基因修饰的DC疫苗在肿瘤治疗中的作用

基因修饰的DC疫苗在肿瘤治疗中的作用
崔晶;孙青
【摘要】树突状细胞( dendritic cells,DCs)是唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞( antigen presenting cell,APC),也是目前发现的功能最强大的APC,在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用.基因修饰的DC疫苗更由于其出众的优势已成为肿瘤免疫治疗的焦点之一.
【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》
【年(卷),期】2012(004)002
【总页数】6页(P120-125)
【关键词】肿瘤;疫苗;树突状细胞;基因修饰
【作者】崔晶;孙青
【作者单位】山东省千佛山医院病理科,山东,济南 250014;山东省千佛山医院病理科,山东,济南 250014
【正文语种】中文
树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），也是唯一能激活初始型T细胞的APC。

DC 通过摄取肿瘤抗原，发育成熟后在膜上高表达MHCⅠ、Ⅱ类分子，并递呈大量的肿瘤抗原给T细胞受体（T cell receptor，TCR）。

同时，DC提高协同刺激分子B7-1、B7-2和CD40等的表达，并激活T细胞。

而且DC与T细胞结合后分泌大量IL-12，IL-12可强烈诱导T细胞、NK细胞、LAK细胞产生大量TNF-γ、穿孔
素和颗粒酶，增强CTL细胞和NK细胞对靶细胞的溶解作用。

DC在激活T细胞介导的免疫应答中具有重要作用。

近年来，随着DC疫苗抗肿瘤应用研究的开展，DC疫苗已经成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。

目前DC疫苗的类型主要有肿瘤全细胞抗原致敏的DC疫苗、肿瘤抗原多肽致敏的DC疫苗和基因修饰的DC疫苗等。

相比前两类DC疫苗，基因修饰的DC疫苗具
有较多优势，因而引起了越来越多学者的关注。

尽管近年来有十几个癌症DC疫苗处于临床Ш期研究阶段，但许多疫苗没有获得有临床意义的结果。

2010年4月
美国食品药品监督管理局批准Sipuleucel-T疫苗（ProvengeTM）用于治疗晚期
前列腺癌患者，这种疫苗通过分离患者的DC细胞，经前列腺特异抗原—前列腺
特异酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）和GM-CSF融合蛋白处理，再将处理过的激活DC细胞送入患者体内，通过激活T细胞杀死表达PAP的
肿瘤细胞。

此疫苗的批准极大地激励DC疫苗的进一步开发，也表明基因修饰的DC疫苗具有广阔的应用前景。

基因修饰的DC疫苗包括两大类：一类是转染表达TA或抗原的mRNA；另一类
是转染编码免疫刺激分子、细胞因子、趋化因子、抗凋亡因子或其它增强DC细胞功能和寿命的因子。

基因修饰的DC疫苗具有许多优点：①不需要明确个体的MHC分子和抗原位点。

基因修饰的DC疫苗能够表达全蛋白序列，且已包含了所有的抗原位点，因此DC疫苗提供的细胞间抗原递呈比单纯的外源性抗原刺激更为有效。

②基因转染后可以长期表达抗原和细胞因子或共刺激分子，增强了DC细胞抗原递呈的能力，促进T细胞的激活[1]。

③利用病毒载体进行外源性抗原表达，
可以促进DC细胞的成熟和活化，增强免疫反应[2，3]。

④由于不含有正常人体抗原，所以这种疫苗引起的自身免疫反应或免疫耐受较轻[4]。

⑤基因修饰还可以帮
助DC细胞对抗肿瘤对其的抑制，延长自身寿命和促进T细胞、NK细胞的活化[5]。

许多动物模型研究显示，基因修饰的DC疫苗能够激发体液免疫和细胞免疫，抑制
肿瘤生长。

在鼠前列腺癌模型中，由编码Bcl-XL的腺病毒修饰DC，发现其延长
了DC细胞在肿瘤微环境中的生存时间，在没表达任何肿瘤抗原的情况下也能诱导抗肿瘤免疫，抑制肿瘤的进展[6]。

