2001一种促使乳酸芽孢杆菌大量生成芽孢的方法王天云

将培养基 Ò 灭菌后接种培养, 在菌体生长的不 长, 这是因为稳定期和衰亡期培养基中营养成分已
同时期取样, 样品放入 4 e 冰箱中, 同时分别加入木 被耗尽的缘故。从芽孢形成百分率来看, 对数期芽
屑, 继续进行培养, 然后观察芽孢的形成情况。微生 孢形成率最高, 可达 90% 以上, 在静止期则较少, 这
图 6 强化碳源和氮源的培养基添加固态介质后 Bacill us WT F Y1001 菌芽孢的形成情况
2. 3. 6 菌体不同时期添加固 态介质后对 Bacil lus 入固态介质后, 都可以形成芽孢, 稳定期和衰亡期芽
WT F Y1001 菌芽孢形成的影响
孢形成时间短, 静止期和对数期芽孢形成时间则较
为验证木屑对芽孢形成的作用, 我们又选择了 两种培养基, 一种为培养基 Ò , 另一种为天然培养基 ) 豆汁进行 试验。仍 以 21mm @ 150mm 试 管盛有 5mL 培养液添加 1g 木屑为标准。发现培养基 Ò 添
图 2 培养基 Ò 中添加木屑芽孢形成情况
第3期
王的方法
图 1 培养基 Ñ 中添加木屑对 Bacill us WT FY1001 菌芽孢形成的影响
从图 1 中可以看出, 添加木屑后, 芽孢形成时间 明显 缩短, 24h 就有芽孢 形成, 芽 孢形成率 明显提 高, 60h 后芽孢高达 90% 以上, 远远高于对照试管中 芽孢形成率。镜检结果表明, 添加木屑的试管中芽 孢形成时菌体 并不呈现生长后期和末 期的一些特 点, 如菌体细短、形态不规则等, 菌体仍然较粗, 棒杆 状, 并且芽孢明显膨大。 2. 3. 2 培 养基 Ò 和豆 汁中添 加木屑 对 Bacill us WT FY1001 菌芽孢形成的影响
著。培养基 I 中葡萄糖的浓度超过 0. 1% 时, 便无 芽孢的形成。为了进一步确定固态介质对芽孢形成 的作用, 又进行了以下的实验: 改变培养基 I 中的葡 萄糖的浓 度分 别为: 0. 2% 、0. 4% 、0. 6% 、0. 8% 、 1. 0% ; 以 0. 1% 葡萄糖为碳源, 改变蛋白胨的浓度 分别为: 0. 2% 、0. 4% 、0. 6% 、0. 8% , 然后加入木屑, 接种后培养, 定时取样染 色观察芽孢的形 成情况。 结果见图 6。从图 6 可以看出, 添加木屑后, 葡萄糖 浓度为 0. 2% 、0. 4% 、0. 6% 、0. 8% 原来不能形成芽 孢的可以形成芽孢了, 但葡萄糖浓度为 0. 8% 浓度 时芽孢较 少, 葡 萄糖浓度 为 1. 0% 便 无芽孢 形成。 另外, 凡添加氮源的培养基都可以形成芽孢。这进 一步证明了实验 2. 3. 1 的结果。
早期的菌体呈短链, 二链或三链, 中期为长链, 且菌 体长而粗, 后期菌体短, 多以单链存在。该菌的芽孢 椭圆, 端生, 芽孢膨大。 2. 2 培养基成分对 Bacil lus WTFY1001 菌芽孢形成 的影响
我们曾用过十几种生芽孢培养基来培养 Bacill us WT FY1001, 结果只有培养基 I 可以生成芽孢, 因此我们就以培养基 I 为基础考查了培养基成分对 芽孢形成的影响。我们首先考查了碳源对芽孢形成 的影响, 分别 以 0. 1% 的葡萄糖、乳 糖、蔗糖、淀粉、 棉子糖、半乳糖和纤维素作为碳源。接种后静置培 养, 不同时间取样作芽孢染色镜检。结果发现以淀 粉为碳源时芽孢形成最早, 纤维素为碳源形成芽孢 最多, 乳糖为碳源形成芽孢最晚、最少, 葡萄糖为碳 源形成芽孢较少。当改变培养基 I 中的葡萄糖浓度 分别为: 0. 05% 、0. 1% 、0. 2% 、0. 5% 和 1. 0% , 结果 只有 0. 05% 和 0. 1% 两种葡萄糖浓度下可以形成芽 孢, 葡萄糖浓度高于 0. 1% 便无芽孢形成。研究还 发现以蛋白胨 硫酸铵作氮源时, 氮源浓度对芽孢 的形成无明显影响, 只是随着浓度的增加, 芽孢出现 的时间被提前。培养基中有磷酸氢二钾存在时, 试 验结果表明磷酸盐有利于菌体生长, 且芽孢形成的 数量也多。另一试验结果表明, 镁离子有促进芽孢 形成的作用。
