耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究

耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究摘要：为了确定耐药性甲型流感病毒h3n2神经氨酸酶的抗原性质较野生型甲型流感病毒是否发生改变，利用原核表达方法在大肠杆菌中大量表达并纯化野生型甲型流感病毒h3n2的红细胞凝集素（ha）和神经氨酸酶（na）；取ha和na免疫后的小鼠血清分别对野生型和突变型甲型流感病毒h3n2进行western blotting、elisa 以及中和抗体检测。

结果表明，野生型甲型流感病毒以及第119位氨基酸单点突变型甲型流感病毒对ha和na免疫后的小鼠血清都有很好的免疫反应性，而第222位氨基酸单点突变和双点耐药突变型甲型流感病毒对免疫血清的免疫反应性要低很多。

该研究首次确定了甲型流感病毒h3n2的野毒株与耐药突变株的神经氨酸酶的抗原性质存在很大的差异，进一步表明耐药突变株病毒除了具有抗药物活性之外也具有逃逸机体所产生的抗体攻击的能力，可为将来新一代甲型流感病毒h3n2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供重要参考。

关键词：甲型流感病毒h3n2；耐药性；神经氨酸酶；点突变；免疫原性
中图分类号：r392.7 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）03-0613-05
病毒通常会采用不同的策略来逃逸机体的免疫攻击，因此研究病毒逃逸机制以及设计合理的方法来抑制病毒的逃逸，是目前疫苗研究的主要手段。

其中病毒一个重要的逃逸机制就是遗传突变，改
变其自身表面主要抗原的空间表位，从而使机体免疫系统不再识别并产生作用，达到躲避机体免疫的目的[1-5]，使得免疫系统和疫苗无效，病毒得以大量繁殖。

甲型流感病毒h3n2表面有两个主要的糖蛋白：红细胞凝集素（hemagglutinin，ha）和神经氨酸酶（neuraminidase，na）。

这两个蛋白编码基因都具有不同程度突变功能，通过引入新的突变，形成新的亚型病毒株来躲避机体免疫系统。

ha通过结合细胞膜上的唾液酸受体从而介导病毒内吞进入细胞[6]。

na通过切割新生病毒和细胞多糖末端唾液酸，有利于新形成的子代病毒颗粒从感染细胞中释放出去[7]，因此na的抗体可以通过与na特异性结合使na的活性丧失，从而抑制新生甲型流感病毒的释放，间接地达到中和甲型流感病毒的作用[8]。

目前，有临床研究表明某些突变型甲型流感病毒h3n2具有抗奥司他韦的能力，发现其na上的两个关键的氨基酸位点（第119和222位氨基酸）对病毒的抗药性起到了重要的作用，其中，第119位氨基酸由e突变为v，而第222位氨基酸由ⅰ突变成了l[9]，而且只有两点同时突变的情况下才具有明显的抗奥司他韦活性，但是不清楚该两点的突变是病毒迫于药物的压力还是迫于机体免疫力（主要为病毒中和抗体）的攻击而产生的。

为了解释这一问题，本试验对病毒突变前后na的抗原性质进行了比较，若病毒na在突变前后抗原性质未发生改变，可以推测该突变是病毒迫于药物的压力而产生的；反之，则认为突变是病毒迫于机体免疫攻击或是迫于
药物和机体免疫攻击的总压力而产生的。

以上问题的阐明可为将来新一代甲型流感病毒h3n2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。

1 材料与方法
1.1 基因、质粒、菌株及毒株
野生型甲型流感病毒na和ha截短型基因（均截去3′端150 bp）由吉林农业科技学院生物工程实验室构建；原核表达载体pet-32a （+）、大肠杆菌bl21、dh5α为吉林农业科技学院生物工程实验室保存；选用甲型流感病毒h3n2中国吉林流行株（genbank：
gu215036.1）为源病毒；na第119位氨基酸单点突变、第222位氨基酸单点突变以及双点突变型甲型流感病毒h3n2由吉林农业科技学院生物工程实验室包装并在mdck细胞中传代培养。

1.2 试剂
地高辛（nbt）和生物素（bcip）购自北京鼎国公司；辣根过氧化物酶hrp标记抗鼠igg购自晶美生物公司；碱性磷酸酶ap标记的抗鼠igg购自中山生物科技有限公司；野生型甲型流感病毒ha
和na鼠源抗血清由吉林大学人兽共患病实验室馈赠；蛋白marker、质粒小提试剂盒等购自takara公司；ni-nta agarose为qiagen公司产品。

1.3 ha和na截短型基因的原核表达及纯化
诱导表达和表达产物的提取按novagen公司的pet-32a表达系统操作手册进行，由于ha和na为包涵体表达，故用ni-nta agarose
按qiagen公司说明书纯化包涵体，pbs透析复性。

1.4 western blotting法定性检测ha和na抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的免疫反应
将野生型和突变型甲型流感病毒液用蛋白裂解液裂解，煮沸变性15 min，12 000 r/min离心15 min后，取10 μl进行sds-page，电泳完毕后以15 v电压转膜23 min，以3%脱脂奶常温封闭1 h后与相应的1∶1 000稀释的一抗和二抗（ap标记）进行常温免疫杂交，分别作用2 h和1 h。

