琼脂扩散试验结果影响因素的分析_何元龙

家禽科学２００６．１０
琼脂扩散试验通常是指双向双扩散试验，试验原理是通过抗原、抗体在琼脂凝胶中由近及远不断自由扩散形成浓度梯度，在适当比例处相遇形成沉淀线，并由此来检测抗体的效价或抗原鉴定和区分的一种技术。

琼脂扩散试验在临床中常被用于多种疾病诊断和抗体效价检测，如传染性法氏囊病、新城疫、禽流感、传染性支气管炎、马立克氏病、鸭病毒性肝炎等。

由于琼脂扩散试验操作简单、所用的仪器少、结果易判断，因此被越来越多的科研工作者所采用，成为临床中疾病诊断、抗体检测应用最广的实验方法之一。

但是琼脂扩散试验容易受到多种因素的干扰而导致试验特异性、敏感性、精确性等受到影响，甚至试验结果无法判读的现象。

本文就琼脂扩散试验的影响因素（如抗原、抗体、琼脂板、反应条件等）以及各因素实验结果的影响进行逐一分析，望能给临床工作者提供帮助。

１抗原、抗体因素
１．１抗原、抗体的水溶解性琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原与抗体在琼脂凝胶网格中的水中自由扩散，相互结合形成的沉淀线来判断结果的。

该试验要求抗原与抗体必须是水溶性的，所以一些颗粒性的抗原如细菌、红细胞等是不溶的，这样的抗原相对应的抗体效价就不能用琼脂扩散试验来测定。

临床中常用的可溶性抗原主要包括：细菌毒素、培养滤液、病毒可溶性抗原、血清、细胞及组织培养或浸出液等。

而抗体在非等电点ｐＨ值都是水溶性的，所以试验中调节好琼脂板的ｐＨ值就不会影响抗体的水溶性。

抗原抗体的水溶性是琼脂扩散实验的首要条件。

１．２抗原的决定簇数量及分子量琼脂扩散实验是以抗原决定簇与其对应的抗体相结合形成抗原抗体复合物为基础。

当一个多价抗原与其多克隆抗体混合时，在复合物形成期间，一个抗体不只和一个抗原分子结合，形成一个环形或点阵状结构，一个抗原被多个抗体所制约，导致抗原抗体复合物解离率非常低，这类反应就形成了稳定而大的复合物。

由此可见琼脂扩散试验中的抗原必须是多价的（抗原决定簇≥２），单价抗原不能形成大而稳定的免疫复合物。

抗原具有的决定簇越多时，与多克隆抗体越易形成大的免疫复合物，试验的敏感性和结果可判性越高，但是特异性必然受到影响。

抗原分子量大小也影响着琼脂扩散试验结果。

抗原分子量大时，被抗体结合连接后较易形成大而稳定的免疫复合物，反之，小分子量的抗原需要大量结合后才能形成可见的沉淀线，所以分子量较大的抗原在琼脂扩散实验中敏感性也相对较高，但是分子量太大也必然会影响到分子扩散速率或溶解性等因素。

１．３抗体的单一性在琼脂扩散试验中，每个抗体分子与其相应决定簇的结合具有高度的特异性，但是不同的抗原可能拥有相同的抗原决定簇，这就导致交叉反应的发生；另外，抗体分子有时会和结构上相似的抗原决定簇相结合，发生非特异性反应。

琼脂扩散试验结果影响因素的分析
何元龙，吴静
（山东省农业科学院家禽研究所，济南２５００２３）
摘要：琼脂扩散试验是临床中病原诊断和抗体效价测定的主要方法之一，该方法简洁、快速，在临床中应用广泛。

但是该试验容易受到多种因素的影响而导致试验特异性、敏感性、精确性以及结果判断的不准确。

本文就抗原、抗体性质、琼脂板以及反应条件等影响因素对琼脂扩散试验的影响进行了逐一分析。

关键词：琼脂扩散试验；影响因素
中图分类号：Ｓ８５４．４３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－１０８５（２００６）１０－００４０－０３
收稿日期：２００６－０９－２０
ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
交叉反应和非特异性反应降低了琼脂扩散实验结果的特异性，但是这种影响是血清学反应中所固有的。

使用多克隆抗体进行琼脂扩散实验时交叉反应和非特异性反应的发生几率更高，采用单克隆抗体可以有效降低交叉反应和非特异性反应的发生几率，提高琼脂扩散实验反应的特异性，同时也可以提高试验的敏感性。

１．４抗原、抗体浓度和纯度琼脂扩散试验中所形成的沉淀线的粗细、清晰度与抗原抗体的量成正比。

抗原、抗体浓度较高时，试验的敏感性提高，容易形成清晰可见的沉淀线。

但是在进行抗原或抗体定量检测时，浓度过高就有可能导致连线或无法判断结果。

抗原与其对应的抗体的反应属于特异性反应。

但是如果两者纯度较低，含有过多与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质，往往抑制抗原抗体的特异性、敏感性。