要为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等。由于双歧杆菌、嗜酸
乳杆菌等是一些较难长期保存的革兰氏阳性、无芽 孢、不运动的厌氧菌, 加之代谢过程中还会产生乳酸 和乙酸等危及其本身存活的有害物质, 因此不仅在 液态 中, 即 使 在冷 冻 干 粉 中 它 们 的 存 活 率 也 不 高[ 2] 。用生乳酸芽孢杆菌作益生素, 既可防止菌数 衰降的问题, 保持高数量的活菌数, 又能发挥乳酸菌 特有的生理保健机 能。国外用 生乳酸芽孢杆 菌做 人、畜用的微生态制剂已有商品生产[ 3] , 国内尚无。 要使生乳酸芽孢杆菌发挥其优点, 我们认为关键要 有两点: 一是高密度的菌体细胞; 二是较高的芽孢生 成率。芽孢的形成一般认为是在生长后期, 由于外 源营养物质缺乏引起的, 营养丰富的培养基往往很 难长出芽孢。如何使乳酸芽孢杆菌既能在营养物质
丰富的培养基生长, 以获得较高的活菌数目, 同时又 能有较高的芽孢生成率, 这是研究工作的一个难点 所在。我们通过反复大量的实验, 提出了一种添加 固态介质促使乳酸芽孢杆菌大量产生芽孢的方法, 实验证明, 这种方法简便、有效、芽孢生成率较高。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种
乳酸芽孢杆菌( Bacill us ) WT FY1001, 本实验 室保存。 1. 1. 2 培养基
培养基 I[ 3] : 酵母膏, 0. 07% ; 蛋白胨, 0. 1% ; 葡 萄糖, 0. 1% ; ( N H4 ) 2SO 4, 0. 02% ; MgSO4 #7H2O, 0. 02% ; K2HPO 4, 0. 1% ; pH 7. 2。
培养基 Ò [ 4] : 酵母膏, 0. 5% ; 蛋白胨, 0. 5% ; 葡萄 糖, 0. 5% ; K 2H PO4, 0. 4% ; 硫 酸 锰 溶 液, 0. 08% ; pH7. 0。
加木屑有大量的芽孢形成, 未添加的对照试管中未 发现有芽孢出现, 结果如图 2 所示。在豆汁中添加 木屑芽孢数目极多, 未添加的对照试管中虽有芽孢 形成, 但数目极少, 远远低于添加木屑的情况, 见图 3。这一试验结果进一步说明了木屑可以促进芽孢 的形成。
第 31 卷
图 3 豆汁中有无添加木屑时芽孢形成情况 2. 3. 3 不同固态介质对 Baci ll us WT FY1001 菌芽 孢形成的影响
从以上一系列单因子的实验结果可以看出, 培 养基成分对芽孢的形成有重要影响, 其中碳源是影 响芽孢形成的决定因素, 其它成分亦有一定的影响。 我们知道, 无论是在以获得有用代谢产物的发酵产 业上, 或是在微生态制剂业中, 高密度的微生物菌体 细胞都是必须的。我们曾对用上述培养基培养的菌 体密度进行过测试, 结果表明菌体密度只能维持在 107cfu/ m L 或以下水平, 远远不能满足生产的需要。 另外, 芽孢形成时间迟, 一般均在 48h 后才能出现, 并且芽孢形成率较低, 最高只能达到 50% 左右。如 何能使 Bacil lus . WT FY1001 菌在高营养培养基中
) 14 )
生长并有较高的芽孢形成率, 为此, 我们进行了以下 实验。 2. 3 固态介质对芽孢形成的影响 2. 3. 1 培养基中添加木屑对芽孢形成的影响
在培养基 I 中, 我们添加木屑 作为介质, 在盛 有 5mL 培养基的 21 @ 150mm 试管中添加 1g 木屑 ( 刚能看出液面) , 对照试管中分别加入 1mL 无菌水 ( 质量对照) 和 3mL 无菌水( 体积对照) 。接种培养, 定时取样芽孢染色观察。结果见图 1。
) 15 )
第3期
工业微生物
第 31 卷
图 5 培养基中固态介质添加量 对芽孢形成的影响
2. 3. 5 在强化碳源和氮源的培养基中添加固态介 质后 Bacill us WT FY1001 菌芽孢的形成情况
由 2. 2 的试验结果得知, 碳源浓度是影响芽孢 形成的关键因素, 氮源的浓度对芽孢影响并不太显