Balkir等[7]的实验证明，转染抗凋亡分子FLIP、XIAP/hILP、HSP-70能抑制黑色素瘤诱导的DC细胞的凋亡，从而延长DC的生
存时间。

用编码IL-12的腺病毒修饰DC，当把它接种到鼠CT26结肠癌肿瘤模型后，能使已有肿瘤消失[8]。

Komita等[9]将编码IL-12的腺病毒转入DC细胞，
瘤内注射这种DC疫苗，能抑制已有的B16肿瘤，治疗效果与抗B16的CD8+T
交叉反应的增强有关。

另一项实验局部注射经IL-12修饰的DC，发现其抑制了鼠MC38结肠癌模型肿瘤的进展[10]。

越来越多证据显示，基因修饰的DC疫苗不仅能够改善其在肿瘤微环境的寿命和功能，更能增强其抗肿瘤免疫反应。

部分实验利用正常人和癌症病人的DC细胞进行基因修饰研制疫苗。

Ojima等[1]
将CEA和GMCSF共转染入供体骨髓来源的DC疫苗诱导CEA特异性的CTL。

Geiger等[11]利用来源于高度免疫原性的肾细胞癌细胞RCC-26的RNA作为TA 修饰DC疫苗，接种于肾细胞癌病人，其通过有效激活效应记忆细胞毒T淋巴细
胞反应，特异性杀伤肾癌细胞。

临床前研究资料显示，许多基因修饰的DC疫苗有进行临床实验的价值，许多临床试验也已经开展。

一个涉及13个转移性前列腺癌病人的Ⅰ期临床试验中，在接种了转染PSA mRNA的DC疫苗后，13人均未显示有剂量依赖的毒性和自体免疫
的副作用，且均检测到PSA特异性的T细胞反应[12]。

检测了7个病人的血清PSA曲线，有6人的免疫效果与该曲线的对数斜率的下降相关，其中3人表现出
短暂的血循环肿瘤细胞的分子清除。

Morse等[13]报道了一个关于CEA阳性的进展期恶性肿瘤患者的临床Ⅰ期实验，随后又在结肠癌患者中进行了临床Ⅱ期实验。

转染了由编码CEA的mRNA修饰的自体DC细胞的患者表现出良好的耐受性。

在24个临床I期患者中，1人表现出肿瘤标志物的完全反应，2人轻度反应，3人病
情稳定。

在临床Ⅱ期实验中，13个结肠癌肝转移的病人接受DC疫苗接种后，有
9人的中位复发天数是122天，疫苗注射部位的活检和外周血检测结果显示存在
免疫反应。

但由于实验缺乏对照，有无统计学意义尚不明确。

hTERT在大多数肿瘤中表达，而在正常细胞中不表达，是理想的肿瘤免疫靶抗原。

Cui等[14]利用慢病毒载体将hTERT转入DC细胞，发现其能产生hTERT特异性
的CTL反应。

Su等[15]将携带了编码hTERT或LAMP-hTERT融合蛋白的自体
DC接种到20个转移性前列腺癌患者中，9个病人表现出hTERT特异性的CD8+和CD4+T细胞反应。

加强免疫后，在皮下注射部位发现hTERT特异性T细胞。

19个病人的外周血中检测到hTERT特异性的CD8+T细胞反应。

在接种编码LAMP-hTERT融合蛋白的DC后，所诱导的hTERT特异性的CD4+T细胞反应进一步增强，这提示其促进了CD4+的CTL反应。

在接种DC疫苗后，12个病人中有5人出现短暂的PSA水平下降，10个病人中有9人表现出循环肿瘤细胞的分子清除。

Mazzolini等[16]在17个转移性胃肠道癌病人的瘤内注射了由编码IL-12
的重组腺病毒修饰的DC细胞，对其中15个病人进行了毒性评价，11个病人进
行了临床和免疫反应评价，结果显示疫苗治疗有良好的耐受性。

15个病人的血清IFN-γ和IL-6浓度升高，5个病人外周血NK细胞活性增加，且可以观察到腺病毒包膜蛋白免疫反应，11个肿瘤活检病例中的3个有明显的CD8+T淋巴细胞浸润。

Antonia等[17]观察了p53基因修饰的DC疫苗联合化疗在进展期肺癌患者中的
治疗效果，DC疫苗由编码野生型p53全长序列的腺病毒载体修饰后接种到29个病人中。

