一株兔出血症病毒的分离鉴定

2020年第11期兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD ）是一种病毒性传染病，临床主要表现为短潜伏期（24～48h ）、发病速度快、死亡率高、传播速度快，病理特征为呼吸系统主要是肺脏等器官出血、实质器官主要为肝脏水肿、淤血及出血。

目前已知的所有兔的品种和品系包括家兔和野兔均可感染此病毒。

在自然感染的条件下，
只有成
年家
兔发病，2月龄以下的幼兔一般不发病。

本文用目前已经建立起的多种诊断方法分离鉴定了一株兔出血症病毒，为该病毒的生物学特性研究、疫苗制备、特异性诊断制剂的研究等工作打下了良好的基础。

1材料与方法
2019年9～10月份锦州某长毛兔场发病兔，临床表现为：精神萎顿，食欲废绝，突然倒地死亡，死前神经症状
轻微，病程持续时间在10h 内，死亡率90%。

为排除细菌感染，应用相关抗生素治疗无效。

对死亡兔进行剖检：可见肺出血、充血严重，肝脏淤血。

在无菌条件下，主要采集肺脏、肝脏等器官进行检验。

红细胞（O 型）
，兔出血症高免血清(由
吉林大学畜牧兽医学院保存提供)，健康成年家兔(重1.5～2.0kg ，RHDV 抗体阴性，无大肠杆菌病、巴氏杆菌病等发病史，为本校实验动物中心饲养)。

Ex
Taq 、Marker DL2000等购自
大连TaKaRa 公司，Agarose 购自Oxoid 公司。

分别在麦康凯、血琼脂平板、血清培养基上接种采集的病料，37℃（有
氧和无氧），培养24
～48h ，观察结果。

将采集的肝组织剪碎，与生理盐水按照1:4混合制成悬液，冻融3次，10000r ／min 离心10min ，过滤取上清，-20℃备存。

以皮下接种的方法将处理好的病料接种经RHDV 抗体检测为阴性的成年易感家兔8只，2mL/只，同时设立阴性对照组（接种生理盐水），观察
两组兔发病情况。

待实验组兔发病死亡后取其肝脏进行主要细菌的分离培养鉴定。

阴性者同本实验1.4方法处理肝脏，继续传代2次，取第4代死亡的兔肝脏（处理方法同1.4）鉴定。

1.6.1HA-HI 试验
HA 、HI 试验参考文献进行。

1.6.2
琼脂扩散（AGP ）试验
按常规方法进行。

将琼脂糖配
制成1%，融化制平板，打孔（梅花形），将待检抗原（1.5中处理病料）加入中间孔中，不同浓度的抗病毒血清加入外周孔，置湿盒中37℃，24h 后观察结果1.6.3电镜检测取冻存的待检材料,按照文献2的方法将病毒进行纯化，用2%磷钨酸负染，电镜观察。

1.6.4
RT-PCR
鉴定：参考GenBank 中登录的RHDV 全序
列，设计一对引物：P1：5’-tgaatctagaggagggcaaaacccgcac3’，P2：5’-cggcaagcttattcagacataagaaaag 3’预扩增长度为1740bp 片段,本实验1.5步骤中家兔
发病死亡后取其肝脏，按常规RT-PCR 程序进行扩增，PCR 反应条件如下：94℃预变性5min ；94℃30s ，60℃40s ，72℃1min ，25个循环；72℃
延伸10min 。

2结
果
分别在麦康凯、血琼脂平板、血清培养基上接种采集的病料，37℃（有氧和无氧），培养24～48h ，平板上均无细菌生长。

实验组8只家兔接种病料后在48h 后全部发病死亡，临床症状与兔出血症症状高度一致：表现
为挣扎，鸣叫，鼻孔有泡沫状血
液等。

病理变化为：气管、肺脏出血，肝脏淤血、肾脏肿大。

病毒传4代，实验兔的临床表现，发病死亡时间及其病理变化均表现出一致性；对照组家兔健康无异常。

一株兔出血症病毒的分离鉴定
林宇晗，杨欣华，罗郁佳，隋
慧★
（锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州
121001）
摘
要：本文通过病料采集和处理，排除细菌感染、进行动物攻毒试验与病毒传代，自锦州市某兔场发病死亡动物肝
脏组织样品中分离病原并通过血凝-血凝抑制（HA-HI ）试验、琼脂扩散试验、电镜检测、RT-PCR 方法鉴定为兔出血症病毒（RHDV ）。