１．５抗原、抗体的反应比例在琼脂扩散实验中，过多的抗原或抗体都可能降低实验敏感性。

抗原抗体的反应决定于两者的化学构型的相应性，但不同于一般的化学反应，其结合比例不完全符合化学反应的质量作用定律，因为抗原抗体的结合是一种多价相互作用的结合。

抗原根据分子大小的不同，结合位点变化很大，当抗原抗体的反应比例适宜时，抗原抗体结合后尚未达到饱和的位点可与其它游离的抗原抗体继续结合，逐渐形成越来越大的复合物，最后在抗原与抗体孔之间形成肉眼可见的沉淀线。

此时反应最快、最明显。

但当两者的反应比例不适合时，少的一方在聚合初期就达到饱和，沉淀线变得不清晰甚至没有沉淀线，而且沉淀线偏移，向量少的一方移动。

抗原抗体的反应比例应根据具体的抗原、抗体反应特性来决定，拥有不同数量决定簇的抗原与多克隆抗体、单克隆抗体的反应比例都不相同。

１．６抗原抗体反应的可逆性抗原抗体之间的结合是依靠分子间的氢键、范德华力、静电力、疏水作用等力。

两者的距离越近，结合的位点越多，形成的近距离力也越大，结合的也越牢固。

这些作用力在生理状态下最大。

由于抗原抗体反应是分子表面的非分子结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离的抗原抗体保持原来的生物活性，可与其它的抗原抗体再一次结合，在整个反应体系处于一个动态平衡状态。

这种平衡易受到温度、ｐＨ等物理的、化学的因素的影响而改变。

当温度大于６０℃，ｐＨ值降到３以下时，由于同离子效应等因素，使抗原抗体蛋白质的近距离力遭到破坏，结构发生改变，导致抗原抗体复合物重新解离，实验敏感性、结果判断都将受到影响。

２琼脂板因素
琼脂扩散试验结果在很大程度上也受到琼脂板的因素影响，如琼脂的浓度、粘度、ｐＨ值、电介质、孔间距以及琼脂板厚度等。

２．１琼脂的浓度、粘度在琼脂扩散实验中琼脂主要作为一种空间支持结构，它溶于水冷却凝固后内部形成多孔的网状结构，可允许大分子物质自由通过，而孔径的大小与琼脂浓度成反比。

实验中常用的琼脂浓度为０．８％～１．０％，１．０％琼脂凝胶孔径为８５ｎｍ，大多数抗原、抗体都可以在琼脂中自由扩散。

所以，实验中如果琼脂浓度增大容易阻滞抗原、抗体的扩散，降低实验敏感性。

琼脂的浓度应该根据具体实验的要求进行确定，如禽流感病毒适合的琼脂浓度为０．６％而不是１．０％。

琼脂质量和加热溶解过程水分蒸发是导致琼脂浓度变化的主要原因，实验中应予以注意。

另外，琼脂的粘度也是影响实验结果的因素之一。

琼脂粘度过大，抗原抗体扩散速率减慢，降低实验敏感性。

２．２ｐＨ值琼脂的ｐＨ值是影响琼脂扩散实验结果的重要因素。

琼脂扩散实验中的抗原抗体大部分是蛋白质，蛋白质在一定的ｐＨ处所带的净电荷数为零，蛋白质分子之间静电斥力减少，趋于凝集状态而发生沉淀，此时的ｐＨ值为蛋白质的等电点，大部分蛋白质的等电点在ｐＨ５～５．５之间，蛋白质在等电点处的溶解度最低。

抗原抗体反应最适ｐＨ一般为６～８，但是当琼脂的ｐＨ在抗原或抗体等电点处时，抗原或抗体会发生非特异性的沉淀，降低实验的特异性、敏感性和精确性，甚至直接导致实验失败。

２．３电介质电介质的存在可以降低免疫复合物表面的阴电荷，促使其沉淀，所以适当浓度的电介质对免疫复合物沉淀线形成有促进作用。

但是过高浓度的电解质反又不利于抗原抗体沉淀物的形成。

原因之一，过高浓度的电解质阻止蛋白质与水分子的相互作用，破坏蛋白质表面的水化层，产生盐析效应，使抗原抗体发生非特异性的沉淀；其二，抗体复合物形成是一个动态过程，过高浓度的电解质可使
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抗原抗体结合物离解。