57%的病人观察到p53特异性T细胞数量的增加，1个病人对免疫有部
分反应，7个病人病情稳定。

在以上的研究中，DC疫苗都是安全的并且有良好耐受。

研究者们进行了很多DC疫苗实验，对不同来源的DC细胞、不同的抗原或肿瘤细胞裂解物或基因修饰、不同的佐剂和载体等各个方面进行了探讨[18～21]。

如今
世界范围内已经进行了300个DC疫苗的临床试验，涉及3000多个患者[18]，其中至少有396个不同的癌症病人应用了基因修饰的DC疫苗的治疗，包括74个进展期恶性黑色素瘤病人和72个前列腺癌病人，并检测了272个病人的肿瘤特异性CD8+T细胞反应。

在201个受检病人（74%）中检测到了CD8+T细胞数量和/
或活性的升高，在24个受检病人（7.5%）中检测到基因修饰的DC疫苗诱发免疫反应，生存时间与之前的病例相比得到了提高，36个病人（10.8%）的病情稳定。

但因这些研究没有随机配对，这些发现的意义尚不明确。

48个病人（14.4%）表
现出肿瘤生化指标或肿瘤生长速度的改善，包括PSA斜率的下降及血清CEA水平的下降。

实际上，58个接受DC疫苗接种的前列腺癌病人中，有37病人的PSA
水平发生了改变。

在讨论这些实验结果时，必须注意到因为没有采用一致的反应标准，不同的研究者所做的结果可比性较低，而且所提供的信息不充足。

另外一个难题是接种DC疫苗后虽然在体外实验中能够刺激T细胞产生免疫刺激
因子和杀伤肿瘤细胞，但在体内实验中并不导致癌的抑制。

造成这种体内外实验结果不一致的可能原因有：①临床实验免疫检测缺乏统一的标准[22]；②临床结果的低阳性率不足以观察到免疫反应和临床反应之间的相关性；③实验中常常采用外周血分析观察免疫效果，而实际上目前并没有令人信服的证据说明外周血免疫反应能代表肿瘤部位的免疫反应；④CTL的效用活性仅能维持一个相对短的时间，然后
快速转入记忆阶段，虽仍能识别靶细胞，但已经丧失效用活性[23]；⑤单个指标不足以反映复杂的CTL和肿瘤细胞之间的反应，而且缺乏充分的T细胞标志物来评
价效果，单纯分析效应T细胞反应不能完全代表疫苗的成败以及它的免疫潜能。

研究者还试验了许多方法来增强基因修饰的DC疫苗的抗肿瘤活性和改善机体反应，包括共转染免疫调节因子以增强抗原递呈和抗肿瘤效应细胞的活化[24]及进行基因修饰以促进DC细胞的成熟和延长DC细胞的寿命等。

另外还有其它途径增强DC 疫苗的活性。

4.1 阻断在肿瘤微环境中抑制免疫反应的负性调节因子
不仅是在肿瘤部位出现的免疫调节细胞，淋巴结的一些细胞［包括髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）和调节性T细胞（Treg cells）］也能阻断DC的免疫刺激能力。

大量的研究显示，外周血和肿瘤微环境中Treg细胞数量的升高常提示更差的预后。

去除这些细胞的方法包括淋巴清除后化疗、利用单克隆抗体或免疫毒性剂去除Treg细胞等。

Dannull等[25]的研究结果显示，重组IL-2和白喉毒素A段、B段—地尼白介素［denileukin dif i tox （OntakTM）］清除了CD4+CD25+Treg细胞，增强了肿瘤RNA转染的DC疫苗的免疫刺激活性。

地尼白介素治疗后给予由RNA修饰的DC疫苗，相比单纯免疫治疗，更能促进RCC患者肿瘤特异性T细胞反应。

小鼠动物实验显示，环磷酰胺和氟达拉滨联合治疗能造成淋巴细胞减少的状态，然后再给予过继幼稚T细胞和由肽段修饰的DC疫苗，能增加CD8+T细胞的细胞毒活性，并导致明显的肿瘤抑制和荷瘤小鼠生存率的提高[26]。

阻断肿瘤相关免疫抑制因子是另一条改善DC功能的可能途径。

肿瘤细胞为间质细胞围绕，肿瘤微环境中还有许多可溶性细胞因子，包括VEGF、TGF-β、IL-10、IL-13、IDO、iNOS、PGE2和ARG1，它们能够抑制NK细胞、T细胞、巨噬细胞和DC细胞的功能。

