p53基因249编码子突变对p53功能的影响

p53基因249编码子突变对p53功能的影响
吴智群;李庆霞;李臻;于翠娟;罗亚宁;胡静;王红
【摘要】背景与目的:研究p53基因249编码子突变对p53基因功能的影响.材料与方法:利用基因打靶技术在小鼠胚胎干细胞(KS)p53基因249编码子中引入点突变,使编码子249由精氨酸(Arg)变成丝氨酸(Ser),然后将含突变的Es细胞显微注射到Hpn-/-小鼠囊胚中,将注射过的囊胚植入假孕的雌性小鼠子宫,到第14 d取小鼠胚胎纤维母细胞(EF),用含HAT的培养液筛选出从ES细胞分化而成的鼠EF细胞,经测序证实细胞含有由249 Arg到Ser的突变.用不同剂量的电离辐射(IR)或紫外光(UV)分别照射ES或EF细胞,然后利用流式细胞仪检测该突变对小鼠ES细胞周期及对ES和EF细胞凋亡的影响,并利用Western blot检测相关蛋白的表达.结果:用IR处理ES细胞后,含p53基因249编码子突变的Es细胞对IR诱导的G1Go细胞周期阻滞作用减弱(P<0.05).用IR或UV处理ES和EF细胞后,含p53基因249编码子突变的ES及EF细胞凋亡百分数较含野生型p53者明显减少(P<0.05).含p53基因249编码子突变的ES及EF细胞p53的表达与含野生型p53者差别不明显(P>0.05);但其bax和p21的表达,较含野生型p53的细胞表达减少(P<0.05).结论:p53基因249编码子突变可减弱p53在细胞周期阻滞和凋亡中的作用,但对
p53的表达无明显影响.
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2009(021)002
【总页数】4页(P119-122)
【关键词】肝癌;发病机制;p53基因;突变
【作者】吴智群;李庆霞;李臻;于翠娟;罗亚宁;胡静;王红
【作者单位】第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院介入科,陕西,西安,710038
【正文语种】中文
【中图分类】Q343.1+3
肝癌的发病率及死亡率在我国均居前列，研究发现肝癌发病与乙肝病毒(HBV)和黄曲霉素(AFB1)密切相关，流行病学资料表明肝癌诱发因素HBV和AFB1可通过作用于p53基因，使其249编码子突变而致肝细胞癌变[1-3]，Guimaraes等[4]推测p53基因249编码子突变对p53基因结构和功能的影响有关，但具体机制尚不完全清楚。

据此，我们利用基因打靶技术在p53中引入249精氨酸(Arg)到丝氨酸(Ser)突变，研究在胚胎干细胞(ES)及胚胎纤维母细胞(embryonic fibroblast，EF)中该突变对p53结构和功能的影响。

1.1 主要材料和试剂鼠ES细胞由美国加州大学圣地亚哥分校分子生物学实验室XU YANG教授馈赠。

ES细胞用DMEM培养液加15%的胎牛血清，谷氨酰胺，非必需氨基酸，抗菌素，100μmol/L mecaptoethanol和重组淋巴细胞抑制因子(LIF)进行培养。

p53-Ab1鼠抗人单抗、bax Ab-7兔抗人多抗均购于NeoMarkers；p21鼠抗人单抗购于BD PharMingen。

1.2 含p53 249突变的ES细胞的建立[5]以P48-11质粒为模板(由美国加州大学圣地亚哥分校XU YANG教授构建并馈赠，结构见图1，其中含有野生型P53，
249编码子位于C+2片段)，用PCR方法在小鼠p53 249编码子中引入点突变，使编码子249由Arg变成Ser。

PCR引物为：
P1′gttggctctgactgtaccacc;P2′ggcatgaac cggagtcccatcctc，(野生型p53 249 Arg的编码子为agg，突变变成Ser后的编码子为
agt)P3′gaggatgggactccggttcatgcc;P4′gtcgcttagtgctccctggggg。

PCR定点突变反应体系为50μl，其中含无菌去离子水39μl，10×Pfu Buffer 5μl，20μmol/L P1、P2、P3、P4引物各1μl。

P48-11质粒1μl(约100 ng)，Pfu DNA聚合酶
lμl(5 U)。

反应条件为：94℃预变性3 min；然后94℃变性1 min。

65℃30 s，72℃延伸1 min，25个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

提纯PCR产物，经测序证实(测序用的引物为P1或P4)，编码子已经从agg变成agt后，再将该
产物片段酶切后放回质粒，将含有突变的质粒约1μg(线性化)和1×105个ES细胞(0.6 ml PBS中)共同加入型号为0.4的电转染杯中电转染ES细胞(利用Bio RAD Gene Pulser II System Cat No.165-2110电转染仪)，将转染后的ES细胞在含有G418的培养液中培养，每天换液1次，直至有细胞克隆生长，然后挑选克隆，分别进行培养，部分提取基因组DNA，根据同源重组规律，采用PCR方法进行测序，确定该ES细胞的p53 249编码子已经由Arg变成Ser，该ES细胞即为带有p53 249突变的阳性ES细胞，可用于研究或显微注射(见图1、图2)。