木屑洗净, 烘干, 过 16 目筛。 新鲜玉米芯剪碎后, 煮沸 5min, 过滤, 如此重 复三次, 然后将洗净的玉米芯粉碎, 过 16 目筛。 灭菌用的纱布洗净后, 烘干, 剪碎。
作者简介: 王天云( 1968~ ) , 硕士。 通讯联系人: 王福源
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第3期
工业微生物
第 31 卷
1. 2. 3 测定方法
乳酸菌是一类能发酵糖类( 主要为葡萄糖、乳糖 等) 产生乳酸的细菌[ 1] , 是正常 人肠道中极为 重要 的生理菌群之一。具有维持人 体微生态平衡 的作
用, 与机体健康息息相关。近年来, 随着微生态学研 究的不断深入和人们保健意识的增强, 使乳酸菌作 为一种有益菌得到广泛的研究与开发。目前已广泛 应用在保健品、医药、食品等行业中。所用的菌种主
1. 2. 3. 1 721 分光 光 度计 测定 发酵 液 O. D 值
( 610nm) 1. 2. 3. 2 1. 2. 3. 3
芽孢染色法观察芽孢[ 5] 活菌计数参考文献[ 5]
2 实验结果
2. 1 Bacill us WTFY1001 菌体形态特征 个体形态为杆状, 革兰氏染色阳性, 液体培养
图 4 不同培养基加玉米芯和布屑时 芽孢形成情况
2. 3. 4 固态介质添加量对 Bacil lus WT FY1001菌 芽孢形成的影响
在培养基 I 和培养基 Ò 以及豆汁培养基中, 分 别添加不同量的固态介质, 添加量分别为: 5mL 培 养液加 0. 2g、0. 5g 、0. 7 g、1g 木屑, 见图 5。从图 5 可以看出, 培养基中添加介质量的不同对芽孢形成 有直接影响。添加的量越多, 芽孢形成越早、形成的 百分率越高。这进一步说明固态介质对芽孢形成确 有一定的作用。
豆汁培养基: 将大豆室温( 20 e 左右) 浸泡 48h, 充分溶胀后, 磨浆, ( 水: 豆= 3: 1) , 两层纱布过滤除 去豆渣即得。 1. 1. 3 固态介质: 木屑; 玉米芯; 碎纱布条。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 液态培养
250m L 三角烧 瓶装培 养液 100mL , 接种 量为 10% , 45 e 恒温静止培养 1. 2. 2 固态介质的制备
第 31 卷 第 3 期 2001 年 9 月
工 业微 生 物
Industrial M icrobiology
V ol. 31 N o. 3 S ept. 2001
一种促使乳酸芽孢杆菌大量生成芽孢的方法
王天云1, 陈振风2, 王福源2
( 1. 新乡医学院细胞生物学教研室, 河南 新乡 453003; 2. 上海大学生命科学学院生物工程系, 上海 200436)
摘 要 报道了一种促使乳酸芽孢杆菌大量生成芽孢的方法, 其要点是在培养菌体后往培养基 中添加适量的固态介质。实验结果证明这种方法具有: ¹ 芽孢易形成, 并可在一些不能形成芽孢的 培养基添加固态介质后形成芽孢。在所用的几种乳酸菌培养基中, 这种添加方法均适用。 º芽孢 形成率高, 可达 95% 以上。 »芽孢形成时间短, 添加后一般静置培养 48h 芽孢就可以形成。 关键词: 乳酸芽孢杆菌; 芽孢形成; 固态介质
物生长周期的测定采用比色法和计数法。菌体生长 可能是因为生长旺盛的细胞对环境的刺激更敏感的
曲线见图 7。从 图 7 可看出, Bacill us WT FY1001 缘故。
菌在 24h 就进入稳定期, 36h 进入衰亡期。我们分
别在培养的 4h、20h、30h 和 42h 加入木屑, 芽孢形成
为排除木屑中一些不确定因素的影响, 我们又 使用了另外两种固 态介质进行实 验。一种为 玉米 芯, 另一种为碎 布屑。添加标准为: 5mL 培养 液加 1. 2g 玉米芯, 或 1. 0g 碎布屑, 都刚能看出液面, 见 图 4。图 4 表明, 碎布屑和玉米芯都一样能 促进芽 孢的形成, 二者相比, 碎布屑效果较好, 其原因可能 与其本身的结构有关。