利用单克隆抗体、可溶性受体、阻断剂或抑制剂对抗这些免疫抑制因子则能增强抗肿瘤DC疫苗的效用。

注射贝伐单抗，一种人VEGF单克隆抗体，改善了转移性结肠、肾、脑、肺和乳腺恶性肿瘤的治疗效果[27]，并同时导致外周血不成熟DC细胞数量的下降及DC亚群的比例轻度升高。

TGF-β能够调节细胞生长和分化，抑制DC的成熟和抗原递呈，肿瘤细胞、间质细胞及肿瘤浸润的免疫细胞均可以分泌TGF-β。

研究者采取措施抑制TGF-β的功能，包括单克隆抗体、可溶性受体和DC表达竞争抑制作用的TGF-β受体，以此增强DC疫苗的作用[28]。

其它增强DC疫苗活性的措施有阻断CTLA-4（Tregs和效应T细胞分泌的一种免疫衰减跨膜蛋白）、PD-1及其配体B7-H1（PD-L）。

给予恶性黑色素瘤病人CTLA4的单克隆抗体—易普利姆玛（Ipilimumab）后再接受一种肽段疫苗，可以观察到明显的肿瘤抑制和生存改善[29]。

在大鼠上阻断PD-1或其配体PD-L能增强疫苗的免疫治疗效果[30]。

4.2 改进DC与NK细胞之间的相互作用
TA特异性的CTL细胞和NK细胞的联合作用对清除MHC I类分子阳性和阴性的
肿瘤细胞非常重要。

在许多临床前期研究中，由MART-1抗原修饰的DC疫苗能
够诱导抗原特异性的CTL。

抗鼠B16黑色素瘤的免疫反应依赖于功能性NK细胞
的出现，尽管NK细胞本身并不能产生保护性免疫反应[31]。

Viaud等[32]在老鼠体内检测到NK细胞表面有Dex生物活性，Dex促进NK细胞介导的IL-15Ra- 和NKG2D-依赖的抗转移效应。

在人体，具有Dex表达功能性的IL-15Ra能促进
NK细胞的增殖和IFN-g的分泌。

一项涉及14个病人的临床I期试验的结果显示，7个病人在接种由Dex修饰的DC疫苗后保存了NK细胞的数量和NKG2D依赖
的NK细胞功能的活化。

体外实验也证明，转染了MART-1、IL-12和IL-18的
DC疫苗能够增加NK细胞的数量及增强TA特异性的CTL活性[33]。

在另一个临
床I期实验中，分析9个病人在接种由CEA修饰的DC疫苗后的NK细胞反应，
其中4个病人的NK细胞毒活性增加，且其中的3个病人的NK细胞比率有所上升。

有趣的是，与T细胞反应比较，NK细胞反应与临床结果更为相关[34]。

给转移性胃肠道癌的病人皮下接种由编码IL-12的重组腺病毒修饰的DC疫苗，也发现其能激活NK细胞[35]。

4.3 DC疫苗与其它治疗方法如手术、放疗及化疗的联合应用Hirschowitzdeng等[36]为行肺切除术的病人接种了肿瘤凋亡产物致敏的DC疫苗，使6/7的病人产生了免疫反应，与未接受手术的病人相比，有25%以上的增
长，这表明手术增强了DC疫苗的免疫反应。

将手术、DC免疫与辅助性化疗或放疗联合应用，在所有的病人中都可以观察到免疫反应。

Chi等[37]的研究结果显示，化疗的临床反应与DC疫苗的免疫反应密切相关；联合放疗和皮下DC注射能够促进抗原递呈及增强肿瘤特异性免疫反应，其中有6个患者NK细胞的杀伤活性显
著增加。

尽管DC疫苗的研究已经取得了令人瞩目的成绩，但是要使更多的DC疫苗应用于临床尚面临诸多挑战，例如如何建立评价DC疫苗特异性免疫效果的指标，如何规范制备流程，怎样做到疫苗的质控以及DC疫苗注射剂量、途径、时间的优化等。

相信随着对肿瘤免疫机制的不断深入研究和分子生物学技术的日益发展，在逐步解决上述问题后，基因修饰的DC疫苗疗法必将成为恶性肿瘤治疗的重要策略之一，并给更多恶性肿瘤患者带来新的希望。

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