冰上至缓冲液解冻，充分研磨后将匀浆移入离
心管中，15 000 r/min 4℃离心20 min，上清液用于测定POD酶活。

POD酶活测定反应体系:0.1 mol/L HAC-NaAC缓冲液(pH=5.0)1.85 mL，0.25%愈创木酚
1 mL，0.75%H2O2100 μL，酶液50 μL。

加入酶液开始反应并计时，反应前3 min每隔1 min于紫外可见分光光度计(岛津UV 1750)470 nm波长下测定OD 值，以每分钟变化1个OD值作为1个酶活力单位(U)，以U/(g·min)(FW)作为酶的活力单位。

试验重复4次，采用统计软件(SPSS Statistics)LSD test进行差异显著性分析。

1.7.1 水稻幼苗盐处理试验取样
按照1.1方法NaCl胁迫处理水稻幼苗，分别在处理1、2、3 d各时期整株取样，并在相应时间点取未处理对照组幼苗，经液氮速冻存入－80℃环境，用于提取总RNA。

1.7.2 水稻幼苗总RNA提取及反转录合成第一链
水稻幼苗总RNA的提取采用TranZol试剂(北京全式金生物技术有限公司)，试验
步骤参照说明书。

去除基因组DNA采用DNase I(RNase free，宝生物工程(大连)有限公司)参照试剂说明书进行，37℃反应1 h，80℃2 min终止反应。

总RNA
反转录方法采用反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技术有限公司)，42℃反应1 h，85℃5 min终止反应。

1.7.3 半定量RT-PCR扩增检测基因表达量
软件primer 5.0设计半定量RT-PCR扩增所使用引物，引物序列见表1。

半定量RT-PCR在ABI 9700 PCR仪上进行，程序为94℃5 min(94℃30 s，退火温度72℃30 s)，72℃5 min，退火温度及循环次数根据基因表达情况确定(OsHKT 1;5、OsCDPK 7、OsNHX 1、P 5CS 1、GAPDH的循环数分别是54℃和35、56℃和
30、56℃和35、54℃和28、50℃和28)，取扩增产物10 μL 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以水稻GAPDH基因(Os 04 g 40950)特异性引物(表1)扩增的产物为内
参标准(循环数28)。

生长4 d的水稻中花11幼苗经过200 mmol/L NaCl处理24 h，主根平均长度为2.38 cm，而未处理对照组幼苗主根平均长度为5.22 cm(图1 A)。

统计结果分析
表明，与对照组相比，盐处理组胚根平均长度与未处理对照组差异显著(p＜0.05)，且胚根长度小于对照组，表明盐处理条件下幼苗胚根生长受到抑制。

NaCl处理3 d，水稻幼苗平均不定根数目为1.8条，未处理对照组幼苗平均不定
根数目为3.1条(图1 B)。

统计结果分析表明，NaCl处理组水稻幼苗不定根数目少于对照组，两者差异显著(p＜0.05)，表明盐胁迫条件下不定根的发生受到抑制。

体式显微镜下分别观察200 mmol/L NaCl处理12 d水稻中花11幼苗和未处理
幼苗胚根的侧根发生部位和根尖成熟区根毛数量，发现NaCl处理的幼苗胚根侧根发生部位和根尖成熟区根毛数量明显减少(图2 B、D)，而且根毛长度(图2 B、D)
也明显小于对照组(图2 A、C)，表明盐胁迫条件下水稻幼苗根毛发生和伸长受到
抑制。

水稻中花11幼苗由200 mmol/L NaCl处理12 d，1%间苯三酚染色结果显示，
水稻中花11的根系包括整条主根、不定根和侧根均染色较深(图3 A、B，箭头所示)。

木质素含量测定结果显示，盐处理12 d的水稻中花11幼苗根部木质素含量为38.16 A280/g(FW)，而对照组根部的木质素含量为26.03 A280/g(FW)(图3 C)，表明盐处理后水稻中花11根部木质化加快，木质素含量增加。

200 mmol/L NaCl处理水稻中花11幼苗12 d，胚根的根尖和侧根发生部位发生明显褐变(图4 A)。

将胚根分为根尖和侧根发生部位2个区段，冰冻切片法横切观察褐变部位，发生褐变主要分布在根冠(图4 L)的小柱细胞，分生区(图4 J)、伸长区(图4 H)、成熟区(图4 D、F)和侧根形成部位(图4 B)，包括外表皮细胞、皮层
薄壁细胞、内皮层细胞、后生木质部细胞。