1.3 含p53 249突变的EF细胞的建立[5]将含突变的而不含筛选标记的ES细胞微注射到从Hprt-/-小鼠收集的囊胚中，将注射过的囊胚植入假孕的雌性小鼠子宫，等小鼠怀孕到第14 d，取小鼠胚胎置于无菌培养皿中，去掉头部和肝脏，用无菌
剪刀剪碎剩余组织，用胰蛋白酶在37℃5%CO2孵箱中消化15 min，即可得到单个EF细胞，离心，PBS洗涤细胞，用含HAT的培养液[DMEM含(10%FCS，
0.584 mg/ml glutamine，1×105U/L antibiotics，50 mmol/L mecaptoethanol)和HAT (0.016 mg/ml hypoxanthine，0.01 mmol/L
aminopterin，0.004 8 mg/ml thymithymidine)]进行筛选，因为来自Hprt-/-
鼠囊胚的EF细胞在含HAT的培养液中不能存活，因此经过3～5 d培养后可以得到从ES细胞分化而来的鼠胚胎纤维母细胞(EF)细胞，经测序证实该细胞含有249 Arg到Ser的突变后用于研究。

1.4 细胞凋亡检测处理组ES细胞用
2.5、5、10、20 Gy的电离辐射(ionizing radiation，IR)进行照射，照射后培养10 h，收集对照组和处理组细胞；处理组
EF细胞用60 J/m2的UV光进行照射，照射后培养16 h，收集对照组和处理组细胞。

分别离心，PBS洗2次，用Annexin V缓冲液重悬细胞，取3×105个细胞
加入5μl Annexin V-FITC(Pharmingen)混匀，室温避光孵育10 min。

离心，弃
上清，用190μl Annexin V缓冲液重悬细胞，加入20μg/ml PI 10μl，用流式细
胞仪检测。

1.5 细胞周期分析[6]取对数生长期的细胞，以无血清的DMEM培养24 h同步后，分对照组和实验组，用20 Gy的IR照射ES细胞，照射后继续培养18 h后收集各组细胞，以PBS洗涤，用70%的冷乙醇在4℃固定24 h以上，用50μg/ml的碘化丙啶(PI)染色后，流式细胞仪(FACSsort，BD公司)分析细胞周期。

1.6 Western blot检测p53，p21，bax蛋白的表达
用三去污试剂(50 mmol/L Tris.Cl，pH8.0;150 mmol/L NaCl;0.02%叠氮
钠;0.1%SDS;100μg/ml PMSF; 1μg/L Aprotinin;1%NP-40;0.5%去氧胆酸钠)提
取总蛋白，用Bradford方法测定蛋白质浓度。

等量蛋白质分别采用8%(p53)，15%(p21，bax)SDS-PAGE垂直凝胶电泳进行分离，然后转至PVDF膜上，5%
脱脂奶粉室温下摇动封闭后，加入抗p53、p21、bax抗体，4℃过夜，室温下洗
膜后加入二抗，用ECL PLUS(Amersham)进行发光显影。

1.7 统计学方法所有实验均重复3次以上，数据使用SPSS16.0软件，以x -±s的形式表示，用t检验分析，α=0.05为检验水准。

2.1 p53 249编码子突变对ES细胞周期的影响
含p53 249编码子突变的ES细胞对IR诱导的G1/G0和S期细胞周期阻滞作用
减弱，分别与含野生型p53的细胞相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05，见表
1)。

2.2 p53 249编码子突变对ES和EF细胞凋亡的影响IR或UV处理ES和EF细胞后，含p53 249编码子突变的ES和EF细胞凋亡百分数，较含野生型p53的细胞明显减少(P＜0.05)，见表2、图3。

2.3 p53 249编码子突变对EF细胞p53、bax和p21表达的影响UV处理细胞后，含p53 249编码子突变的EF细胞p53的表达，与含野生型p53 EF细胞的差别不明显(图4A)，但含p53 249编码子突变的EF细胞bax和p21的表达，较含野生型p53的EF细胞减少(图4B和4C)。

p53是体内重要的抑癌基因，也是目前研究最为广泛的抑癌基因，被誉为基因组
的“保护神”，或者叫“分子警察”。

当机体遇到各种可以引起DNA损伤的因素作用时，p53被激活，其活性和蛋白水平迅速提高。

同时p53聚积阻止细胞增殖[7]，启动并参与DNA修复[8]，若修复失败则通过细胞内外两条途径启动细胞凋
亡机制使细胞凋亡[9]，阻止损伤传递给子代细胞，从而保持基因组的稳定性。