结果表明，将该病毒连续4代接种兔体，实验兔所表现出的临床症状和病理变化与兔出血症均一致，这将为兔出血症流行病学调查、新型重组疫苗与诊断试剂的研制奠定基础。

关键词：兔出血症病毒；分离；鉴定；VP60DOI:10.3969/J.ISSN .1671-6027.2020.11.035基金项目：本项目为锦州医科大学大学生创新训练项目项目名称：兔出血症病毒衣壳蛋白基因的表达及免疫原性研究（项目编号：20190008）
作者简介：林宇晗（1997～），福建省莆田人，本科在读。

★通信作者
试验研究
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2020年第11期
通过HA-HI 试验发现，该待检样品可以凝集人O 型血
红细胞，并且该凝集作用
可以被RHDV 高免血清所抑制，其HA 和HI 效价分别为1：640和1：40。

琼脂扩散试验
待检抗原和不同浓
度血清均出现
明显沉淀线，以RHDV 阳性血清稀释倍数为1：5时沉淀线最清晰。

电镜下可以看到球形病毒粒子，直径约为40nm ，见图1。

图1电子显微镜（80000×）
病料经RT-PCR 方法扩增后，在1740bp 处出现一条反应条带，符合预期结果，见图2。

3讨论
兔出血症发病率高，死亡率高，在世界许多国家都有发生，是危害养兔业健康发展的重要疾病之一。

2月龄以下幼兔不易感染该病毒。

由于疫苗的广泛接种，使得该病控制较好。

但也有个别兔场在免疫预防方面出现漏洞，在我国该病仍然存在散发，危害我国养兔业健康发展。

RHDV 自发现到目前为止，人工培养的情况下仍然未发现能够使其稳定传代的细胞系，在鸡胚上同样不能生长，因此实验动物仍然是分离该病毒的主要方法。

本实验采集锦州某兔场发病兔肝脏，经过处理后接种健康成年家兔，家兔表现为精神萎顿,呼吸加快,死前出现哀鸣、兴奋、挣扎等神经症状，病变主要表现为气管、肺脏出血，肝脏淤血、肾脏肿大；本次兔场发病兔及实验兔接种病料后所表现出来的临床症
状和病理变化和兔出血症非常符合，初步判断为RHD ，但是确诊还需要进行实验室检查。

RHDV 具有血凝性，可以在实验室中用人的O 型血红细胞进行凝集-凝集抑制试验(HA-HI ）来鉴定。

本实验采用人的O 型红细胞对采集样品进行HA 和HI 试验，测得其HA 和HI 效价分别为1：640和1：40，可初步判断该样品液中含有RHDV,且效价高，因此初步推断RHDV 是导致该兔场兔死亡的原因。

有人认为在人的不同血型红细胞中，RHDV 对Ο型最敏感，血凝价最高，而且对不同人的同型红细胞的敏感性有时也存在差异，但也有学者认为其对人各型红细胞的敏感性一致。

申之义等在相同条件下用Ο、B 型血红细胞进行了对比试验，结果表明分离毒株对人O 、B 型血红细胞的敏感性基本相同，与有关文献报道一致。

也有人认为传统的人Ο型红细胞的血凝抑制试验测RHDV 抗体的方法存在主观性强、重复性差和人血红细胞获取不易等缺点。

RHDV 的鉴定也可以采电镜方法。

本实验通过电镜观察到了40nm 左右的病毒粒子，球形，无囊膜，符合兔出血症病毒的特征。

电
镜检测方法具有较高的敏感性和特异性，但是在基层推广和应用尚难。

逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法是检测RHDV 较为简单易行的方法，可重复性强，且敏感性和特异性好。

Shien 等用RT-PCR 检测RHDV 的核酸，Ros Bascunana 等建立了一种RT-PCR 方法，可以区别RHDV 和欧洲野兔综合征病毒（European Brown Hare Syndrome Virus ，EBHSV ），还可以对新鲜程度不同（新鲜、石蜡包埋或福尔马林固定）的样品进行检测，为RHDV 的溯源和流行病学调查提供了有利的工具。

胡迎东等2006年利用RT-PCR 法建立了准确、灵敏、快速的RHDV 检测技术，扩增VP60基因133～520bp 的片段。

刘怀然、严维巍、向华等都克隆了RHDV 的VP60基因。

本文采集疑似RHD 死亡兔的肝脏病料，用RT-PCR 方法成功扩增出约1.8kb 的片段，与RHDV 的VP60基因片段大小一致。

该病毒株的分离为其生物学特性研究、疫苗制备、特异性诊断制剂的研究等工作打下了良好的基础。

参考文献
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达[J].中国畜牧兽医，2018，45(12)：3545-3554.
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图2RT-PCR 扩增产物的电泳分析
注：1M.DL 2000DNA ladder
2、3RT-PCR
试验研究
49。