观察细胞形态发现，皮层薄壁细胞之间形成间隙(图4 D、H箭头所示)，表明盐胁迫条件下细胞发生皱缩。

另外，盐胁迫条件下部分内皮层细胞充满褐色物质，可能是细胞破裂死亡降解造成(图4 J箭头所示)。

生长4 d水稻中花11幼苗由200 mmol/L NaCl处理4 d，测定幼苗根系POD 酶的活力变化。

NaCl处理4 d，水稻中花11幼苗根系POD酶活力为6.30
U/(g·min)(FW)，而未处理对照组根系POD酶活力仅为1.54 U/(g·min)(FW)。

试验数据统计分析表明，NaCl处理下POD酶的活力比未处理对照组数值大，且差异显著(p＜0.05)，说明中花11幼苗根系在NaCl胁迫下POD酶活增强。

生长4 d水稻中花11幼苗在200 mmol/L NaCl处理下，分别在处理1、2、3 d 时整株取样，分析盐胁迫应答基因的表达变化。

NaCl处理，钙依赖蛋白激酶基因OsCDPK 7表达量显著下降，说明盐胁迫抑制OsCDPK 7的表达。

而水稻吡咯林-5-羧酸合成酶1基因P 5CS 1表达量始终高于未处理对照组，说明盐胁迫诱导P 5CS 1的表达。

水稻液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX 1和钠离子转运蛋白基因OsHKT 1;5在盐胁迫初期表达量上升，但随处理时间延长，表达量开始下降。

本试验以水稻品种中花11为材料进行高盐胁迫处理，发现水稻品种中花11受到高盐胁迫后其根长变短，且根毛和不定根的数目也减少，说明高盐胁迫抑制其胚根生长、不定根发生及根毛发生和伸长。

进一步发现盐处理使中花11根部木质化加快，木质素含量增加，表明盐胁迫影响水稻幼苗根系包括根毛的生长发育，其机制之一可能是盐胁迫改变了水稻幼苗根部木质素含量，从而由木质素变化导致影响根的生长和根毛发育(图7)。

在高盐胁迫下，植物根系细胞中过氧化物酶(POD)活性升高。

而木质素单体在细胞质中合成后，需要在过氧化物酶(peroxidase，
POX/POD)和漆酶(laccase，LAC)等的催化下通过一系列化学反应聚合生成具有生
物活性的木质素［7］。

盐胁迫能够增强POD活性，从而增加细胞壁中木质素的
含量，导致细胞壁硬化。

表皮细胞的细胞壁硬化会导致根毛起始和伸长受阻，导致减少根毛数量。

而根尖分生区和伸长区细胞过早木质化，会阻碍细胞的伸展和分裂，使根生长受阻。

植物体内H2O2的清除需要依赖POD的作用。

POD是植物体内担负清除H2O2
的主要酶类之一，能够催化H2O2氧化产生H2O，降低膜内不饱和脂肪酸过氧化程度，维持细胞膜的稳定性和完整性，从而提高植物抗性［8］。

对耐盐和盐敏感水稻材料POD同工酶研究表明，POD的变化与水稻耐盐性具有一定的相关性［9］。

本试验结果表明，高盐胁迫造成水稻中花11幼苗根系中POD活性增强。

POD能够与植物体中SOD、CAT及渗透调节物质等协同作用，清除活性氧自由基，保护细胞膜结构。

因此，POD活性可以用来鉴别盐胁迫下水稻的抗性。

植物根部是应对盐胁迫的首要部位，根部对Na+的选择性吸收/外排和区域化对植物响应盐胁迫具有重要作用［10］。

OsNHX 1定位在液泡膜上，在将胞质中高浓度的Na+和K+区隔到液泡中发挥重要作用［11］。

当水稻受到盐胁迫时，OsHKT 1;5通过木质部的卸载把地上部过量的Na+回流到根部，从而减轻Na+毒害，增强水稻耐盐性［12］。

本试验中，水稻液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX 1和钠离子转运蛋白基因OsHKT 1;5在盐胁迫初期表达量上升，表明这
两种蛋白在盐胁迫初期参与的Na+转运和液泡区域化，增强水稻的耐盐性。