既
往研究也已经证实：几乎所有人类癌组织中都存在着p53的异常，错义突变累及
p53 200多个编码子。

这些突变主要位于p53基因的中心部位——DNA结合域，且有些突变具有肿瘤特异性。

流行病学研究发现p53基因249突变为肝细胞肝癌(HCC)特有，在肝癌发病中起
关键作用[1-3]。

但目前的研究均未能直接揭示该突变与肝癌发病的关系和机制。

为此我们利用knock-in技术在小鼠p53基因中直接引入Arg到Ser的突变，以
研究该突变是否会改变p53的功能，结果证实p53 249编码子发生突变后，不论是在ES还是在EF细胞水平，p53的功能均发生了显著改变。

我们前期的研究已
经证实使用IR或UV处理含野生型p53的ES/EF细胞后，细胞均会发生细胞凋亡和细胞周期阻滞，而且这种作用是通过增加p53的表达及p53下游细胞凋亡、细胞周期相关基因的表达而起作用的[5，10]。

但是当我们在p53中引入249突变后，IR或UV对ES/EF细胞的凋亡诱导和细胞周期阻滞作用明显减弱(参见表1、2，
图3)，提示该突变损伤了p53的抑癌功能，蛋白印迹结果也证实p53 249突变后，p53下游细胞凋亡蛋白bax、细胞周期相关基因p21的表达减低。

其结果是当细
胞受到致癌因素打击后肝细胞会持续增殖而并不能发生细胞凋亡，或细胞周期发生阻滞后启动DNA修复功能，进而发生癌变，这与Beerheide等[11]的研究结果一致。

249突变损伤p53的机制可能与p53 249突变位于p53 DNA结合域有关，249突变后可能直接影响p53作为转录因子调控其下游肿瘤相关基因的功能，
p53功能的丧失使细胞不受细胞周期G1/S限制点的控制而持续增殖，这可能是其在肝癌发生发展中起作用的重要机制之一。

我们将利用免疫共沉淀等分子生物学方法进一步揭示该突变影响p53功能的机制。

然而我们的研究显示249编码子的突变并没有影响p53蛋白的表达，提示249突变对p53的影响是发生在转录水平。

综上所述，我们的研究证实p53基因249突变会对p53的抑癌功能产生影响，减弱其对基因组的保护功能，在肝癌的发生发展中起着非常重要的作用。

【相关文献】
[1]Nita ME，Alves VA，Carrilho FJ，etal.Molecularaspectsofhepatic carcinogenesis[J].Rev InstMed Trop Sao Paulo，44(1):39-48.
[2]Maryann ES，Sophie SC，Elisabeth AB，et al.The chemistry and biology aflatoxin
B1:from mutational spectrometry to carcinogenesis[J].Carcinogenesis，2001，22(4):535-545.
[3]Wong N，Lai P，Pang E，et al.Genomic aberrations in human hepatocellular carcinomas of differing etiologies[J].Clin Cancer Res，2000，6(10):4000-4009.
[4]Guimaraes DP，Hainaut P.TP53:a key gene in Human Cancer[J].Biochimie，2002，
84(1):83-93.
[5]Zhiqun W，John E，Shin chi S，et al.Mutation of mouse p53 Ser23 and the response to DNA damage[J].Mol Cell Bio，2002，22(8)：2441-2449.
[6]邓金牛，李春蕊，刘文励，等.去乙酰化酶抑制剂诱导白血病细胞凋亡过程中Daxx的表达变化[J].中华血液学杂志，2004，25(5)：312-313.
[7]Katarzyna S，Pierre H.P53 and mutation in human cancer [J].Acta Biochimica Polonica，2003，50(1):231-238.
[8]Zhan Q.Gadd45a，a p53-and BRCA1-regulated stress protein，in cellular response to DNA damage[J].Mutat Res，2005，569(1/2):133-143.
[9]Attardi LD.The role of p53-mediated apoptosis as a crucial anti-tumor response to genomic instability:lessons from mouse models[J].Mutat Res.2005，569(1/2):145-157. [10]Connie C，Zhiqun W，Sharlyn JM，et al.Acetylation of mouse p53 at lysine 317 negatively regulates p53 apoptotic activities after DNA damage[J].Mol Cell Bio，2006，
26(18)：6859-6869.
[11]Beerheide W，Tan YJ，Teng E，et al.Downregulation of proapoptotic proteins Bax
and Bcl-X(S)in p53 overexpressing hepatocellular carcinomas[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，273(1):54-61.。