最后以nbt和bcip为底物显色，进行western blotting显色。

1.5 间接elisa法定量检测ha和na抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的免疫反应
将ha或na抗原以10倍稀释起始，2倍梯度，稀释8个稀释度并包被，野生型甲型流感病毒ha或na抗血清以及阴性血清以20
倍稀释起始，2倍梯度，稀释6个稀释度，每孔均为100 μl，按间接elisa方法进行操作。

hrp标记的抗鼠igg抗体以1∶5 000稀释，每孔100 μl， 37 ℃孵育1 h，tmb避光显色10 min，用2 mol/l 硫酸终止反应。

用酶标仪测各孔od450 nm，以阳性孔od450 nm/阴性孔od450 nm值最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释浓度为最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度，并以此稀释度下该孔的
od450 nm作为elisa的最终结果。

1.6 中和抗体法功能性检测ha和na抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的中和能力
野生型甲型流感病毒ha和na抗血清中和抗体委托吉林省疾病预防控制中心负责检测，按照标准的甲型流感病毒中和抗体检测方法进行操作。

分别以野生型以及3种突变型甲型流感病毒h3n2作为感染病毒，每孔接毒100 tcid50；抗血清以8倍稀释起始，2倍梯度稀释，每孔100 μl，设复孔；病毒与抗血清37 ℃孵育1 h 后接种到96孔板中（10 000个mdck细胞/孔），连续5 d观察细胞情况，以能够抑制孔中一半的细胞发生病变时抗血清的最高稀释度作为中和抗体的滴度值。

2 结果与分析
2.1 ha和na截短型基因的原核表达及产物纯化结果
以截短型ha和na（3′端截去150 bp）连接到pet-32a（+）载体中所形成的质粒，在大肠杆菌bl21中目的基因得到大量表达，用镍柱纯化后，经sds-page检测，表明目的蛋白得到大量表达，大小位置正确，纯度达到90%左右，所得蛋白浓度分别为2.8 mg/ml （ha）和5.5 mg/ml（na）。

2.2 western blotting定性检测ha和na抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的免疫反应结果
用ha和na免疫小鼠后的多克隆抗血清对野生型和多种突变型的甲型流感病毒进行western blotting检测，结果（图2）显示，ha和na抗血清都能够检测出野生型和突变型甲型流感病毒h3n2，条带大小正确。

其中ha抗血清检测野生型和突变型甲型流感病毒所产生的条带浓度相似，可以推测野生型和突变型甲型流感病毒表
面的ha蛋白的免疫原性没有发生改变；而na抗血清检测出来的结果显示野生型与第119位单点突变型条带浓度相差不大且最浓，第222位单点突变型次之，双点突变型条带浓度最低，推测第119位氨基酸的突变并没有明显改变流感病毒表面na包膜蛋白的抗原表位，而第222位氨基酸可能是na的一个重要的抗原决定簇位置。

2.3 间接elisa法定量检测ha和na抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的免疫反应结果
间接elisa法定量检测结果显示，抗原最佳包被浓度为0.438 μg/孔（ha，1∶640稀释）和3.438 μg/孔（na，1∶160稀释），血清最佳稀释度为1∶40，以od450 nm≥0.30作为阳性临界值。

由表1可知，ha抗血清对于野生型和突变型甲型流感病毒ha都有很好的免疫反应性（od450 nm为15左右）；而na抗血清对野生型和第119位氨基酸单点突变型甲型流感病毒具有较好的免疫反应性
（od450 nm分别为7.378和5.644），对第222位氨基酸单点突变型和双点突变型都不具有好的免疫反应性（od450 nm分别为0.933和0.634），较野生型均显著降低（p从机理上分析，第222位氨基酸对于na抗原表位的形成起到重要作用的原因可能在于抗体多识别na亚基暴露在病毒最表面的区域，而该区域又邻近na活性区域，并与甲型流感病毒329-403氨基酸区域相对，该区域几乎包括了所有针对na的单克隆抗体的结合位点，因此在第198、199、220、221和222位氨基酸的突变能够有效降低抗体与该区域结合的能力
[18-20]。

由于第222位氨基酸在na激活区与第178位氨基酸w形
成了一个疏水核心，这个疏水核心位于唾液酸乙酰基群和甲基群中，正好是奥司他韦作用于na活性区域的位点，虽然第119位氨基酸的点突变不能明显改变na的抗原性质，但它与第222位氨基酸突变的结合，使na激活区空间发生了突破性改变，从而避免了与奥司他韦的结合，产生了对奥司他韦很显著的抗药性。

本试验将ha和na基因的3′端截去150 bp，但由于该区域并不是传统认为的主要抗原决定簇位置，故截去并不影响其抗原表位，但能够显著增加蛋白的表达量；进行免疫试验时，采用的是小鼠产生的中和抗体，由于不能真实模拟人体所产生的中和抗体，故本试验还有待将来采用人体所产生的中和抗体进行完善，使得结论更加有说服力；本试验未采用各种突变型的na所产生的抗血清来对野生型和突变型甲型流感病毒进行免疫学试验，故也存在一些缺陷，需要将来更进一步完善试验体系来得出更加准确的结论。

4 结论
本研究首次确定了甲型流感病毒h3n2的野毒株与耐药突变株的神经氨酸酶的抗原性质存在很大的差异，推测其中第222位氨基酸的突变是病毒迫于机体免疫压力，通过改变na抗原性质而产生的，而第119位氨基酸的突变是病毒迫于抗病毒药物的大量使用而产生的，以上两点的双突变，使得病毒不仅具有抗药物活性同时也具有逃逸机体所产生的抗体攻击的能力，该研究可为将来新一代甲型流感病毒h3n2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供重要参考。

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