但随
处理时间延长，其表达量开始下降，可能是水稻幼苗根系发生褐化及细胞皱缩等伤害造成。

脯氨酸可作为胞质渗压剂、酶和细胞结构的保护剂及自由基清除剂而起保护作用，从而增强植物的抗逆性［13］。

水稻基因P 5CS1是脯氨酸生物合成的限速酶。

已有研究表明，耐盐水稻品种FL 478、IR 63731和Pokkali在盐胁迫7 d
后P 5CS 1的表达量比盐敏感品种IR 29高1～2倍［14］。

在本试验中，P 5 CS 1表达量始终高于未处理对照组，表明盐胁迫诱导P 5 CS 1的表达，暗示脯氨酸
能增强水稻中花11的耐盐能力。

Saijo［15］研究表明，水稻Notohikari幼苗200 mM NaCl处理24 h，OsCDPK 7表达量上升。

而本试验中OsCDPK 7表达量受盐处理显著下降，这种结果可能是不同水稻品种间耐盐差异性造成的。

以水稻中花11品种为遗传转化材料的基因工程技术已得到广泛应用。

因此，研究高盐胁迫水稻中花11幼苗的根系性状及生理生化特征，有助于转基因水稻植株早期性状考察。

在本试验中，水稻中花11幼苗在高盐胁迫下，幼苗胚根、不定根和根毛生长受到抑制、根系细胞木质素合成增加以及POD酶活上升等形态、生理特征为耐盐转基因水稻幼苗筛选提供相关依据。

【相关文献】
［1］ Zhu J K.Plant salt tolerance［J］.Trends Plant Sci.，2001，6(2):66－71.
［2］姜秀娟，张素红，苗立新，等.盐胁迫对水稻幼苗的影响研究——盐胁迫对水稻幼苗期根系的影响［J］.北方水稻，2010(1):21－24.
［3］ Wu C，Li X，Yuan W，et al.Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome［J］.Plant J.，2003，35(3):418－427.
［4］ Li X，Yang Y，Yao J，et al.FLEXIBLE CULM 1 encoding a cinnamyl-alcohol dehydrogenase controls culm mechanical strength in rice［J］.Plant Mol Biol，2009，
69(6):685－697.
［5］ Lin C，Kao C.Cell wall peroxidase activity，hydrogen peroxide level and NaCl-inhibited root growth of rice seedlings［J］.Plant and Soil，2001，230:135－143.
［6］ Luo H，Li H，Zhang X，et al.Antioxidant responses and gene expression in perennial ryegrass(Lolium perenne L.)under cadmium stress［J］.Ecotoxicology，2011，20(4):770－778.
［7］ Bonawitz N D，Chapple C.The genetics of lignin biosynthesis:connecting genotype to phenotype［J］.Annu Rev Genet.，2010，44:337－363.
［8］王东明，贾媛，崔继哲.盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展［J］.中国农学通报，2009(4):124－128.
［9］王振英，郑坚瑜.盐胁迫下耐盐与盐敏感水稻的RAPD和POD同工酶检测［J］.应用与环境生物学报，2000(2):106－111.
［10］赵琪，戴绍军.蛋白质组学研究揭示的植物根盐胁迫响应机制［J］.生态学报，2012(1):274－283.
［11］ Fukuda A，Nakamura A，Tagiri A，et al.Function，intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+antiporter from rice［J］.Plant Cell Physiol，2004，45(2):146－159.
［12］ Ren Z H，Gao J P，Li L G，et al.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter［J］.Nat Genet.2005，37(10):1 141－1 146.
［13］刘娥娥，宗会，郭振飞，等.干旱、盐和低温胁迫对水稻幼苗脯氨酸含量的影响［J］.热带亚热带植物学报，2000，8(3):235－238.
［14］ Cotsaftis O，Plett D，Johnson A A，et al.Root-specific transcript profiling of contrasting rice genotypes in response to salinity stress［J］.Mol Plant.2011，4(1):25－41. ［15］ Saijo Y，Hata S，Kyozuka J，et al.Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants［J］.Plant
J.2000，23(3):319－327.。