过高浓度的电介质能降低实验的特异性、精确性。

临床中最常用的电解质为氯化钠、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液、巴比妥ＰＢＳ等。

２．４孔间距离抗原抗体的孔间距离也能影响琼脂扩散试验的结果。

当两者之间的孔距为３～５ｍｍ时，抗原抗体既能形成合适的浓度梯度又能充分结合。

当两者的孔间距离过大时，虽然能形成合适的浓度梯度，但由于抗原抗体量太少却不能充分结合，敏感性降低；相反孔距太小，实验敏感性提高，却不能形成合适的浓度梯度。

２．５琼脂板的厚度琼脂扩散试验使用的琼脂板的厚度应为２～３ｍｍ左右。

如果琼脂板太厚，一方面可能导致抗原抗体复合物聚合量较少，形成的沉淀线不清晰，降低实验的敏感性。

同时琼脂板太厚又可导致抗原或抗体扩散的不均匀性几率增大，可能出现琼脂底部与表面产生的沉淀线不在一个平面上，沉淀线发生扭曲，影响结果判断。

相反，琼脂板太薄也会影响到实验的结果。

２．６其它琼脂的质量、实验用水的质量以及琼脂的溶解、防腐等都能影响实验的结果。

琼脂中的不溶性杂质和矿物质等是影响琼脂扩散试验结果主要因素。

不溶性杂质能直接堵塞琼脂的网格，这样的杂质过多会影响抗原抗体的扩散，为了避免这些杂质的影响，应在琼脂粉融化后进行适当的过滤，或者选择高质量的琼脂糖制作琼脂板。

琼脂中的矿物质、金属盐离子等可能导致抗体、抗原变性或被破坏，影响实验结果精确性。

琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到实验用水的影响。

如果实验用水中含大量重金属离子如铅、汞、铜等，会使蛋白质成份的抗原或抗体变性失去活性，不能再发生特异性反应，降低实验结果的精确性。

在琼脂板的制作过程中，琼脂是否完全溶解也决定着实验的成败。

琼脂溶解不完全将会严重影响抗原、抗体的扩散，甚至直接导致实验失败。

如用琼脂扩散法检测传染性法氏囊抗体效价时就常发生８％食盐溶液溶解琼脂不完全的情况，但是用纯化水溶解琼脂后再加入食盐可以有效解决该问题。

另外，琼脂板的防腐和存放过程水分的蒸发都能影响实验的结果，在实验中也应予以考虑。

３抗原抗体反应条件
抗原抗体反应条件如反应温度、湿度、时间也能影响琼脂扩散试验的结果。

３．１反应温度
３．１．１反应温度的高低抗原抗体的反应速度、结合程度与反应温度高低有密切关系。

温度高，分子运动加快，增加抗原抗体碰撞几率，反应会加快，但当温度超过５６℃时反应速度反而变慢，温度再高，抗原抗体复合物往往会重新解离，甚至会被破坏。

例如抗体在≥６５℃情况下性质就会变得不稳定，鸡马立克氏病毒从感染鸡皮肤中制备的脱离细胞制剂在５６℃处理３０ｍｉｎ或在６０℃处理１０ｍｉｎ都能失活，传染性法氏囊炎病毒在７０℃处理３０ｍｉｎ失活。

反应温度低时，反应速度变慢，但抗原抗体结合完全，沉淀量增多，结果清晰，但温度过低也会导致实验失败。

琼脂扩散实验最适的反应温度为３７℃。

３．１．２反应温度的波动情况琼脂扩散试验的培育温度应恒定，如果波动太大，会使抗原抗体在扩散时形成不连续的浓度梯度，影响两者产生最适比，最终影响到实验结果。

３．２空气湿度琼脂扩散试验是抗原抗体在琼脂网格的水中扩散时形成的结果，如果空气中湿度太低，琼脂中的水分很容易蒸发，使琼脂网格中的水分减少，琼脂孔径变小，不利于抗原抗体的自由扩散，降低实验敏感度和精确度。

所以在进行琼脂扩散实验时，往往倒置平皿，然后放在一个有湿棉纱布的有盖搪瓷盘中，以防水分蒸发。

湿度过大可能使琼脂表面形成水滴，导致抗原、抗体发生混合，也会影响实验结果的判断。

３．３反应时间抗原抗体在琼脂中的扩散需要一定时间。

如果反应时间太短，抗原抗体扩散和反应不完全，不能形成清晰的沉淀线；时间太长，抗原抗体会失去生物活性，导致已经形成的沉淀线发生解离消失。

４其它因素
抗原、抗体加量的多少、打孔后琼脂底部融封效果等都能影响琼脂扩散试验的结果。

总之，多种因素都可以影响到琼脂扩散试验的特异性、敏感性、精确性，甚至导致结果无法判断。

这也就要求科研工作者在实验中应严格按照要求进行操作，并积极总结经验，在实践中摸索掌握琼脂扩散实验的要点。

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